使用自动化工作站进行质谱分析的血浆样本制备

该自动化工作流程可实现稳定且重现性优异的蛋白质酶解，并具有高通量优势，从而通过质谱技术提高了生物标志物发现、验证及临床应用的准确性和可靠性。该技术的优势在于，可在约五小时内完成96个样本的全流程处理，且大多数蛋白质在批内和批间检测中的变异系数（CV）均低于20%。

这种精确的高通量样品制备使我们能够大规模研究组织或生物流体的疾病蛋白质组。此外，自动化的蛋白质组样品制备流程为高通量和定量蛋白质组学分析提供了坚实的基础。本次实验操作将由西达赛奈医学中心高通量中心负责人Dr. Qin Fu博士以及我实验室的研究助理Mr. Casey Johnson先生进行演示。

开始分析前，向一个96孔圆底聚丙烯板中加入五微升混合的健康人血浆。所有样本加样完成后，打开液体处理设备软件，在方法选项卡下选择“归零所有轴”，以校准自动化液体处理系统。确认工作站所有注射器内无可见气泡，新建一个方法并点击“运行”以启动该方法。

在方法结束时，若要准备自动进样器板，请在“输入自动进样器提示所用值”处输入 true，然后点击确定。在“输入第一列提示所用值”处输入 1，然后点击确定。在“输入最后一列提示所用值”处输入 12，然后点击确定。如果使用的样品板中每个样品体积至少为 20 微升，请在“输入样品板提示所用值”处输入 true，然后点击确定。按照“引导式耗材设置”窗口中的指示操作，点击继续。将相应的试剂加入对应的孔中，然后点击下一步。再次点击下一步，按照图示布置自动化液体处理工作站的板位，包括试剂板、反应板、样品板和自动进样器板、六个装有 90 微升吸头的六孔盒、一个空的 90 微升吸头盒以及一个装满的 230 微升吸头盒。

然后单击“完成”以开始方法。在离心步骤后的提示处，取出反应板并将其放入离心机中。离心结束后，将反应板放回自动化液体处理系统的指定位置，然后单击“继续”。

进行液相色谱串联质谱分析时，采用高流速高压液相色谱法，以每分钟 250 µL 的流速，将肽段在 C18 2.1 × 100 毫米 3.5 µm 柱上分离，并在线导入三重四极杆质谱仪进行分析。上样后 5 分钟，用 5% 缓冲液 B 平衡色谱柱，随后在 30 分钟内采用 5–35% 缓冲液 B 的线性梯度洗脱肽段。洗脱结束后，先用 98% 缓冲液 B 冲洗色谱柱 10 分钟，再用 5% 缓冲液 B 冲洗 5 分钟，然后上载下一个样品。

进行在线分流时，使用一个两相切换阀将柱后流出液在进入离子源之前引向废液。当所有样品均被洗脱后，可对多重反应监测数据进行处理。在此代表性分析中，监测了来自添加的β-半乳糖苷酶和经处理的血浆白蛋白蛋白的三种β-半乳糖苷酶肽段和两种白蛋白肽段。

自动化样品制备流程的精密度通过总蛋白质组学选择反应监测流程的变异系数百分比减去液相色谱串联质谱的变异系数百分比来计算。如预期，人血清白蛋白和β-半乳糖苷酶蛋白均观察到良好的信号强度。为监测液体转移步骤的精密度，可在独立的试剂转移步骤中分别加入稳定同位素标记的肽标准品，用于内源性人血清白蛋白和外源性β-半乳糖苷酶蛋白。

为验证自动化蛋白质组学样品制备流程，从同一天制备的21个孔中计算日内变异系数值。40种蛋白质的平均日内百分比变异系数范围为4-20%。为评估基于孔板的自动化工作流程的边缘效应，可从指定列和行中的特定孔计算百分比变异系数。在此代表性实验中，所有列和行配置中的多反应监测信号强度相似，百分比变异系数范围为3-22%。最关键的步骤是根据所需的96孔板图正确添加样品，并根据软件指令正确设置试剂板。

这种自动化的蛋白质组学样品制备方法使研究人员能够大规模地获得可靠且定量的蛋白质组学数据。