Name: 人脐带血衍生CD34的泛骨髓分化–造血干细胞和祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 了解人脐带血CD34+造血干细胞向髓系谱系分化的完整实验流程。本方案利用细胞因子诱导实现巨核细胞、红细胞、粒细胞和单核细胞的高效分化，为血液疾病研究提供可靠技术平台。

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作者感谢 Maricopa 综合卫生系统（Maricopa Integrated Health Systems）的 Wendy Barrett、Rachel Caballero 和 Gabriella Ruiz 提供去标识化并捐赠的脐带血样本，感谢 Mrinalini Kala 在流式细胞术方面的协助，以及感谢 Gay Crooks 和 Christopher Seet 在体外髓系分化方面的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，资助号：R21CA170786 和 R01GM127464）和美国癌症协会（American Cancer Society，机构研究资助号：74-001-34-IRG）对 S.S. 的经费支持。本内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

用于实验的人类脐带血由健康个体在知情同意后捐赠给凤凰城的马里科帕综合健康系统（Maricopa Integrated Health Systems, MIHS）。这些去标识化的样本单元通过MIHS与亚利桑那大学之间的材料转移协议获得。
1. 试剂与缓冲液
注意：所有试剂和缓冲液均须在生物安全柜内无菌条件下配制。
<ol>
	<li>通过将7.2 mL无菌35%牛血清白蛋白（BSA；使用无菌组织培养级35% BSA）和5 mL无菌0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）加入487.8 mL无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，制备无菌PBS-BSA-EDTA（PBE）缓冲液。在生物安全柜中将滤器连接至真空泵，至少抽气2小时以实现过滤除菌和脱气。将脱气后的缓冲液分装成较小体积（250 mL），并于4 °C保存。</li>
	<li>制备1x汉克斯平衡盐溶液（1x HBSS）。将100 mL 10x HBSS储备液加入900 mL无菌蒸馏水中，配制成1 L的1x HBSS，并调节pH至7.2。使用前经滤膜除菌。</li>
	<li>通过将2 mL冰醋酸加入98 mL蒸馏水中，制备2%乙酸溶液。</li>
	<li>在1x PBS中配制20 ng/mL重组人纤维连接蛋白片段溶液。每块48孔板制备10 mL。</li>
	<li>制备2% BSA溶液。向100 mL 1x PBS中加入2克BSA第五组分。使用前经滤膜除菌。</li>
	<li>通过将DMEM粉末、3.7 g碳酸氢钠、100 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素（PS）加入800 mL无菌蒸馏水中，配制完全杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。混匀后定容至1 L，使用前经滤膜除菌。</li>
	<li>通过将90 mL FBS与10 mL无菌二甲基亚砜（DMSO）混合，制备冻存培养基。</li>
	<li>制备刺激培养基。向无血清培养基中加入L-谷氨酰胺至终浓度2 mM，并加入细胞因子至终浓度：干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）和Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）均为50 ng/mL，白细胞介素-3（IL3）为20 ng/mL（细胞因子储备液的配制详见材料表）。每块48孔板制备5 mL。</li>
	<li>制备1x髓系分化培养基。向完全DMEM中加入细胞因子至终浓度：SCF、Flt3L和IL3均为5 ng/mL，TPO为50 ng/mL，促红细胞生成素（EPO）为4单位/mL。每块48孔板制备5 mL。</li>
	<li>制备2x髓系分化培养基。向完全DMEM中加入细胞因子至终浓度：SCF、Flt3L和IL3均为10 ng/mL，TPO为100 ng/mL，促红细胞生成素（EPO）为8&#160;单位/mL。每块48孔板制备5 mL。</li>
	<li>向1 L 1x PBS中加入10 g BSA第五组分，制备流式细胞术缓冲液。</li>
	<li>在1x PBS中配制1%多聚甲醛（具体步骤详见材料表）。</li>
	<li>通过将500 µL 10 mg/mL多聚-L-赖氨酸加入49.5 mL 1x PBS中，制备多聚-L-赖氨酸溶液。</li>
</ol>
2. 从脐带血中分离单个核细胞
注意：以下方案所用脐带血体积为 90 至 100 mL。CD34+ 细胞的分离必须在生物安全柜内无菌条件下进行。
<ol>
	<li>将含有脐带血（UCB）的袋子用70%乙醇喷洒，以消毒其外表面，然后将其移入生物安全柜中。将脐带血转移至无菌的250 mL塑料瓶中，并加入等体积的室温（RT）1×HBSS，使其按1:1比例稀释。</li>
	<li>将单个核细胞（MNC）分离介质&#160;（MFM；参见材料表）按每管15 mL分装至约六支无菌50 mL锥形管中。倾斜装有MFM的管子，将30 mL稀释后的脐带血轻柔地倾注到MFM层上，避免扰动该层。</li>
	<li>在室温下以400 × g 离心30分钟，采用慢加速且不启用刹车。</li>
	<li>离心后，吸除单个核细胞层上方15–20 mL的血浆。用移液器轻柔吸取单个核细胞，并转移至新的50 mL锥形管中。 
	注意：单个核细胞在血浆与MFM界面处形成白色絮状层，而红细胞（RBCs）则沉积于锥形管底部。</li>
