Name: 用DMSO对人多能干细胞的暂时性治疗促进分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解使用DMSO暂时性处理人多能干细胞以促进分化的方法。该技术通过1-2%DMSO预处理24小时，显著提高hPSCs向多种谱系分化的效率，适用于细胞替代疗法和疾病模型研究。

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本工作获得了斯坦福大学医学院资助以及授予 S. C. 的西贝尔奖学金的支持。

1. 干细胞维持
注意：以下所述的细胞维持方案适用于以贴壁单层形式培养的多能干细胞（PSCs）。DMSO处理前使用的培养基、其他试剂和细胞培养板可根据需要进行调整。本论文中所有后续方案的操作均应在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用适用于多能干细胞的基质或包被物对无菌的6孔组织培养板进行包被，并在CO2培养箱（5% CO2，湿润环境）中孵育至少1小时。包被后的培养板可用封口膜密封，于4 °C保存最多一周。</li>
	<li>将冻存的PSCs在37 °C水浴中解冻。在移入生物安全柜前，用乙醇对冻存管进行消毒，然后立即用移液器将细胞转移至含有5–10倍体积预热干细胞培养基的无菌锥形管中。</li>
	<li>在室温（RT）下以300 x g离心5分钟。</li>
	<li>吸除培养基，用1 mL添加了10 µM ROCK抑制剂（如Y-27632）的干细胞培养基轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>从培养板中吸除包被基质，按所需密度接种细胞，通常每孔接种0.5–1 x 106个细胞，每孔至少加入2 mL干细胞培养基。 
	注意：不同细胞系和克隆的接种密度可能有所不同，应相应优化。</li>
	<li>每天更换预热的干细胞培养基以维持细胞生长。当细胞融合度达到约70%–80%，或细胞集落开始相互接触时进行传代。</li>
	<li>传代时，吸除培养基，用无菌PBS洗涤细胞一次。每孔加入1 mL消化酶溶液，在37 °C孵育5–10分钟。</li>
	<li>用预热的干细胞培养基洗涤并重悬细胞，转移至无菌锥形管中，加入5–10倍体积的干细胞培养基。按照步骤1.3–1.7操作进行细胞接种。</li>
</ol>
2. DMSO 预处理
注意：在诱导分化前对细胞进行DMSO预处理铺板时，应根据干细胞系的典型生长速率以及所用的分化方案优化初始铺板细胞密度。必要时，使用常规标志物验证多能性。细胞在初次解冻后、诱导分化前应至少传代1至2次。
<ol>
	<li>二维培养分化
	<ol>
		<li>当细胞达到适当的汇合度时，准备包被培养板，消化细胞，并按上述方法制备单细胞悬液。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪（含台盼蓝或其他活力标记物）对活细胞进行计数。</li>
		<li>将细胞接种至包被的6孔板中，密度为0.5–1 × 106 每孔细胞置于含10 µM ROCK抑制剂的干细胞培养基中。 
		注意： 在本实验室测试的细胞系中，这些密度通常在24小时DMSO预处理后达到80%–90%的细胞汇合度。</li>
		<li>让细胞在37 °C的CO₂培养箱中孵育24小时2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。</li>
		<li>在预热的干细胞培养基中配制1%-2%的DMSO溶液（例如，10 mL培养基中加入100 µL DMSO = 1% DMSO溶液，或10 mL培养基中加入200 µL DMSO = 2% DMSO溶液）。</li>
		<li>孵育24小时后，吸除细胞培养液，并替换为DMSO溶液。</li>
		<li>将细胞置于37 °C的CO₂培养箱中孵育24至48小时2 培养箱（5% CO₂）2，分化前置于湿润环境中。 
		注意： 通常，大多数人类胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）系经过24小时DMSO处理即已足够。对于生长速率较慢（倍增时间较长）的细胞系，可采用48小时DMSO孵育以获得更佳效果。若进行48小时DMSO孵育，可在前24小时处理结束后，更换为含1%-2% DMSO的新鲜干细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维培养分化
	<ol>
		<li>当细胞达到适当的汇合度时，按照上述方法将细胞解离并收集到细胞悬液中。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪（含活力标记物）对活细胞进行计数。</li>
		<li>将细胞接种于未包被的低吸附6孔板中，密度为0.5–1 × 106 每孔细胞数为干细胞培养基中加入10 µM ROCK抑制剂。 
		注意： 在我们实验室测试的细胞系中，这些密度通常在接种细胞后24小时内形成3D hPSC细胞球。</li>
		<li>让细胞在37 °C的CO₂培养箱中孵育24小时2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。</li>
		<li>在预热的干细胞培养基中配制1%-2%的DMSO溶液（例如，10 mL培养基中加入100 µL DMSO = 1% DMSO溶液，或10 mL培养基中加入200 µL DMSO = 2% DMSO溶液）。</li>
		<li>按照标准操作更换培养基（例如，将培养板倾斜30°–45°角，使细胞球沉降至孔底；将细胞转移至无菌锥形管中，静置使细胞球沉降至管底；或使用5 mL或10 mL移液器轻柔吸取悬浮细胞至无菌锥形管中，于300 x g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>吸弃细胞中的培养基，加入DMSO溶液，轻轻吹打混匀。</li>
		<li>将细胞置于37 °C的CO₂培养箱中孵育24 h至48 h2 培养箱（5% CO₂）2，分化前置于湿润环境中。 
		注意： 通常，大多数人类胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）系经过24小时DMSO处理即可。对于生长速率较慢（倍增时间较长）的细胞系，可采用48小时DMSO孵育以获得更好效果。若进行48小时DMSO孵育，可在首次处理24小时后更换为含1%-2% DMSO的新鲜干细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分化为初级胚层
注意： 以下描述的方法此前已在本实验室中被证实对在6孔板上以单层培养的PSCs有效。在DMSO处理后，应采用任何选定的分化方案，以促进细胞向目标谱系分化。DMSO处理24-48小时后，移除DMSO溶液，并按照标准方案继续进行分化。
<ol>
	<li>内胚层分化（改编自 Kroon 等人30）
	<ol>
		<li>按照上述方法对二维培养物进行 DMSO 预处理。</li>
