Name: 通过叶反射和叶绿素荧光分析同步测量的光合行为评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解同步测量叶绿素荧光与叶片反射率的方法，用于实时监测拟南芥在自然条件下的光合行为变化。该技术可建立新型反射参数，助力植物生理学研究。

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我们感谢东北大学的 Kouki Hikosaka 博士在讨论、实验空间及实验仪器方面提供的宝贵帮助。本工作部分得到了 KAKENHI [资助编号 18K05592、18J40098] 和内藤基金会的支持。

1. 拟南芥植株的培养
<ol>
	<li>将拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子放入微量离心管中，用灭菌的去离子水浸泡，并在4 °C避光条件下孵育2天。</li>
	<li>使用微量移液器将约四粒吸胀并经过低温处理的种子置于土壤表面。将播种后的花盆放入培养室中，在16小时光照（120 μmol photons m–2 s–1）、8小时黑暗的光周期条件下培养，光照期间温度为22 °C，黑暗期间为20 °C。</li>
	<li>种子萌发后，通过间苗使每盆保留一株植株，每批实验至少准备五个花盆。将植株在培养室中继续培养4周，实验中使用其中三株。</li>
	<li>选择最幼嫩且完全展开的成熟叶片进行光合作用测定。</li>
</ol>
2. 设置样品台、光合作用仪器和光源
注意：本实验方案使用了自行设计的样品台，用于固定叶片和检测探针（图1）。
<ol>
	<li>将一块带有直径为1 cm圆孔的10 cm2钢片固定在定制的样品台上。该钢片上的孔径可根据不同的叶片样本或植物种类进行调整。样品台配备有用于固定检测探头的夹具，以及用于调节探头与叶片样本之间距离的调节装置。</li>
	<li>准备用于测量叶绿素荧光和叶片反射率的细光纤探头。这两个细光纤探头将被紧密放置，以确保从叶片的同一位置获取信号。 
	注意：采用脉冲振幅调制（PAM）叶绿素荧光仪和光谱辐射计分别检测叶绿素a荧光和叶片反射率。这两种仪器分别使用直径为1 mm和2 mm的细光纤探头。</li>
	<li>将这两个探头紧密贴合后，用塑料胶带包裹固定。</li>
	<li>使用同轴透镜架将包裹好的探头夹在样品台上（见图1），并使其垂直于叶片表面。 
	注意：光谱辐射计中光纤电缆的视场角为α = 25°。在本方法中，光纤探头尖端与叶片表面的距离小于1 cm，因此测量的叶片区域面积几乎与光纤探头的端面面积相同。</li>
	<li>将由玻璃纤维制成的分叉式导光管连接至卤素光源，并以约45°的角度从两侧照射样品台。 
	注意：采用卤素灯作为激发光，其波长分布接近自然日光，可用于诱导光合作用。卤素光源配备内置冷滤光片，可滤除近红外区域的长波长成分，从而防止叶片表面温度升高（λ = 400 至 800 nm）。</li>
	<li>调节光源位置，使光线均匀照射样品台，避免产生阴影。</li>
</ol>
3. 设置叶片反射率与叶绿素荧光的同时测量
注意：所有步骤均在暗室中进行，以避免检测到除作用光以外的其他光线。在实际测量前，应关闭弱绿光（例如，用绿色玻璃纸包裹的光源）。
<ol>
	<li>测量叶片样品与样品台探头之间的距离。
	<ol>
		<li>在暗处将一片测试叶片放置在样品台的叶片夹持器上。将叶片压紧在样品台的钢板上（见图1中的黑色方块）。</li>
		<li>打开PAM，用测量光照射叶片样品。通过PAM控制软件确认叶绿素荧光强度的数值（参见材料表）。</li>
		<li>调节调节装置，使荧光强度读数约为100。测量探头与叶片之间的距离。固定调节装置，并记录调节器上的距离数值。</li>
		<li>关闭测量光，取下测试叶片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量激发光的辐照强度 
	注意：为观察光依赖性光合行为，需使用不同强度的激发光照射叶片样品。
	<ol>