	<li>将从2–3支管中收集的单个核细胞合并。每管用冷PBE缓冲液补至50 mL体积。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g 离心10分钟，刹车设置为低档。</li>
	<li>吸除上清液，轻敲管壁以松动细胞沉淀。</li>
	<li>将沉淀细胞重悬于5 mL冰上预冷的PBE缓冲液中。使用相同的5 mL重悬细胞液收集其他管中的细胞。将3至4支管的细胞合并至一支50 mL锥形管中。</li>
	<li>为收集残留细胞，用5 mL冷PBE缓冲液冲洗所有管子，并将洗涤液加入50 mL锥形管中。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液加入490 µL醋酸溶液中稀释，计数单个核细胞数量。 
	注意：醋酸可裂解任何污染的红细胞，从而更便于单个核细胞计数。</li>
	<li>用冰上预冷的PBE缓冲液将细胞悬液体积补至50 mL。在4 °C下以300 × g 离心10分钟，刹车设置为低档。 
	注意：单个核细胞悬液可立即用于CD34+细胞的分离，或冷冻保存以备后续使用。</li>
	<li>如需冷冻保存单个核细胞，吸除上清液后，在室温下用冷冻保存液将细胞重悬至浓度为2 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞置于-80 °C过夜，使用细胞冻存盒，随后转移至液氮中长期保存。</li>
</ol>
3. 从单个核细胞中分离CD34+细胞
<ol>
	<li>若使用新鲜分离的单个核细胞（MNC），请直接进行步骤 3.3。</li>
	<li>若使用冻存的 MNC，需在 37 °C 水浴中快速解冻细胞，并转移至 50 mL 锥形管中。用 1 mL 冰冷的 PBE 缓冲液冲洗冻存管内残留细胞，并将冲洗液转移至 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用冰冷的 PBE 缓冲液将 MNC 悬液补至 50 mL，于 4 °C 以 600 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，轻轻敲击管壁以松动细胞沉淀。将 MNC 重悬于 300 µL 冰冷的 PBE 缓冲液中，调整细胞浓度至 1 × 108 个细胞。</li>
	<li>每 1 × 108 个 MNC 加入 100 µL 磁性激活细胞分选（MACS）人 CD34 微珠试剂盒中的 FcR 阻断试剂，轻轻混匀。 
	注意：此步骤可阻断非特异性结合至 CD34 微珠的现象。</li>
	<li>每 1 × 108 个细胞加入 100 µL CD34 微珠，轻轻混匀后于 4 °C 冰箱中孵育 30 分钟。请勿在冰上孵育。</li>
	<li>在细胞孵育期间，将 LS 分选柱和预分离滤器置于 MACS 分选仪的磁场中。通过向分选柱直接加入 2 mL、向预分离滤器加入 1 mL 冰冷 PBE 缓冲液进行平衡。让液体流过柱子进入 15 mL 锥形管，弃去穿流液。</li>
	<li>将 MNC 从 4 °C 取出，加入冰冷 PBE 缓冲液至终体积 15 mL，于 4 °C 以 300 × g 离心 10 分钟，离心时刹车设为低档。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL 冰冷的 PBE 缓冲液中。</li>
	<li>将细胞悬液加入置于 LS 分选柱上的预分离滤器中。 
	注意：预分离滤器可去除可能堵塞分选柱的大细胞聚集体。</li>
	<li>用 3 mL 冰冷 PBE 缓冲液冲洗原细胞管，并将冲洗液加入置于 LS 分选柱上的预分离滤器中。随后弃去预分离滤器。</li>
	<li>每次加入 3 mL 冰冷 PBE 缓冲液，重复洗涤 LS 分选柱四次，每次均让液体完全流尽。 
	注意：CD34+ 细胞将保留在分选柱上，而未标记的细胞则穿柱流出。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将分选柱从 MACS 分选仪的磁场中取出，转移至一个新的 15 mL 锥形管中，远离磁铁。</li>
	<li>向分选柱中加入 5 mL 冰冷 PBE 缓冲液，用力推动推杆以洗脱结合的 CD34+ 细胞。</li>
	<li>可选：将第一次分选柱获得的 CD34+ 细胞，按照上述步骤（3.10–3.13）再次通过另一个带有预分离滤器的 LS 分选柱进行纯化。</li>
	<li>使用台盼蓝染色法（10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝）计数分离得到的 CD34+ 细胞，以确定&#160;活细胞总数。 
	注意：此时分离的 CD34+ 细胞可冻存以备后续使用，或直接用于造血干/祖细胞（HSPC）的流式细胞术分析（第 4 节），或用于向髓系细胞分化（第 5 节）。</li>
	<li>于室温下以 600 × g 离心细胞悬液 5 分钟，离心时刹车设为低档。</li>
	<li>如需冻存 CD34+ 细胞，吸除上清液，将最多 5 × 106 个细胞重悬于 1 mL 冻存液中，并按前述方法（步骤 2.13）进行冻存；否则，继续进行第 4 或第 5 节操作。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术确定干细胞和祖细胞群体
<ol>
	<li>为确定新鲜分离的 CD34+ HSPC 中干细胞和祖细胞群体的比例，将细胞在 600 x g 离心 5 分钟，并将 1 x 106 个细胞重悬于 50 µL 流式细胞术缓冲液中。</li>
	<li>向 1 x 106 个 CD34+ 细胞中加入抗体（稀释比例见材料表），包括谱系标记物（CD3、CD7、CD10、CD11b、CD19 和 CD235a — 均为 FITC 标记）、CD34（APC-Cy7）、CD38（PE）、CD45RA（PE-Cy7）、CD123（APC）以及 7-氨基放线菌素 D（7-AAD；用于活/死细胞染色），并用缓冲液补足至总体积 100 µL。冰上避光孵育 20 分钟。 