		<li>配制 Wnt3a 和 Activin A 储存液。</li>
		<li>通过将 Wnt3a 加入预热的 RPMI 培养基中至终浓度为 20 ng/mL，并将 Activin A 加入至终浓度为 100 ng/mL，配制第 1 天内胚层分化培养基。</li>
		<li>DMSO 预处理后，吸除细胞培养基，并更换为第 1 天培养基（例如，每孔 6 孔板加入 2 mL）。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 24 小时（5% CO2，湿润环境）。</li>
		<li>通过将 Activin A 加入适量预热的 RPMI 培养基中至终浓度为 100 ng/mL，配制第 2 天和第 3 天的内胚层分化培养基。</li>
		<li>吸除细胞培养基，并更换为第 2 天培养基（例如，每孔 6 孔板加入 2 mL）。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 24 小时（5% CO2，湿润环境）。</li>
		<li>吸除细胞培养基，并更换为第 3 天培养基（例如，每孔 6 孔板加入 2 mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中胚层分化（改编自 Zhang 等人31）
	<ol>
		<li>按照上述方法对二维培养物进行 DMSO 预处理。</li>
		<li>配制 Wnt3a 和 Activin A 储存液。</li>
		<li>通过将 Wnt3a 加入适量预热的高级 RPMI 培养基中至终浓度为 20 ng/mL，并将 Activin A 加入至终浓度为 100 ng/mL，配制中胚层分化培养基。</li>
		<li>DMSO 预处理后，吸除细胞培养基，并更换为分化培养基（例如，每孔 6 孔板加入 2 mL）。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 24 小时（5% CO2，湿润环境）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外胚层分化（改编自 Chambers 等人32）
	<ol>
		<li>按照上述方法对二维培养物进行 DMSO 预处理。</li>
		<li>配制 Noggin 和 SB431542 储存液。</li>
		<li>通过将 Knockout 血清替代物（KOSR）以 10% 的终浓度溶解于 Knockout DMEM 中，配制外胚层分化基础培养基。 
		注意：请配制足够用于 3–4 天换液的基础培养基。</li>
		<li>通过将 Noggin 加入适量预热的 KOSR/Knockout DMEM 培养基中至终浓度为 500 ng/mL，并将 SB431542 加入至终浓度为 10 µM，配制外胚层分化培养基。</li>
		<li>DMSO 预处理后，吸除细胞培养基，并更换为分化培养基（例如，每孔 6 孔板加入 2 mL）。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 3–4 天（5% CO2，湿润环境），每天更换含有新鲜分化因子的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分化为祖细胞类型
以下描述的方法此前已在本实验室证实对二维或三维培养的PSCs有效。在DMSO处理后，应采用任何选定的分化方案以促进向目标谱系分化。DMSO处理24-48小时后移除DMSO溶液，并按照标准方案继续进行分化。
<ol>
	<li>神经前体细胞分化（改编自 Tchieu 等人33）
	<ol>
		<li>按照制造商说明，在 CO2 培养箱（5% CO2，湿润环境）中，使用适用于多能干细胞的低生长因子基质或基底对 6 孔板进行包被，孵育至少 1 小时。包被后的培养板可用薄膜包裹后于 4 °C 保存最多 1 周。</li>
		<li>将 PSCs 以每孔 0.5–1 × 106 个细胞的密度接种于含 ROCK 抑制剂的干细胞培养基中，接种方法如前所述。</li>
		<li>使用 DMSO 对细胞进行预处理，处理方法如前所述，适用于二维培养。</li>
		<li>配制小分子抑制剂 LDN193189、SB431542 和 XAV939 的储备液。</li>
		<li>通过向 Essential 6 培养基中添加 500 nM LDN193189、10 µM SB431542 和 2 µM XAV939，配制第 1–3 天神经外胚层分化培养基。</li>
		<li>DMSO 预处理后，吸除培养基，更换为第 1–3 天神经外胚层培养基（例如，6 孔板每孔 2 mL）。每日更换培养基。</li>
		<li>通过向 Essential 6 培养基中添加 500 nM LDN193189 和 10 µM SB431542，配制第 4–12 天神经外胚层分化培养基。</li>
		<li>在分化第 4 天，吸除培养基，更换为第 4–12 天神经外胚层培养基。每日更换培养基。</li>
		<li>经过 12 天分化后，分化所得细胞应表达神经前体细胞（NPCs）的适当标志物。NPCs 可进一步在含 DMEM/F-12、2% B-27、1% N-2 并补充 10 µg/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的神经培养基中维持培养。当细胞达到汇合时，使用细胞解离溶液传代，以每孔 0.5–1 × 106 个细胞的密度重新接种 NPCs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>少突胶质前体细胞分化（改编自 Douvaras 和 Fossati34）
	<ol>
		<li>将 PSCs 以每孔 1 × 105 个细胞的密度接种于包被的 6 孔板中，使用含 ROCK 抑制剂的干细胞培养基，接种方法如前所述。</li>
		<li>使用 DMSO 对细胞进行预处理，处理方法如前所述，适用于二维培养。</li>
		<li>配制 SB431542、LDN193189、全反式维甲酸（RA）和 smoothened 激动剂（SAG）的储备液。</li>
		<li>通过向 DMEM/F-12 中添加 10 μM SB431542、250 nM LDN193189 和 100 nM RA，配制第 0–8 天分化培养基。</li>
		<li>DMSO 预处理后，将细胞在分化培养基中孵育 8 天，每日更换培养基，并补充新鲜的分化因子（例如，6 孔板每孔 2 mL）。</li>
		<li>第 8 天，更换为含 1× MEM 非必需氨基酸（NEAA）溶液、1× L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、青霉素/链霉素以及 1× N-2 补充剂，并添加 100 nM RA 和 1 µM SAG 的 DMEM/F-12 培养基。每日更换培养基。</li>