		<li>将一个光量子计放置在样品叶片应处的位置。</li>
		<li>开启卤素光源照射，并测量其光强。</li>
		<li>确定光源调节旋钮的哪些位置可分别产生30、60、120、240和480 μmol photons m–2 s–1的光强。 
		注意：拟南芥植株在120 μmol photons m–2 s–1条件下生长，因此选择这些激发光强度以覆盖较小和较大的光强范围。</li>
		<li>在旋钮上标记各个辐照强度对应的位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量反射标准板。 
	注意：需要使用反射标准板，以计算在每种辐照强度下的叶片反射率。
	<ol>
		<li>将一块白色板作为反射率标准，放置在叶片样品的位置。</li>
		<li>打开光谱辐射计。光谱辐射计控制软件显示反射信号。此时由于无照射光，尚无光谱数据。</li>
		<li>开启卤素灯，以480 μmol photons m–2 s–1照射，此为本实验中的最高辐照强度。</li>
		<li>调节辐射计的检测强度，避免信号饱和。</li>
		<li>在30、60、120、240和480 μmol photons m–2 s–1辐照条件下，以1 nm为间隔记录450–850 nm波长范围内的光谱反射率。 
		注意：每次光谱测量时均校正并扣除基线电信号（暗电流）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 叶片反射率和叶绿素a荧光的同时测定及光合参数的计算
<ol>
	<li>将植物置于叶片样品位置。
	<ol>
		<li>将拟南芥植株从生长培养箱转移至温度和湿度与生长培养箱相同的受控暗室中。</li>
		<li>在22 °C黑暗条件下孵育植株1小时，以耗散PSII反应中心的电子并解除非光化学淬灭。</li>
		<li>将已暗适应的整株植物放置在样品台下方的实验升降台（图1）上。</li>
		<li>将样品叶片固定在叶夹上，使叶片表面与检测探头垂直。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定PSII的最大光量子产量。
	<ol>
		<li>打开PAM仪器并开始记录曲线。该值记为 0。</li>
		<li>开启测量光，等待约30秒直至曲线响应稳定。该值记为 F0。</li>
		<li>由PAM提供强度为4000 μmol photons m–2 s–1、持续0.8秒的饱和脉冲。</li>
		<li>获取荧光强度上升曲线中最高点的数值。该值记为 FM。</li>
		<li>利用以下公式计算暗适应状态下PSII的最大光量子产量（FV/FM）。 
		FV/FM = (FM – F0) / FM</li>
	</ol>
	</li>
	<li>稳态下光合行为的测定。
	<ol>
		<li>在记录完 FM 后（见4.2.4），打开卤素灯作为外部光源，同时保持测量光开启。首先以最弱光照（30 μmol photons m–2 s–1）照射叶片样品。</li>
		<li>同时开启光谱辐射计以监测叶片反射率。</li>
		<li>在光照条件下等待20分钟或更长时间，使光合反应达到稳态。稳态下的荧光强度记为 Fs。</li>
		<li>在持续光照期间，每隔1分钟施加一次饱和脉冲。脉冲光下获得的最大荧光值记为 FM′。</li>
		<li>记录开启持续光照20分钟后 FM′ 的数据。</li>
		<li>通过在优化积分时间下进行10次扫描并扣除暗电流，取平均值得到叶片反射率数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>稳态下光合参数的计算。
	<ol>
		<li>计算PSII光化学的量子产额（ΦPSII），可通过在持续光照下施加饱和脉冲进行估算，使用以下公式： 
		ΦPSII = (FM′ – FS) / FM′</li>
		<li>按如下方式估算来自PSII反应中心的线性电子通量（LEF）4。 
		LEF = 持续光照的辐照强度 × ΦPSII × 0.5 × 0.84</li>