	注意：分析时可使用少于 1 x 106 个 CD34+ 细胞。若细胞数量较少，应相应减少总体积和抗体添加量。进行流式细胞术分析时，应使用未染色和单染色的单个核细胞（MNC）作为对照，以设定每种荧光染料的阳性和阴性门控。</li>
	<li>孵育后，用 1 mL 流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并在 600 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>可选步骤：将染色后的细胞在 0.5 mL 1% 多聚甲醛溶液中室温避光固定 10 分钟。</li>
	<li>在 600 x g 离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用 1 mL 流式细胞术缓冲液洗涤固定/染色后的细胞，并在 4 °C 下以 600 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于 500 µL 流式细胞术缓冲液中，然后使用流式细胞仪进行分析（材料表）。</li>
</ol>
5. CD34+ 造血干细胞和祖细胞的髓系分化
注意：为了将CD34+ HSPC向髓系细胞分化，首先在包被有重组人纤连蛋白片段的培养板中进行刺激，然后接种于MS-5基质细胞层上，并在髓系分化培养基中培养。可通过检测四种髓系谱系特异性细胞表面标志物的表达情况，每周监测一次分化进程，持续3周。在刺激和分化过程中，所有孵育步骤均在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中进行。&#160;所有操作均应在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在48孔无包被无菌培养板中，每孔加入200 µL含重组人纤连蛋白的1×PBS溶液，室温孵育2小时，对孔板进行包被。</li>
	<li>2小时后，小心移除重组人纤连蛋白溶液并弃去。</li>
	<li>用 200 µL/孔的 2% BSA 在室温下封闭孔板 30 分钟。</li>
	<li>吸除 BSA 溶液，用 500 µL 无菌 1x PBS 洗涤孔板两次。 
	注意： 包被有纤连蛋白片段的培养板可在 4 °C 下保存长达 2 周。</li>
	<li>为了刺激CD34+ HSPCs，将 freshly isolated cells（来自步骤 3.17）重悬于密度为 1 x 105 细胞/200 µL 或 5 × 105 每毫升温热的1倍刺激培养基中的细胞数。</li>
	<li>若使用冻存的 CD34+ 细胞，快速解冻后转移至含有温热的完全DMEM的15 mL锥形管中。以600 x g 5分钟，然后按照步骤5.5中所述重新悬浮细胞。</li>
	<li>加入200 µL CD34+ 每孔加入细胞悬液至纤连蛋白片段包被的48孔板中，孵育48小时。</li>
	<li>次日，将15,000个MS-5基质细胞接种至48孔组织培养板的每孔中，每孔加入200 µL完全DMEM培养基，于37 °C孵育24 h。</li>
	<li>刺激48小时后，收集CD34+ 通过轻柔吹打使细胞悬浮。用500 µL温热的DMEM洗涤孔板，并将洗液与细胞悬液合并。</li>
	<li>用台盼蓝计数细胞。将悬液在600 x g离心 g 5分钟，然后以每200 µL含5,000个细胞的密度重悬于1x髓系分化培养基中。</li>
	<li>从接种了 MS-5 基质细胞的 48 孔组织培养板中，轻柔吸除培养基，避免扰动细胞。加入 200 µL（5,000 个细胞）的 CD34+ 每孔加入细胞悬液，并在37 °C下孵育。 
	注意： MS-5 细胞可在完全 DMEM 培养基中培养。在分离 CD34+ 细胞接种时，MS-5细胞应形成均匀单层（80–90%融合度）。建议在接种CD34+细胞前至少24小时接种MS-5细胞。+ 细胞&#160;如果MS-5细胞需在接种CD34细胞前48 h或72 h进行铺板+ 细胞，应相应调整细胞密度。建议将48孔板的边缘孔留空或加入200 µL无菌水，以避免边缘效应。</li>
	<li>每3−4天进行一次半量换液，轻轻从每个孔的上层移除100 µL培养基，并为每孔加入100 µL 2x髓系分化培养基。</li>
	<li>第21天，收集细胞用于流式细胞术分析髓系谱系标志物的表达。在不扰动MS-5细胞层的情况下，轻轻吸出培养基并将细胞转移至5 mL离心管中。 
	注意： 用于染色和流式细胞术分析时，1-2个孔的细胞数量已足够。分化过程也可在第1、7和14天进行监测。若需在多个时间点进行免疫表型分析，应相应计算各时间点所需的孔数。</li>
	<li>染色 5 × 105 使用CD34（APC-Cy7）、CD66b（PE-Cy7）、CD14（PE）、CD41（PerCP-Cy5.5）和CD235a（APC）抗体对细胞进行染色，总体积为50 µL。冰上避光孵育20分钟。设置未染色及单染色单个核细胞（MNCs）作为对照，用于确定每种荧光染料的阳性和阴性门控范围，并加入7-AAD作为活/死细胞染色，以在分析中排除死细胞。</li>
	<li>按照上述步骤（4.3–4.6）洗涤并固定（可选）已染色的细胞。</li>
	<li>将细胞重悬于500 µL流式细胞术缓冲液中，随后通过流式细胞仪进行分析。</li>
</ol>
6. 细胞形态的评估
<ol>
	<li>用乙醇喷洒载玻片并擦拭至发出吱吱声，以清洁载玻片。</li>
	<li>将清洁的载玻片浸入聚-L-赖氨酸溶液中，在室温下孵育5分钟，随后在室温下干燥1小时。</li>
	<li>将步骤3.14中的造血干细胞（HSPCs）和步骤5.13中的分化细胞重悬于10 µL流式细胞术缓冲液中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至包被的载玻片上，静置使其自然干燥。 
	注意：第1天和第21天的载玻片可在室温下保存，并同时进行染色。</li>
	<li>在载玻片上加入0.5 mL Wright-Giemsa染液，在室温下静置3分钟。</li>