		<li>经过 12 天分化后，分化所得细胞应表达少突胶质前体细胞（OPCs）的适当标志物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内分泌前体细胞分化（改编自 Pagliuca 等人35）
	<ol>
		<li>在 37 °C 培养箱、5% CO2、100% 湿度条件下，将 PSCs 以 6 × 105 个细胞/mL 的密度接种于含 10 µM ROCK 抑制剂的干细胞培养基中，置于 500 mL 摇瓶内，放置于 9 位搅拌台上，搅拌速度设定为 70 rpm。</li>
		<li>让细胞团沉降至瓶底，吸除培养基，然后使用 1%–2% DMSO 进行预处理。</li>
		<li>配制 Activin A、Chir99021、KGF、Sant1、全反式维甲酸（RA）、LDN193189、PdBU、XXI、Alk5i II、T3 和 Betacellulin 的储备液。</li>
		<li>根据表 3中的配方配制分化基础培养基。</li>
		<li>DMSO 预处理后，吸除培养基，更换为补充了 100 ng/mL Activin A 和 3 mM Chir99021 的 S1 培养基（例如，每瓶 500 mL）。孵育 24 小时。</li>
		<li>第 2 天，更换为补充了 100 ng/mL Activin A 的 S1 培养基。继续孵育 2 天。</li>
		<li>第 4 天，更换为补充了 50 ng/mL KGF 的 S2 培养基。孵育 3 天，并在前 2 天后（第 6 天）更换培养基。</li>
		<li>第 7 天，更换为补充了 50 ng/mL KGF、0.25 mM Sant1、2 mM RA 和 200 nM LDN193189 的 S3 培养基。孵育 24 小时。</li>
		<li>第 8 天，更换为补充了 50 ng/mL KGF、0.25 mM Sant1、2 mM RA、200 nM LDN193189 和 500 nM PdBU 的 S3 培养基。孵育 24 小时。</li>
		<li>第 9 天，更换为补充了 50 ng/mL KGF、0.25 mM Sant1 和 100 nM RA 的 S3 培养基。孵育 5 天，每 2 天更换一次培养基（第 11 天和第 13 天）。</li>
		<li>第 14 天和第 16 天，更换为补充了 0.25 mM Sant1、100 nM RA、1 mM XXI、10 mM Alk5i II、1 mM T3 和 20 ng/mL betacellulin 的 S5 培养基（共孵育 4 天）。</li>
		<li>第 18 天和第 20 天，更换为补充了 25 nM RA、1 mM XXI、10 mM Alk5i II、1 mM T3 和 20 ng/mL betacellulin 的 S5 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 分化作用的免疫细胞化学验证
注意：以下方法描述了一种通用的免疫细胞化学实验方案，可根据需要进行调整。所用的一抗均为本实验室先前已验证过的抗体。也可采用其他技术来验证细胞分化（如流式细胞术、定量PCR、RNA测序、蛋白质印迹、功能检测等）。
<ol>
	<li>细胞免疫标记
	<ol>
		<li>对于悬浮状态的三维培养，将完整的细胞簇或已分散为单细胞悬液的细胞簇接种至包被的培养板中，在固定前于37°C培养18–24小时。</li>
		<li>吸除贴壁细胞的培养基，并在摇床上用PBS于室温短暂洗涤一次。</li>
		<li>进行细胞固定时，吸除PBS，加入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，于室温摇床上孵育20分钟。 
		注意：由于PFA具有毒性，其储备液应在通风橱中配制。避免吸入，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>移除PFA溶液，并将其弃置到指定的化学废液容器中。</li>
		<li>在摇床上用PBS于室温洗涤细胞3次，每次至少5分钟。</li>
		<li>进行细胞通透和封闭处理时，在摇床上用含0.3% Triton X-100的PBS溶液配制5%驴血清，与细胞孵育1小时（室温）。</li>
		<li>将一抗溶液用上述相同的通透/封闭溶液配制。</li>
		<li>在4 °C摇床上避光孵育一抗溶液过夜。</li>
		<li>过夜孵育后，在摇床上用PBS于室温洗涤细胞3次，每次至少5分钟。</li>
		<li>将二抗溶液用通透/封闭溶液配制。</li>
		<li>在摇床上室温孵育二抗溶液1小时。</li>
		<li>吸除二抗溶液，并在摇床上用PBS于室温洗涤细胞3次，每次至少5分钟。</li>
		<li>加入DAPI或其他合适的核标记物，按推荐孵育时间染色，随后用PBS冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像定量分析
	<ol>
		<li>使用荧光显微镜和/或高内涵筛选平台，每种实验条件至少采集三张图像。</li>
		<li>通过无偏图像分析软件（例如ImageJ）或自动化筛选平台，统计每种标记物阳性细胞的比例：分别计数抗体染色阳性的细胞总数和总细胞数（基于DAPI/Hoechst的细胞核染色），并进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Slack, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+differentiating+into+neuroectoderm+undergo+apoptosis+in+the+absence+of+functional+retinoblastoma+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells differentiating into neuroectoderm undergo apoptosis in the absence of functional retinoblastoma family proteins.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 779-788 (1995).</li>
<li>Gu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+myogenic+factors+and+the+retinoblastoma+protein+mediates+muscle+cell+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction of myogenic factors and the retinoblastoma protein mediates muscle cell commitment and differentiation.</a> Cell. 72 (3), 309-324 (1993).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