		<li>使用以下公式计算NPQ（非光化学淬灭），其可表示热耗散： 
		NPQ = (FM – FM′) / FM′ 
		注：光能主要被光合作用反应消耗。然而，当植物吸收的光能超过光合作用所能利用的能量时，会诱导热耗散机制以避免能量过剩。</li>
		<li>利用在相同光照条件下通过辐射计获取的光谱数据，按如下方式计算叶片反射率比： 
		反射率比 = Rleaf / Rstandard</li>
		<li>根据531 nm和570 nm波长计算PRI。这两个波长从反射率比中提取： 
		PRI = (R531 – R570) / (R531 + R570) 
		注：R 表示反射率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非光化学淬灭弛豫动力学的测定。
	<ol>
		<li>在获取 Fs 和叶片反射率后关闭持续光照。</li>
		<li>关闭光照后，使用PAM监测叶绿素荧光10分钟。</li>
		<li>在暗弛豫期间，每隔1分钟施加一次饱和脉冲。在暗条件下由饱和脉冲诱导的最大荧光值记为 FM′′。一次测试中获取十个 FM′′ 数据。</li>
		<li>保存关闭持续光照后2分钟和10分钟时的 FM′′ 数据。</li>
		<li>重新开启持续光照，并将光强设置为下一个梯度（60 μmol photons m–2 s–1）。</li>
		<li>重复进行20分钟的光适应和10分钟的暗弛豫，期间每隔1分钟施加一次饱和脉冲。按上述方法记录所有数据。依次在120、240和480 μmol photons m–2 s–1 的光照强度下重复全部步骤和测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据弛豫动力学计算非光化学淬灭各组分参数。 
	注：依赖光诱导的NPQ在关闭光源后逐渐弛豫13。通过调节弛豫的时间尺度，可对NPQ的不同功能组分进行分离。
	<ol>
		<li>利用2分钟暗适应后的 FM′′ 估算qE（能量依赖性淬灭）组分： 
		qE = (FM2m′′ – FM′) / FM′ 
		注：qE组分在1–2分钟内迅速逆转。该组分主要包括PsbS蛋白的质子化以及部分叶黄素循环转化，二者均依赖类囊体膜上的光诱导ΔpH梯度13。当该质子梯度消散时，这些过程可逆。</li>
		<li>利用10分钟暗适应后的 FM′′ 计算qZ（玉米黄质依赖性淬灭）组分： 
		qZ = (FM10m′′ – FM′) / FM′ 
		注：持续光照关闭后约10分钟的NPQ弛豫动力学反映叶黄素循环过程14。大部分叶黄素转化在约10分钟的时间尺度上逆转（即qZ），因为该转化需要VDE（紫黄质脱环氧化酶）的酶促反应。该组分也随类囊体膜上ΔpH梯度的消散而弛豫。</li>
		<li>按如下方式计算qI（光抑制状态）： 
		qI = (FM – FM10m′′) / FM′ 
		注：NPQ各组分中最慢恢复的部分被认为是PSII的光损伤（反映D1蛋白周转）。这种光抑制状态（qI）在10分钟内无法恢复15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们通过同时测量叶绿素荧光和叶片反射率，获得了进一步的证据，表明PRI反映了叶黄素色素的变化。
卤素光源的波长与太阳光相似，被用作激发光合作用的激发光源。我们最初使用白色LED光源以避免叶片表面产生热损伤，但这导致暗恢复动力学过程缓慢，并出现异常高的qI（光抑制淬灭），可能是由于对PSII造成了光损伤。因此，我们改用带有内置冷滤光片的卤素灯以减少热量产生。该光源未引起暗恢复过程或qI的任何异常。
本方法中最重要的变量是叶片、光源与检测探头之间的相对位置关系。我们曾尝试从光源正对叶片上方照射，同时从不同对角角度测量叶绿素荧光和叶片反射率。然而，检测信号的强度随角度变化而有所不同。为避免这种变异性，探头被固定在叶片样品正上方（图1）。光源通过分叉光纤输送，从左右两侧同时照射叶片表面，以产生均匀的照射光（图1）。
对叶片反射率的研究主要被应用于生态...