	<li>加入等体积的去离子水，在室温下继续静置10分钟。</li>
	<li>用去离子水冲洗载玻片。</li>
	<li>使用显微镜在60倍或100倍放大倍数下观察染色后的细胞。</li>
</ol>

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<li>Egeland, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+differentiation+of+purified+CD34%2B+cells+after+stimulation+with+recombinant+human+granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+%28CSF%29%2C+granulocyte-CSF%2C+and+interleukin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3.</a> Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).</li>
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<li>Caceres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+suppression+promotes+erythropoiesis+in+del%285q%29+MDS%2C+suggesting+a+targeted+therapeutic+strategy+in+lenalidomide-resistant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASXL1+plays+an+important+role+in+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ASXL1 plays an important role in erythropoiesis.</a> Scientific Reports. 6, 28789(2016).</li>
<li>Mazumdar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-Associated+Cohesin+Mutants+Dominantly+Enforce+Stem+Cell+Programs+and+Impair+Human+Hematopoietic+Progenitor+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+expression+of+an+Flt3+internal+tandem+duplication+in+human+CD34%2B+cells+confers+properties+of+self-renewal+and+enhanced+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis.</a> Blood. 105 (1), 77-84 (2005).</li>
<li>Ambrosini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+inhibits+ILC3+while+favoring+NK-cell+maturation+of+umbilical+cord+blood+CD34%28%2B%29+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors.</a> European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).</li>
<li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%28beta%291+maintains+hematopoietic+immaturity+by+a+reversible+negative+control+of+cell+cycle+and+induces+CD34+antigen+up-modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation.</a> Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).</li>
<li>Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+potent+small+molecule+capable+of+regulating+polyploidization%2C+megakaryocyte+maturation%2C+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production.</a> Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案适用于将脐带血来源的CD34+造血干细胞/祖细胞（HSPCs）在体外分化为四种髓系细胞谱系。首先使用包含SCF、TPO、Flt3L和IL3的细胞因子混合物进行初始培养，以激活CD34+细胞。随后，通过添加含有SCF、IL3、Flt3L、EPO和TPO的混合因子诱导其分化。在此混合体系中，SCF、IL3和Flt3L对CD34+造血干细胞的存活与增殖至关重要；EPO和TPO分别促进向红细胞和巨核细胞的分化，而IL3则促进早期粒细胞-单核细胞前体及成熟细胞的分化13,17,18。该方法的一个局限性在于分化细胞比例存在观察到的变异，这可能是由于来自不同供体的CD34+ HSPCs在生成特定谱系细胞能力方面存在差异所致。
MS-5 细胞层对于 CD34+ HSPC 的高效分化至关重要。根...