综上所述，本方案介绍了一种简单且经济的工具，可增强多能干细胞（PSCs）向所有三个胚层、多种特化前体细胞，甚至功能性成熟细胞类型的分化能力，适用于体外和体内环境。文中展示了在本实验室及其他实验室已成功重复的具体分化方案，但任何选定的分化方案均可在DMSO处理后使用。如表1所示，多个实验室也已证明，在采用不同范式生成多种其他终末细胞类型的过程中，短暂的DMSO处理均可增强PSC的分化能力。此外，尽管本方法描述的是人PSCs的应用，DMSO预处理具有跨物种适用性，已在小鼠、兔和非人灵长类动物的PSCs中证实有效。
尽管高浓度DMSO已知具有细胞毒性，但本方法中使用的低浓度DMSO（1%-2%）作用时间短暂，仅导致极少的细胞死亡。虽然DMSO处理后立即观察到的总体细胞数量可能因DMSO促进细胞周期在G1期发生阻滞而减少，但先前的研究表明，在去除DMSO后，细胞能够达到与对照培养物相同的汇合度3。
DMSO预处理的浓度和持续时间应根据不同的细胞系进行优化。处理时间的设定需考虑细胞的增殖周期/倍增时间。例如，小鼠多能干细胞（PSCs）的增殖周期通常较短，约为15小时；因此，对这些细胞进行15小时的DMSO处理已足够。一些实验室还发现，在分化方案过程中持续使用DMSO或使用较低浓度的DMSO也具有促进作用（见表1）。需要注意的是，某些PSC细胞系更容易向特定谱系分化。例如，HUES6细胞已被证明对分化较为抗拒，因此经DMSO处理后表现出显著改善（图2）。相比之下，图4和图5中使用的HUES8细胞则更倾向于内胚层分化；因此，在向定型内胚层分化的初始阶段，对照组与DMSO处理组之间的差异较小。尽管如此，在该细胞系分化的后期阶段，DMSO预处理的促进作用仍然明显（图4B）。DMSO处理具有良好的适用性，既可在二维（2D）也可在三维（3D）细胞培养系统中有效应用；可与多种细胞培养板包被材料联合使用；并且适用于多种支持hPSC生长与扩增的维持培养基（如mTeSR、E8、MEF条件培养基等）。
更普遍而言，这些结果表明，多能干细胞的起始状态对其向功能细胞类型进行初始分化及终末分化的倾向性具有显著影响。我们先前已证明，DMSO 处理在人多能干细胞（hPSCs）中通过 Rb 起作用3,5。Rb 在促进终末分化、细胞存活以及细胞遗传稳定性方面发挥重要作用41,42,43,44，因此可能解释了经 DMSO 处理的 hPSCs 分化后细胞所表现出的持续效应。靶向这些早期调控机制可能使 hPSCs 更好地进入分化路径，最终提升其在再生医学中的应用价值。