叶片反射率被用于遥感监测反映植物光合作用或植物性状的植被指数1,2。归一化差异植被指数（NDVI）基于红外反射信号，是检测与叶绿素相关特性的最广为人知的植被指数之一，在生态学和农业科学中被用作指示树木或作物对环境响应的指标3。在野外研究中，尽管已开发并使用了许多参数（例如叶绿素指数（CI）、水分指数（WI）等），但利用突变体对这些参数直接（或间接）检测内容进行的详细验证仍较少。
利用脉冲振幅调制（PAM）法分析叶绿素荧光是测量光系统II（PSII）中光合作用反应及相关过程的有效方法4。叶绿素荧光可通过相机检测，并用于筛选光合作用突变体5。然而，相机检测叶绿素荧光需要复杂的操作步骤，例如暗处理或光饱和脉冲，这些在野外研究中难以实施。
叶片吸收的太阳光能主要被光合作用反应所利用。相比之下，过量光能的吸收会产生活性氧物种，从而对光合分子造成损伤。过量的光能必须通过非光化学猝灭（NPQ）机制以热的形式耗散6。光化学反射率指数（PRI）反映了叶片反射率参数对光的依赖性变化，其基于531 nm和570 nm（参考波长）处的窄波段反射率计算得出7,8。已有研究报道，PRI与叶绿素荧光分析中的NPQ存在相关性9。然而，由于NPQ是一个复合参数，包含叶黄素循环、状态转换和光抑制等多个组分，因此需要进行详细验证，以明确PRI参数所反映的具体生理过程。我们重点关注叶黄素循环，该过程是一种热耗散系统，涉及叶黄素色素的脱环氧化反应（紫黄质转化为花药黄质和玉米黄质），是NPQ的主要组成部分，因为先前研究已报道PRI与这些色素转化之间存在相关性8。
在拟南芥中已分离并鉴定了许多与光合作用相关的突变体。npq1 突变体由于在紫黄质脱环氧化酶（VDE）上存在突变，无法积累玉米黄质，而VDE催化紫黄质转化为玉米黄质10。为了确定光化学反射率指数（PRI）是否仅检测到叶黄素类色素的变化，我们在npq1突变体和野生型植株的同一叶片区域同时测量了PRI和叶绿素荧光，随后通过不同时间尺度的暗适应弛豫过程解析非光化学猝灭（NPQ），以提取与叶黄素相关组分11。这些同步测量为植被指数的归因分析提供了一种有价值的技术。此外，由于PRI与总初级生产力（GPP）相关，能够将PRI精确归因于某一特定组分在生态学研究中具有重要意义12。