造血干细胞（HSCs）的正常分化对于维持所有血细胞谱系的生理水平至关重要。在分化过程中，HSCs会协调响应包括生长因子和细胞因子在内的细胞外信号，首先产生具有淋系-髓系潜能的多能祖细胞（MPP）1,2,3,4（图1）。MPP进一步分化为谱系受限的共同髓系祖细胞（CMPs）和共同淋系祖细胞（CLPs）。CLPs分化为包括B细胞、T细胞和自然杀伤细胞在内的淋系细胞。CMPs则通过两种更特化的祖细胞群体——巨核细胞-红系祖细胞（MEPs）和粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）——生成髓系细胞。MEPs产生巨核细胞和红细胞，而GMPs产生粒细胞和单核细胞。除了通过CMPs产生外，已有研究报道巨核细胞还可通过非经典途径直接由HSCs或早期MPPs产生5,6。
造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的特征是表达表面标志物 CD34，且不表达谱系特异性标志物（Lin-）。其他常用于区分造血干细胞（HSCs）和髓系祖细胞群体的表面标志物包括 CD38、CD45RA 和 CD1232（图 1）。HSCs 和多能祖细胞（MPPs）分别为 Lin-/CD34+/CD38- 和 Lin-/CD34+/CD38+。髓系定向祖细胞群体则根据 CD45RA 和 CD123 的表达与否进行区分：共同髓系祖细胞（CMPs）为 Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo，粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）为 Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo，巨核细胞-红细胞祖细胞（MEPs）为 Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123-。
CD34+ 干细胞和祖细胞的总群体可从人脐带血（UCB）、骨髓和外周血中获得。在人脐带血中，CD34+ 细胞占单个核细胞（MNCs）总数的 0.02% 至 1.46%，而在骨髓中其比例介于 0.5% 至 5.3% 之间，在外周血中则低得多，约为 0.01%7,8,9。来源于脐带血的 CD34+ 细胞的增殖能力和分化潜能显著高于骨髓或外周血来源的细胞1,10，因此在进行细胞分化过程中的免疫表型和形态学表征的同时，更有利于获得足够的材料用于分子分析。
脐带血来源的CD34+造血干细胞（HSPCs）的体外分化是研究正常造血过程及造血系统疾病机制的常用模型。在适当的细胞因子培养条件下，脐带血CD34+ HSPCs可被诱导向髓系或淋巴系分化11,12,13,14,15,16。本文描述了从人脐带血中分离CD34+ HSPCs并进行免疫表型鉴定的技术方案，以及将其诱导分化为髓系细胞的方法。该培养体系基于在MS-5基质细胞存在下，通过细胞因子诱导HSPCs分化，以模拟骨髓微环境。该培养条件首先促使CD34+细胞扩增，随后分化为表达四种髓系细胞标志物的细胞，即粒细胞（CD66b）、单核细胞（CD14）、巨核细胞（CD41）和红细胞（CD235a）。CD34+细胞&#160;分化方案的应用包括研究调控造血过程的分子机制，以及探索与髓系疾病相关的突变和小分子化合物对HSPCs自我更新和分化的影响。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250-061</td><td>将工作液用无菌1×PBS稀释至0.2%</td></tr><tr><td>0.5 M UltraPure 乙二胺四乙酸，pH 8.0</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>10倍浓度Hanks平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Invitrogen</td><td>14185052</td><td>用无菌蒸馏水稀释至1倍浓度 &amp;且将pH调至7.2</td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶，无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15090046</td><td>用无菌的1x PBS将工作液稀释至1x</td></tr><tr><td>30 &amp;micro;m 预分离滤器</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>35% 无菌牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td>用作活/死细胞染色，以在FACS分析中排除死细胞</td></tr><tr><td>抗人CD10-FITC抗体（克隆HI10a）</td><td>Biolegend</td><td>312207</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD11b-FITC（活化）抗体（克隆CBRM1/5）</td><td>Biolegend</td><td>301403</td><td>使用1:5稀释度</td></tr><tr><td>抗人 CD123-APC 抗体（克隆 6H6）</td><td>Biolegend</td><td>306012</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人 