多能干细胞的使用已推动了生物医学研究的众多进展，包括再生医学和基于干细胞的治疗、疾病建模以及药物筛选等领域。这也促进了更具可转化性的研究和个体化医学的整体前景。二十多年前诱导性多能干细胞（iPSC）技术的出现，使研究人员能够从体组织中获得多能干细胞，并将其分化为功能性细胞类型，用于研究多种病理状态，包括心血管、神经和免疫系统疾病。尽管干细胞分化技术已取得显著进展，但在有效分化人胚胎干细胞（hESCs）和iPSC方面仍存在挑战，限制了干细胞技术在不同研究项目中的广泛应用。不同细胞系和克隆之间固有的变异性，持续对干细胞系向目标谱系的分化构成障碍1。此外，从hPSCs获得成熟、终末分化的功能性细胞在许多谱系中仍是一个繁琐且效率低下的过程。事实上，由hPSCs分化而来的细胞常常无法完全终末分化为功能性细胞2。为了进一步推动基于干细胞的疗法在患者中的应用，有必要改进并确保由hPSCs生成的细胞的功能有效性。
本实验室已建立一种快速且经济的工具，可显著提高将诱导多能干细胞（iPSCs）和胚胎干细胞（ESCs）分化为成熟细胞类型的效率。我们发现，在定向分化开始前24至48小时，使用常用的试剂二甲基亚砜（DMSO）对人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）进行预处理，可显著增强干细胞的分化能力。DMSO处理可增加hiPSCs和hESCs处于细胞周期早期G1期的比例，并激活视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）3，后者是调控细胞增殖、存活和分化的关键因子4。在近期的研究中发现，Rb及其家族成员对于DMSO促分化效应是必需的：瞬时失活Rb会抑制DMSO的作用，而以瞬时方式持续激活Rb则可增强DMSO的效果5。类似于胚胎发育过程中的细胞周期，ESC和iPSC的细胞周期特征为缩短的G1期，这有利于自我更新6,7,8。这种缩短的G1期促进了更无限制的增殖，但限制了分化潜能4,9。通过促进hESCs和iPSCs在G1期的生长停滞并激活细胞周期检查点调控机制，DMSO处理使细胞在后续的定向分化过程中更易于发生细胞命运转变。
迄今为止，已有超过30种对照和疾病特异性的hESC及iPSC细胞系的研究表明，DMSO预处理可增强向三个胚层分化的潜能3,5，后续研究还证实其可促进干细胞及其他细胞系向多种成熟细胞类型的分化10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28（表1）。此外，DMSO处理在增强非人类原代细胞（如小鼠、灵长类、兔）的分化能力方面也显示出有效性21,23，提示其在不同物种间存在共通的作用机制。最后，DMSO预处理还已被应用于基因编辑技术，其中一项研究表明，对hESC/iPSC进行24小时DMSO预处理，可显著提高CRISPR/Cas9介导的非编码DNA编辑效率，同时不引入意外突变29。本文提供了DMSO预处理hESC和iPSC的详细方法，适用于干细胞生物学及定向分化研究。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>6孔透明平底TC处理多孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>9位磁力搅拌器&amp;nbsp;</td><td>Chemglass</td><td>CLS-4100</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI</td><td>Gibco</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>Alk5i II</td><td>Axxora</td><td>ALX-270-445</td><td></td></tr><tr><td>全反式维甲酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>抗-Brachyury</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2085</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-C肽</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>GN-ID4</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-FoxA2</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-Nkx2.2</td><td>爱荷华大学，发育杂交瘤库</td><td>74.5A5</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-Nkx6.1</td><td>爱荷华大学，发育杂交瘤库；&amp;nbsp;</td><td>F55A12-上清液</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-Olig2</td><td>EMD Millipore</td><td>MABN50</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-Pax-6</td><td>Biolegend</td><td>901301</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-Pdx1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-SOX1&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3369</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>抗-SOX17</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1924</td><td>不同批次间未观察到差异</td></tr><tr><td>B-27补充剂，不含维生素A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Gibco</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>Betacellulin</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50932345</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Stemgent</td><td>04-000-10</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066</td><td>Corning</td><td>99-603-CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL全自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G7528&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>一次性旋转烧瓶</td><td>Corning, VWR</td><td>89089-814</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6培养基</td><td>Gibco</td><td>A1516501</td><td></td></tr><tr><td>FAF-BSA</td><td>Proliant&amp;nbsp;</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>肝素&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H3149&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>人超敏胰岛素ELISA试剂盒</td><td>ALPCO Diagnostics</td><td>80-INSHUU-E01.1</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>KGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-19</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-3,3&amp;prime;,5-三碘甲腺原氨酸（T3）</td><td>EMD Millipore</td><td>642245</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel基质</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131&amp;nbsp;</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>15-100-CV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>N2补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S3817&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Noggin Fc嵌合蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3344-NG-050</td><td></td></tr><tr><td>PdBU</td><td>EMD Millipore</td><td>524390</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Mediatech&amp;nbsp;</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sant1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4572</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened激动剂SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附微孔板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>维生素C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748</td><td></td></tr><tr><td>XXI</td><td>EMD Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