<table><tbody><tr><td>卤素光源</td><td>OptoSigma</td><td>SHLA-150</td><td></td></tr><tr><td>光量子计</td><td>LI-COR</td><td>LI-1000</td><td></td></tr><tr><td>PAM 叶绿素荧光仪</td><td>Walz</td><td>JUNIOR-PAM</td><td></td></tr><tr><td>PAM 控制软件</td><td>Walz</td><td>WinControl-3.27</td><td></td></tr><tr><td>反射率标准板</td><td>Labsphere, Inc.</td><td>SRT-99-050</td><td></td></tr><tr><td>光谱辐射计</td><td>ADS Inc.</td><td>Field Spec3</td><td></td></tr><tr><td>光谱辐射计控制软件</td><td>ADS Inc.</td><td>RS&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

通过叶片反射率与叶绿素荧光分析的同步测量评估光合行为

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

叶绿素a荧光分析被广泛用于测量完整植株中的光合行为，并由此发展出许多能够高效评估光合作用的参数。叶片反射率分析在生态学和农业中提供了多个植被指数，包括光化学反射率指数（PRI），该指数可作为光合作用过程中热能耗散的指示指标，因其与非光化学淬灭（NPQ）相关。然而，由于NPQ是一个复合参数，需对其进行验证以理解PRI参数的本质。为了获得评估PRI参数的生理学证据，我们同时测量了类胡萝卜素循环缺陷突变体（npq1）和野生型拟南芥植株的叶绿素荧光和叶片反射率。此外，通过监测关闭光照后NPQ的弛豫动力学，从叶绿素荧光分析结果中提取了可能反映类胡萝卜素循环的qZ参数。这些同步测量使用脉冲振幅调制（PAM）叶绿素荧光仪和光谱辐射计完成。两台仪器的光纤探头被放置在彼此靠近的位置，以检测来自叶片相同位置的信号。采用外部光源激活光合作用，而测量光和饱和光则由PAM仪器提供。该实验系统使我们能够在完整植株中监测光依赖性的PRI，并揭示野生型与npq1突变体之间PRI的光依赖性变化存在显著差异。此外，PRI与qZ之间表现出强相关性，表明qZ能够反映类胡萝卜素循环。综上所述，这些测量结果表明，同步测量叶片反射率和叶绿素荧光是评估参数的一种有效方法。

图1展示了同时测量叶绿素荧光和叶片反射率的实验装置示意图。脉冲振幅调制（PAM）仪和光谱辐射计的光纤探头垂直于叶片夹持器上的叶片表面放置，该夹持器位于定制的样品台上；同时使用卤素灯从左右两个方向提供无阴影的激发光照射。PAM信号和叶片反射率信号分别由各自系统的软件进行检测。该实验系统用于比较拟南芥野生型（Col）与npq1突变体（缺乏玉米黄质）植株（图2）。将由叶片反射率计算得到的ΔPRI与通过PAM估算的光依赖性光系统II线性电子传递速率（LEF）进行对比（图2A）。已有报道指出，PRI不仅受叶黄素循环的影响，还受到类胡萝卜素的影响16。为仅观察光依赖性的PRI变化，对PRI进行了校正，即用各光强下的PRI值减去最低光强下的PRI值，得到ΔPRI11。结果表明，在野生型植株中，ΔPRI与LEF呈负相关，而在npq1...

我们介绍一种研究高等植物光合作用响应的新技术方法，该方法结合使用脉冲振幅调制（PAM）仪和光谱辐射计，同步测量拟南芥同一叶片区域的叶绿素a荧光和叶片反射率，以检测其信号。