CD14-PE 抗体（克隆 M5E2）</td><td>Biolegend</td><td>301806</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD19-FITC抗体（克隆4G7）</td><td>BD 生物科学</td><td>347543</td><td>使用1:5稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD235a-APC抗体（克隆GA-R2（HIR2））</td><td>BD 生物科学</td><td>551336</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD235a-FITC抗体（克隆HIR2）</td><td>Biolegend</td><td>306609</td><td>使用1:50稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD34-APC-Cy7抗体（克隆581）</td><td>Biolegend</td><td>343514</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD38-PE抗体（克隆HIT2）</td><td>Biolegend</td><td>303506</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD3-FITC抗体（克隆UCHT1）</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD41a-PerCP-Cy5.5抗体（克隆号HIP8）</td><td>Biolegend</td><td>303720</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人 CD45Ra-PE-Cy7 抗体（克隆株 HI100）</td><td>Biolegend</td><td>304126</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人 CD66b-PE-Cy7 抗体（克隆 G10F5）</td><td>Biolegend</td><td>305116</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>抗人CD7-FITC抗体（克隆CD7-6B7）</td><td>Biolegend</td><td>343103</td><td>使用1:20稀释度</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含L-谷氨酰胺的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）粉末&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td>将1袋溶解，配制成1 L的DMEM培养基&amp;nbsp; 碳酸氢钠，10% 胎牛血清 &amp;amp; 1% 青霉素 &amp;amp; 链霉素&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清，澳洲来源，经热灭活</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22 批号 #609716</td><td></td></tr><tr><td>人CD34微珠试剂盒&amp;nbsp;</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-046-702</td><td></td></tr><tr><td>人血小板生成素（TPO），研究级</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-094-011</td><td>制备100的储备液 &amp;micro;g/mL，溶于1×PBS + 0.1% BSA中。髓系分化时使用浓度为50 ng/mL。 &amp;刺激培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Omega Scientific</td><td>GS-60</td><td>刺激培养基中的2 mM浓度</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 磁力分离器</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>单个核细胞分层液（Ficol-Paque PLUS）</td><td>GE Healthcare 生物科学</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>MS-5 细胞</td><td></td><td></td><td>加州大学洛杉矶分校 Gay Crooks 实验室惠赠</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>在化学通风橱中，将800 mL 1x PBS加入玻璃烧杯，置于搅拌器上加热至约65 ℃ &amp;deg;C. 加入10 g多聚甲醛粉末。为完全溶解多聚甲醛，逐滴加入1 N NaOH以提高pH值。