使用dmso瞬时处理人多能干细胞以促进分化

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

尽管多能干细胞（PSCs）的应用日益广泛，但在高效诱导胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（ESCs 和 iPSCs）向不同谱系分化方面仍存在挑战。尽管已开发出多种分化方案，但不同细胞系之间的变异性和较低的分化效率仍为这些方案的成功实施带来困难。本文介绍了一种简便且经济的方法，可增强 PSCs 的分化能力。先前研究表明，使用低浓度二甲基亚砜（DMSO）处理干细胞，可显著提高多种 PSCs 在定向分化后向不同类型细胞分化的倾向。目前该技术已被证实可在不同物种（如小鼠、灵长类和人类）中有效应用于多个谱系的分化，范围涵盖神经元、皮质类球体、平滑肌细胞至肝细胞等。DMSO 预处理通过调控细胞周期并使干细胞更易于响应分化信号，从而改善 PSCs 的分化效果。本文提供了利用这一简单工具的详细方法学，作为一种可重复且广泛适用的手段，以更高效地将 PSCs 分化为任意目标谱系。

DMSO处理的iPSCs的形态学 
来源于对照组供体的人iPSCs在贴壁的二维单层或悬浮的三维细胞球中进行培养。在初次接种约24小时后，细胞在维持培养基中分别用1%或2%的DMSO处理24小时。DMSO处理后的代表性明场图像见图1。与先前报道的在单层培养中维持的iPSCs一致3，与未用DMSO处理的细胞相比，DMSO预处理导致细胞增殖率出现短暂的、剂量依赖性下降（图1A）。这种增殖减缓与细胞间接触增加相关，尤其在2% DMSO处理的细胞中更为显著，表现为形成更多高度聚集的细胞克隆。在其他细胞类型中，DMSO诱导的G1期阻滞已被证明与参与细胞间相互作用的蛋白表达上调有关，这些蛋白可促进接触抑制介导的生长停滞36。在以三维细胞球形式维持的iPSCs中，DMSO处理同样增加了细胞球的数量（图1B）。此外，DMSO处理还使三维细胞球的大小更加均一，此前研究已表明这通常提示细胞的分化潜能有所提升37。重要的是，无论是1%还是2% DMSO均未引起细胞毒性，这一点通过活率计数得到验证（n = 3；二维培养活细胞百分比 = 对照组：80 ± 1.3；1% DMSO：82 ± 3.7，2% DMSO：81 ± 2.7；三维培养活细胞百分比 = 对照组：81 ± 4.3；1% DMSO：82 ± 6.7，2% DMSO：82 ± 2.7）。总体而言，这些结果支持DMSO处理可改变培养干细胞的细胞周期和生长模式的观点。如先前研究所示，当从培养基中去除DMSO后，这种生长抑制效应是可逆的3。
DMSO 处理可改善胚胎干细胞向三胚层的分化 
将 HUES6 hESCs 接种于包被的培养板中培养 24 小时，随后在维持培养基中用 2% DMSO 处理 24 小时。之后按照 图 2A30,31,32 所示的处理方案诱导细胞向三个主要胚层分化。分化后的细胞经固定后，通过免疫染色检测各胚层典型标志物的表达（内胚层标志物为 SOX17，中胚层标志物为 brachyury，外胚层标志物为 SOX1）。如 图 2B 所示，经 2% DMSO 预处理 24 小时后，表达各胚层特异性标志物的细胞比例增加。这一结果与本实验室先前报道一致，即经 DMSO 处理的干细胞中，向所有胚层分化的细胞其免疫反应性、基因表达水平以及绝对数量均有所提高3,5。HUES6 是一种在所有谱系中均极难分化的 hESC 系1，然而 DMSO 处理显著增强了其向三胚层分化的潜能。
DMSO 处理可改善向祖细胞类型的分化 
为研究 DMSO 对向中枢神经系统（CNS）祖细胞类型分化的影响，将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为神经祖细胞（NPCs）或少突胶质细胞祖细胞（OPCs）。为生成 NPCs，细胞在维持培养基中用 2% DMSO 预处理 24 小时，随后进行为期 12 天的定向分化33（图 3A）。如 图 3B 所示，与对照组相比，2% DMSO 预处理提高了 NPC 标记物 PAX6 的表达水平。采用另一项先前已验证的方案34（图 3C），将 iPSCs 分化 12 天生成 OPCs。与 NPCs 类似，经 2% DMSO 预处理 24 小时的 iPSCs 分化所得的 OPCs 中，表达 OPC 标记物 OLIG2 的细胞比例也有所增加（图 3D）。
初始DMSO处理持续促进向成熟细胞类型的分化 
为研究 DMSO 对分化方案后期阶段的影响，在按照所述的 20 天定向分化方案向 β 细胞分化前，HUES8 hESCs 细胞预先用 2% DMSO 处理 24 小时。 图4a35HUES8细胞被采用，因为此前已发现其更倾向于向内胚层谱系分化1,38在定型内胚层阶段，分化细胞表达SOX17和FOXA2，即定型内胚层（DE）特异性标志物。随着进一步分化为胰腺前体细胞（PP）1）阶段，分化细胞表达PDX1和FOXA2，这是胰腺前体细胞的特征性标志物。在胰腺细胞分化的这些阶段，诱导形成定形内胚层（DE）以及随后形成胰腺前体细胞（PP）的效率1 对照组和DMSO处理的hESCs分化至各个阶段时，其数值均较高（图4B1 和 3 阶段）。尽管 HUES8 细胞系被认为更倾向于分化为内胚层谱系，但随着分化进一步推进至终末阶段的特化细胞类型，经 DMSO 处理的 hESCs 更有可能产生成熟的胰腺内分泌细胞。在 DMSO 处理的 hESCs 中，生成 PDX1/NKX6.1+ 胰腺前体细胞、Neurogenin 3+ 内分泌细胞以及 NKX6.1/C-肽+ SC-β 细胞的效率显著更高（图 4B，4期和5期）。这些结果与NPC和OPC的分化一致，表明DMSO可增强向祖细胞类型的分化潜能，同时也证明DMSO在促进更特化细胞类型生成方面具有持续作用。这与我们先前的研究结果一致，即最初的24小时DMSO处理可促进跨胚层的终末细胞类型分化，包括神经元细胞以及搏动的心肌细胞。31,39 在分化能力强或分化能力弱的细胞系中3.
初始DMSO处理可改善hESC分化细胞的功能 体内 移植 
此前，我们已证实 DMSO 处理在促进人胚胎干细胞分化为功能性胰腺前体细胞方面具有显著效果，这些细胞在体内表现出明显的胰岛素分泌能力提升3. 采用先前已发表的方案3,30,40，HUES8 人胚胎干细胞经 1% DMSO 处理 24 小时后，分化为胰腺前体细胞，并移植至免疫缺陷的 SCID-Beige 小鼠体内以评估其功能（例如，在葡萄糖刺激或 KCl 刺激下胰岛素的分泌）图5A）。在对照组和DMSO处理的hESCs之间，分化为FOXA2+（约90%）和PDX1+（约75%）胰腺前体细胞的效率相当（图5B对于HUES8人胚胎干细胞系，经24小时1% DMSO处理后由人胚胎干细胞分化而来的细胞，在体内移植后对葡萄糖和KCl刺激的反应性得到改善。移植后2周内即可观察到功能的改善。图5C) 并持续至移植后至少16周图5D综上所述，这些结果表明，DMSO 预处理不仅能够提高向胚层、前体细胞以及更成熟细胞类型的分化效率，而且还能持续增强分化细胞在体内的功能活性。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>分化细胞类型</td>
			<td>起始细胞类型</td>
			<td>%DMSO</td>
			<td>DMSO处理时长</td>
			<td>DMSO处理时长</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝细胞</td>
			<td>ESC 
			肝癌细胞系 
			ESC 
			ESC 
			间充质干细胞 
			iPSCs 
			ESC 
			ESC 
			肝癌细胞系 
			ESC</td>
			<td>1.0 
			1.0 
			1.0 
			0.5 
			0.1-2.0 
			1.0 
			1.0 
			0.5 
			1.0 
			0.6</td>
			<td>8天 
			数天 
			7天 
			10-14天 
			7-21天 
			7天 
			4天 
			5天 
			2-21天 
			全程</td>
			<td>Basma et al., 2008 
			Kanebratt and Andersson, 2008 
			Hay et al., 2009 
			Duan et al., 2010 
			Alizadeh et al., 2014 
			Kondo et al., 2014 
			Szkolnicka et al., 2014 
			Czysz et al., 2015 
			Nikolaou et al., 2016 
			Vanhove et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>原始胚层</td>
			<td>ESCs和iPSCs 
			hESC 
			hESC</td>
			<td>0.1-2.0 
			0.5 
			0.1-2.0</td>
			<td>24小时 
			24小时 
			24小时</td>
			<td>Chetty et al., 2013 
			Chetty et al., 2015 
			Li et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心肌细胞</td>
			<td>ESCs和iPSCs 
			P19细胞 
			ESCs和iPSCs 
			胎儿间充质干细胞</td>
			<td>0.1-2.0 
			1.0 
			1.0-2.0 
			0.8-1.0</td>
			<td>24小时 
			4天 
			24-30小时 
			24小时</td>
			<td>Chetty et al., 2013 
			Choi et al., 2014 
			van den Berg et al., 2016 
			Deng et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰腺细胞</td>
			<td>ESCs和iPSCs 
			hESC</td>
			<td>0.1-2.0 
			0.5</td>
			<td>24小时 
			24小时</td>