叶绿素a荧光分析被广泛用于测量完整植物的光合作用行为，并已推动了许多……

利用已知的突变植物模型同时测量叶片反射率和叶绿素荧光，有助于建立新的反射率参数。通过本方法构建新的叶片反射率参数，可实现对自然环境条件下植物行为变化的实时监测。在开始实验之前，请按照此示意图搭建测量系统。使用样品台、光源、PAM 叶绿素荧光仪和光谱辐射计。接下来，将一块10 cm²的钢片（中央有一个直径为1 cm的孔）固定在定制的样品台上，并将两根细光纤探头紧密地并置在一起。用塑料胶带包裹探针，然后使用支架将缠好胶带的探针夹在样品台上。将探针垂直于样品台放置。将一根由玻璃纤维制成的双叉型导光管连接到卤素光源上。然后从大约45度角的两侧照射样品台。调节光源，使光线均匀地照亮样品台，且不产生阴影。在暗室中，使用绿玻璃纸光源，将待测植物放置于样品台的叶片夹持器上，并使叶片紧贴样品台钢板上的孔洞，以同时进行左侧反射率和叶绿素荧光分析。关闭微弱的绿光后，开启PAM荧光仪，并用测量光照射叶片样品。调节调节装置，使荧光强度约为100，然后测量探头与叶片之间的距离。固定调节器位置，并记录调节器上显示的距离数值。然后关闭测量光源，移除测试植株。进行作用光强度测量时，将光量子计置于待测叶片将要放置的位置。然后从卤素光源照射光线，以测量光源强度。确定光源调节旋钮的哪些位置可产生30、60、120、240和480微摩尔质子每平方米每秒的光强。将白色板作为反射标准物放置在叶片样品的位置。打开光谱辐射计。调节350至850纳米之间的光谱反射率。由于当前无照射光源，因此尚无光谱数据。打开卤素灯，以每平方米每秒480微摩尔光子的光照强度进行照射。本实验中的最高辐照强度，需调节辐射计的检测灵敏度以避免信号饱和。随后，在每平方米每秒30、60、120、240和480微摩尔光子的光照强度下，记录光谱反射率。为同时测量叶片反射率和叶绿素荧光，需将植物从生长室转移至温度和湿度相同的暗室中。一小时后，将一株拟南芥置于叶片采样位置，并固定待测叶片，使叶片表面与检测探头垂直。打开PAM叶绿素荧光仪并启动曲线记录。此数值称为零点。打开测量光，等待约30秒，使曲线产生响应。该值被称为 F 零。使用 PAM 提供强度为 4,000 微摩尔光子每平方米每秒、持续 0.8 秒的饱和脉冲，获得荧光强度上升曲线中峰值的最高值。该值称为 Fm。然后利用公式计算暗适应状态下光系统 II 的最大量子产额。为测量稳态下的光合作用行为，在记录 Fm 后，用每平方米每秒 30 微摩尔光子的光照照射叶片样品。同时打开光谱辐射计以监测叶片反射率。等待至少 20 分钟，使光合作用反应达到稳态。在该反应期间，每间隔一分钟施加一次饱和脉冲。稳态下的荧光强度称为Fs。经过20分钟脉冲光照射后达到的最大荧光值称为Fm′。记录此时的光谱反射率。为了计算稳态下的光合作用活性，需计算光系统II的量子产额，该值可通过在持续光照下施加饱和脉冲进行估算。随后，估算来自光系统II反应中心的线性电子传递通量。然后计算非光化学淬灭，并利用531纳米和570纳米处的反射率计算光化学反射指数。在获取 Fs 和叶片反射率后，关闭测量光，并在暗弛豫期间每隔一分钟提供一次饱和脉冲。在暗适应条件下，由饱和脉冲诱导的最大荧光值称为 Fm′′。在关闭测量光后的第 2 分钟和第 10 分钟记录 Fm′′ 数据并保存。根据弛豫组分计算非光化学淬灭参数，利用两分钟暗适应的Fm″数据估算qE。利用十分钟暗适应的Fm″数据计算依赖于玉米黄质的淬灭qZ。然后计算光抑制状态。接下来，打开60微摩尔光子/平方米/秒的测量光，重复相同的测量。在此代表性实验中，比较了野生型和突变型拟南芥植株。根据叶片反射率计算的光化学反射指数（PRI）的变化，与通过PAM荧光仪估算的光系统II的光依赖性线性电子传递速率进行对照作图。在本实验中，野生型植物的PRI变化与线性电子传递呈负相关，但在突变体植物中则无此相关性。代表叶黄素循环的qZ值通过非光化学淬灭的暗弛豫动力学分离获得，并同样与PRI的变化作图进行比较。在此分析中，两种植物品系的qZ值均与PRI变化高度相关，表明PRI能够反映叶黄素循环状态。使用相同的光源或光强对同一叶片区域进行同时测量时，应使用固定装置中的同一检测光纤将叶片垂直定位。反射光谱学可应用于分析多种表型，包括野生型和突变体植物，有助于阐明植物的分子机制。

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