冷却后过滤溶液，并用1x PBS定容至1 L。调节pH至7.2。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素 &amp;& 链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ml</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>在1×PBS中配制10 mg/mL的储存液</td></tr><tr><td>重组人促红细胞生成素-α（rHu EPO-&amp;alpha;)</td><td>BioBasic</td><td>RC213-15</td><td>在1× PBS + 0.1% BSA中配制2,000单位/mL的储存液。髓系分化使用浓度为4单位/mL。</td></tr><tr><td>重组人纤连蛋白片段（RetroNectin）</td><td>Takara&amp;nbsp;</td><td>T100B</td><td>使用20 &amp;micro;g/mL，用无菌1×PBS稀释，用于刺激CD34前包被孔板&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; HSCs</td></tr><tr><td>重组人 Flt-3 配体（rHu Flt-3L）</td><td>BioBasic</td><td>RC214-16</td><td>制备100的储备液 &amp;micro;g/mL，溶于1× PBS + 0.1% BSA。髓系分化使用5 ng/mL。 &amp;amp; 50 ng/mL 刺激培养基中</td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-3（rHu IL-3）</td><td>BioBasic</td><td>RC212-14</td><td>配制100的储备液 &amp;micro;g/mL，溶于1× PBS + 0.1% BSA。髓系分化使用5 ng/mL &amp;amp; 20 ng/mL 刺激培养基中</td></tr><tr><td>重组人干细胞因子（rHu SCF）</td><td>BioBasic</td><td>RC213-12</td><td>制备100的储备液 &amp;micro;g/mL，溶于1× PBS + 0.1% BSA。髓系分化使用5 ng/mL &amp;以及刺激培养基中的50 ng/mL</td></tr><tr><td>无血清培养基（X-Vivo-15）</td><td>Lonza&amp;nbsp;</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>改良的瑞氏-吉姆萨染色</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WG16-500</td><td>按照制造商说明使用</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II 流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Sorvall Legend RT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人脐血来源的cd34+造血干细胞和祖细胞的泛髓系分化

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

人造血干细胞的离体分化是研究造血过程的常用模型。本文所述方案旨在通过细胞因子诱导，将CD34+造血干/祖细胞分化为四种髓系谱系细胞。CD34+细胞来源于人脐带血，与MS-5基质细胞共培养，并在细胞因子存在条件下进行诱导。文中描述了干细胞、祖细胞以及分化后髓系细胞的免疫表型鉴定方法。利用该方案，可将CD34+细胞与小分子化合物共同孵育，或通过慢病毒转导以表达髓系疾病相关突变，从而研究这些突变对髓系分化的影响。

采用上述方案可从约 100 mL 的脐带血单位中获得 5.6 (± 0.5) × 108 个单个核细胞（MNCs）和 1 (± 0.3) × 106 个 CD34+ 细胞。总 CD34+ 细胞的比例在 80–90% 之间（图 2A,B）。根据 Manz 等人5 描述的免疫表型分析方案显示，CD34+ 细胞通常包含约 20% 的造血干细胞（HSCs）和约 72% 的多能祖细胞（MPPs），其表型分别为 Lin-/CD34+/CD38- 和 Lin-/CD34+/CD38+（图 1 和 图 2A）。在 MPP 群...

本文介绍了一种对脐带血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞进行免疫表型鉴定以及细胞因子诱导其向四种髓系谱系分化的实验方案。该方案可用于研究髓系疾病相关突变或小分子化合物对CD34+细胞髓系分化的影响。

人脐血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞的泛髓系分化

体外分化人造血干细胞是研究造血作用的常用模型。本文所述方案用于细胞因子……