			<td>Chetty et al., 2013 
			Chetty et al., 2015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平滑肌细胞</td>
			<td>P19细胞</td>
			<td>1.0</td>
			<td>4天</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>内皮细胞</td>
			<td>P19细胞</td>
			<td>1.0</td>
			<td>4天</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肠上皮细胞</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1.6</td>
			<td>4天</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肠道上皮</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1.6</td>
			<td>4天</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经细胞</td>
			<td>狨猴iPSC</td>
			<td>0.05-2.0</td>
			<td>24小时</td>
			<td>Qiu et al., 2015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中性粒细胞</td>
			<td>白血病细胞系</td>
			<td>1.25</td>
			<td>6-8天</td>
			<td>Teimourian and Moghanloo, 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>骨骼肌肌管</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>1.5</td>
			<td>24小时</td>
			<td>Swartz et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮质类器官</td>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>1.0</td>
			<td>24小时</td>
			<td>Yoon et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：已发表文献中关于DMSO处理对分化具有有益作用的研究总结。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>S1</td>
			<td>S2</td>
			<td>S3</td>
			<td>S5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB131 (L)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖 (g)</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.44</td>
			<td>0.44</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO₃ (g)</td>
			<td>2.46</td>
			<td>1.23</td>
			<td>1.23</td>
			<td>1.754</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAF-BSA (g)</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X (mL)</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.02</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素 C (mg)</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝素 (mg)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：内分泌前体细胞分化基础培养基的组分。
<img alt="二维和三维细胞培养在DMSO处理下的比较；药物效应分析的显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：DMSO处理改变hPSCs的生长。（A）经0%（对照）、1%或2% DMSO处理24小时后，以单层形式接种的hiPSCs的代表性明场图像。DMSO可诱导iPSCs出现短暂的剂量依赖性生长抑制。（B）hiPSCs接种于低吸附培养板以形成三维细胞球，分别接受0%（对照）、1%或2% DMSO处理24小时后的代表性明场图像。与对照组相比，DMSO处理导致三维细胞球形成的变异性降低。比例尺 = 500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="内胚层、中胚层、外胚层的分化途径；免疫荧光DAPI染色结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：DMSO处理可促进hPSCs向三个主要胚层的分化。（A）用于生成三个主要胚层的分化方案示意图。（B）定向分化后的HUES6 hESCs代表性图像，经免疫荧光标记SOX17（内胚层）、brachyury（中胚层）和SOX1（外胚层）。在定向分化前使用2% DMSO预处理24小时，可提高三个胚层的分化效率。图中显示了对照组和DMSO处理组hESCs分别向SOX17+内胚层、Brachyury（Brachy）+中胚层或SOX1+外胚层细胞分化的百分比，并标注了三次生物学重复实验的均值±标准误（SEM）。非配对t检验结果：内胚层p = 0.0003；中胚层p = 0.047；外胚层p = 0.015。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经前体细胞、少突胶质细胞分化步骤；免疫荧光；Pax6、Olig2 染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：DMSO 处理促进向神经前体细胞类型的分化。（A）用于生成神经前体细胞（NPCs）的分化方案示意图。（B）人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为 NPCs 后经 Pax6 免疫标记的代表性图像。经 2% DMSO 预处理 24 小时后，PAX6 阳性细胞数量增加。图中显示了对照组和 DMSO 处理组人 iPSCs 定向分化为 Pax6+ NPCs 的细胞百分比，并标注了三次生物学重复实验的均值±标准误（SEM）。非配对 t 检验：p = 0.0225。比例尺 = 200 µm。（C）用于生成少突胶质前体细胞（OPCs）的分化方案示意图。（D）人 iPSCs 分化为 OPCs 后经 OPC 标记物 Olig2 免疫标记的代表性图像。与对照组相比，经 2% DMSO 预处理 24 小时后，两种 OPC 标记物的表达均有所增加。图中显示了对照组和 DMSO 处理组人 iPSCs 定向分化为 Olig2+ OPCs 的细胞百分比，并标注了四次生物学重复实验的均值±标准误（SEM）。非配对 t 检验：p = 0.0466。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="干细胞分化阶段示意图；胰腺前体细胞的免疫染色结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：DMSO处理可增强hPSCs的终末分化潜能。（A）HUES8 hESCs经定向分化为终末分化的胰腺内分泌细胞的大约20天过程示意图。（B）对照组细胞（未经处理）与经2% DMSO预处理24小时的细胞，在定向分化各阶段中，针对所示标志物的免疫染色结果。初始的DMSO处理效应持续存在，并在定向分化的后期阶段促进更多细胞向终末内分泌细胞类型分化。图中注明了对照组和DMSO处理组hESCs在各分化阶段转化为所示标志物阳性细胞的百分比，误差线表示2至4次生物学重复实验的标准误（SEM）。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="胰腺分化过程与胰岛素反应；柱状图显示移植后的数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：hPSCs 的初始 DMSO 处理可增强胰腺前体细胞在体内移植后对葡萄糖的响应能力。（A）HUES8 hESC 经定向分化（约 15 天）形成胰腺前体细胞（PP2）的示意图，分化前未进行处理（对照组）或接受 24 小时 1% DMSO 处理，随后将细胞（500 万个）移植至免疫缺陷型 SCID-Beige 小鼠体内。（B）对照组与 DMSO 处理组 hESC 在体外定向分化后、移植前，分化为 PDX1+ 和 FOXA2+ 胰腺前体细胞的百分比（n = 1）。（C）在移植后 2 周（C）和 16 周（D），对由对照组与 DMSO 处理组 hESC 分化而来的胰腺前体细胞移植小鼠进行低浓度（2.5 mM）或高浓度（15 mM）葡萄糖刺激，或氯化钾（KCl）刺激后，从小鼠血清中测得的人胰岛素平均 ELISA 值（误差棒 = 标准误；对照组在 2 周和 16 周时 n = 3；DMSO 组在 2 周和 16 周时 n = 2）。双因素方差分析：2 周时对照组与 DMSO 组比较 p = 0.0051；16 周时对照组与 DMSO 组比较 p = 0.0116。不同时间点研究的小鼠为不同个体。结果改编自 Chetty 等人3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