本方案可用于研究人CD34阳性造血干细胞和祖细胞在正常髓系分化过程中发生的分子和细胞变化。该方案的主要优势在于，它能够诱导CD34阳性细胞向所有四种髓系谱系分化，包括巨核细胞、红细胞、粒细胞和单核细胞。本实验操作将由我实验室的博士后Aditi Bapat进行演示。从人脐带血样本中分离单个核细胞时，先用70%乙醇对脐带血袋外表面进行消毒，然后在生物安全柜内将血袋内容物转移至无菌的250毫升塑料瓶中。用等体积的室温Hank's平衡盐溶液稀释血液，并向五个无菌的50毫升锥形管中各加入15毫升单个核细胞分离液。轻轻混匀后，将稀释后的脐带血30毫升小心地倾注到每根试管的单个核细胞分离液上层，操作时将50毫升试管倾斜，以避免各层液体混合。通过密度梯度离心法分离细胞，并移除单个核细胞层上方的15至20毫升血浆。用移液器小心地将暴露的单个核细胞层转移至新的50毫升离心管中，将两到三个离心管中的单个核细胞合并，并用冷的PBE缓冲液将每管终体积补至50毫升。通过离心沉淀单个核细胞样品，并吸除上清液。轻轻敲击每个离心管以松动细胞沉淀，并用5毫升预冷的PBE缓冲液稀释沉淀。将三到四个离心管中的细胞合并至一个50毫升的锥形离心管中，并用5毫升新鲜预冷的PBE缓冲液冲洗所有离心管，以收集残留的细胞。计数后，用新鲜预冷的PBE缓冲液将离心管中的终体积调至50毫升，通过离心收集细胞。为了分离CD34阳性单个核细胞，先将细胞沉淀重悬于50毫升新鲜的PBE缓冲液中，然后通过再次离心收集细胞。弃去上清液后，轻轻敲击离心管以松动沉淀，并将细胞重悬于300微升冰浴PBE缓冲液中，浓度为每300微升含一×10⁸个单个核细胞。加入100微升Fc受体阻断试剂以封闭非特异性结合，轻柔混匀，随后每一×10⁸个细胞加入100微升磁性激活细胞分选人CD34微珠试剂盒中的CD34微珠，轻柔混匀后，在4°C条件下孵育30分钟。在细胞孵育的同时，将LS柱和预分离滤器置于MACS分离器的磁场中。用2毫升预冷的PBE缓冲液平衡LS柱，用1毫升缓冲液平衡预分离滤器。让柱子中的液体流尽至一个15毫升锥形管中，弃去穿流液。孵育结束后，用新鲜的预冷PBE缓冲液将单个核细胞样品的终体积调至15毫升，通过离心沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升预冷的PBE缓冲液中，然后加载到柱子的预分离滤器上。用3毫升新鲜的预冷PBE缓冲液冲洗离心管，并将冲洗液加入预分离滤器中。每次加入三毫升冰预冷的PBE缓冲液，不带滤器，洗涤柱子四次，每次洗涤后让柱子完全排干。最后一次洗涤后，将柱子转移至新的15毫升离心管中，迅速将五毫升新鲜冰预冷的PBE缓冲液推过柱子进入离心管。为了确定新分离的CD34阳性造血干细胞和祖细胞中干细胞与祖细胞亚群的比例，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于50微升流式细胞术缓冲液中，调整细胞浓度至每50微升含1 × 10⁶个细胞。接下来，根据实验流式细胞术染色方案，将细胞以每份50微升分装至每只5毫升的荧光激活细胞分选管中。向细胞中加入适量的抗体混合物以及活/死细胞染色试剂，调整总体积至100微升。在避光条件下孵育20分钟后，每管加入1毫升新鲜的流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于每管500微升新鲜的流式细胞术缓冲液中。然后根据标准流式细胞术方案，使用流式细胞仪分析细胞。为了将微珠分离得到的CD34阳性干细胞和祖细胞分化为髓系细胞，首先在室温下用200微升/孔的PBS中重组人纤维连接蛋白溶液，孵育无菌未包被的48孔板，持续2小时。孵育结束后，弃去每孔中的纤维连接蛋白溶液，并用200微升的2%牛血清白蛋白封闭各孔。室温孵育30分钟后，用500微升无菌PBS洗涤孔板两次。将新分离的CD34阳性细胞重新悬浮于预热的刺激培养基中，浓度为每毫升5×10⁵个细胞。随后，将200微升细胞悬液接种至纤维连接蛋白片段包被的培养板的每个孔中，并将培养板置于细胞培养箱中孵育48小时。孵育结束后，用移液器轻柔吹打收集细胞，并用500 µL预热的DMEM培养基洗涤各孔，将洗涤液与细胞悬液合并。计数后，将细胞重悬于髓系分化培养基中，浓度为2.5 × 10⁴ 个细胞/毫升。每孔加入200 µL CD34阳性细胞，接种于已铺有MS-5基质细胞的48孔组织培养板中。然后将培养板放入细胞培养箱中，每隔三到四天，轻轻吸出每孔中的100微升上清液，并加入100微升新鲜的2倍浓度髓系分化培养基。在第21天，收集细胞，按照前述方法通过流式细胞术分析髓系谱系标志物的表达情况。通过磁珠分离法从脐带血中分离得到的CD34阳性细胞的典型比例范围为80%至90%。免疫表型分析显示，这些CD34阳性细胞通常包含约20%的谱系阴性、CD34阳性、CD38阴性的造血干细胞群体，以及72%的谱系阴性、CD34阳性、CD38阳性多能祖细胞群体。在多能祖细胞群体中，约25%的细胞表达共同髓系祖细胞标志物，约15%表达粒细胞-单核细胞祖细胞标志物，约56%表达巨核细胞-红系祖细胞标志物。免疫表型分析还显示，CD34阳性细胞的比例从分离时的约90%下降至第21天的低于25%。对CD34阴性细胞群体的分析表明，表达成熟髓系谱系标志物的细胞比例随之上升。此外，Wright-Giemsa染色的细胞在第1天和第21天表现出明显的形态学特征：未分化的细胞群具有大而圆的细胞核和极少的细胞质，而分化的细胞群则显示出单核细胞、粒细胞和成红细胞等谱系细胞的形态学特征。请注意，将稀释后的脐带血加入单个核细胞分离介质时，切勿混匀各层，换液时也应避免扰动MS-5细胞和CD34阳性细胞。按照此分化方案操作后，可对CD34阳性细胞培养物进行分析，评估其形态学变化、凋亡效应、细胞周期模式的改变以及分化程度。

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发育生物学

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