利用人多能干细胞（hPSCs）生成分化的细胞类型具有巨大的治疗前景，但仍具挑战性。即使在给予适当信号刺激的情况下，PSCs 常表现出固有的难以分化的能力。本文介绍一种简单工具，可增强多种 PSC 系列的多谱系分化能力。

使用DMSO瞬时处理人多能干细胞以促进分化

尽管多能干细胞（PSCs）的应用日益广泛，但在高效分化胚胎干细胞和诱导多能干细胞（ESCs 和 iPSCs）方面仍存在挑战。

这是一种简单的处理方法，可应用于任何干细胞系或分化方案，以启动细胞的分化。操作方法仅需在细胞培养维持培养基中加入1-2%的DMSO。该技术的主要优势在于，通过启动细胞分化，可显著提高多能干细胞向任何目标谱系的分化潜能。DMSO处理可提高由患者来源的iPSCs分化成细胞的几率，使其可用于细胞替代疗法、疾病建模和药物筛选。该处理可引发调控胚胎发育过程中细胞亚增殖、分化和特化的早期调控机制的启动。我们已证实，DMSO处理可改善近50种人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞系的分化能力。尽管其他实验室已证实二甲基亚砜（DMSO）对小鼠和灵长类等其他物种的干细胞具有益处，但在启动分化前一天，将DMSO以1%或2%的浓度加入常规维持培养基中，处理24小时。DMSO处理24小时后，更换培养基，并按照常规分化方案继续进行。根据文稿说明培养细胞。当细胞达到适当的汇合度时，将其解离并制备成单细胞悬液。使用台盼蓝等活性染料标记，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪对活细胞进行计数。为了在24小时DMSO预处理期间达到80-90%的融合度，将细胞以每孔50万至100万个细胞的密度接种到包被的六孔板中。在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育细胞24小时。然后吸除培养基，并更换为1-2% DMSO溶液。在诱导分化前，让细胞孵育 24–28 小时。若孵育时间为 48 小时，则在 24 小时后更换为新鲜的 DMSO 溶液。为实现三维培养分化，需将细胞在细胞悬液中培养并收集。计数活细胞，并将其接种于未包被的低吸附六孔板中，加入含有ROCK抑制剂的干细胞培养基。通常情况下，三维人多能干细胞球将在24小时内形成。将细胞置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育24小时。根据文稿说明，用预热的干细胞培养基配制1-2% DMSO溶液。孵育结束后更换培养基时，将培养板倾斜至30度至45度角，使细胞球体沉降至孔底。吸除细胞培养基，并用DMSO溶液轻轻重悬细胞。将细胞置于二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育24-48小时。按照二维培养所述方法，用DMSO预处理细胞，并配制noggin和SB431542的储备液。在无血清DMEM培养基中配制足够量的10% knockout血清替代物（KOSR），以满足三至四天的培养基更换需求。按照文中所述，将noggin和SB431542加入预热的KOSR敲除DMEM中，制备外胚层分化培养基。DMSO预处理后，吸去细胞中的培养基，每孔加入两毫升分化培养基。将细胞置于二氧化碳培养箱中，在37°C条件下孵育3至4天，每天更换含有新鲜分化因子的培养基。DMSO 预处理与未处理细胞相比，会导致细胞生长速率出现短暂且剂量依赖性的下降。这种增殖减少与细胞间接触增加相关，尤其在经 2%DMSO 处理的细胞中更为显著。当细胞固定并用各胚层典型标志物进行染色后，可见经 2%DMSO 预处理的细胞中分化胚层细胞的比例增加。例如，通过 SOX17 染色以显示内胚层细胞。为了研究 DMSO 对中枢神经系统前体细胞类型分化的影响，可将人诱导性多能干细胞分化为神经前体细胞或少突胶质细胞前体细胞。与对照细胞相比，2% DMSO 预处理可提高神经前体细胞标志物 Pax6 的表达水平。同样，预处理可增加表达少突胶质细胞前体细胞标志物 Olig2 的细胞比例。此外，初始的 DMSO 处理可改善人胚胎干细胞来源细胞在体内移植后的功能。当将分化后的胰腺前体细胞移植到免疫缺陷小鼠体内后，可通过葡萄糖刺激或 KCl 刺激来检测其功能。 移植后两周至16周，细胞功能的改善明显。需要考虑的最重要因素是干细胞的周期或倍增时间。DMSO处理的时间长度应与细胞的周期时间相同。经过初始的DMSO处理后，可以了解干细胞中细胞增殖和细胞周期的调控机制，因为该处理有助于促进细胞周期G1期的生长停滞。分化后的细胞可用于研究疾病相关机制、与其他细胞类型共培养、进行致瘤性检测，以及开展功能检测或移植研究，以确定分化细胞是否能够挽救疾病表型。

transient-treatment-human-pluripotent-stem-cells-with-dmso-to-promote

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

用DMSO对人多能干细胞的暂时性治疗促进分化

本视频展示了通过短暂的DMSO处理促进干细胞分化的实验方法，该处理可将细胞阻滞在G1期。处理后，加入含有BMP和TGF-β抑制剂的外胚层分化培养基，以促进神经前体细胞的形成。...

通过短暂的DMSO处理增强干细胞分化

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