Name: 使用自动工作站进行质谱测量的等离子体样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 了解使用自动工作站进行血浆蛋白质酶解的高通量质谱样品制备方法。该流程可在约五小时内处理96个样本，批内和批间变异系数低于20%，为大规模定量蛋白质组学分析提供可靠基础。

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<ol><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li>
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质谱分析的样品处理需要对蛋白质进行变性、还原和烷基化以封闭半胱氨酸，以及通过胰蛋白酶消化将蛋白质切割成肽段。每一步化学或酶促反应都需要在指定时间启动，并在受控温度下进行，而该过程的每一步都涉及多个液体转移步骤，可能引入实验变异。自动化样品处理为此难题提供了解决方案。目前可用的液体处理系统能够以小于5%的准确度和精密度将试剂转移至96孔板中（具体取决于所使用的加样头和吸头类型），并可在14 °C至70 °C的受控温度下对样品进行孵育，必要时还可伴随振荡。我们采用自动化液体处理设备以96孔板格式对血浆样品进行SRM检测的处理。
血清、血浆及其他生物样本中的蛋白质复杂混合物内含有成千上万个蛋白酶切割位点；而每种蛋白质均有其独特的性质，影响切割位点的可及性以及所产生的肽段的稳定性。因此，不可能设计出一种对所有蛋白质均最优的样品处理流程。最佳替代方案是尽可能保持操作的一致性。
为了确保一致性，我们对自动液体处理仪执行的每一步移液操作进行了优化。首先，我们综合考虑了所需体积以及液体类型（血浆、水相或有机相）及其相应性质（黏度、内聚力和挥发性）、硬件（工作站移液头和板夹持臂）和耗材带来的限制。随后，我们调整了吸液时的速度和尾随气隙、分配时的速度和吹出体积，以及混合的力度和持续时间，并在必要时加入吸液和/或分配后的吸头触碰操作，以去除附着在吸头外表面的液体（图13，补充表1）。每种试剂中均加入了一种预先筛选过稳定性的独特稳定同位素标记肽（SIL肽），以便监测每一步液体处理操作的精密度。优化后，大多数 transitions 的过程变异系数（CV）低于10%，表明该自动化工作站具有良好的重复性（图9、图10、图11 和 图12）。
此处介绍的自动化工作流程与手动方法相比，可实现更稳定的一致性酶解，并提高了可重复性和通量（图9，图10）。该方法有望通过质谱技术提高生物标志物发现与验证的准确性和可靠性。

基于质谱（MS）的蛋白质和肽段定量正越来越多地被用作基础研究和临床实验室中血浆分析的一种生物分析工具2，3。随着质谱技术因其能够在单次质谱运行中定量数百种肽段的能力，成为靶向特定肽段序列以定量蛋白质或修饰蛋白质的首选方法，相关的仪器设备和信息学工具也迅速发展4。样品制备是任何蛋白质组学分析的基础。在质谱分析之前，生物样品中的蛋白质通常需要经过变性、还原、烷基化、胰蛋白酶消化成肽段以及脱盐等步骤5。烷基化可阻断半胱氨酸，防止发生不受控的修饰，并确保所有半胱氨酸具有相同的质量。随后加入胰蛋白酶将蛋白质消化为肽段。这些步骤中的每一步都需要优化，而整个过程传统上由人工操作完成，容易引入分析误差。
传统的生物标志物开发流程主要包括两个过程：采用鸟枪法蛋白质组学进行全局性蛋白质发现，以建立深入的蛋白质清单6，以及采用靶向蛋白质组学进行验证与确证，旨在实现高精度和高通量的蛋白质定量7。无论采用何种质谱（MS）方法，样品制备流程均相同，其核心是通过酶解将蛋白质裂解为肽段混合物。根据 Van Eyk 和 Sobhani8 的建议，为有效推动发现阶段的生物标志物进入临床应用检测，需要建立一种能够对发现型和靶向型检测均实现准确、精确且可重复分析的方法。实现样品制备的自动化将有助于提升向高通量分析转化的效率。手动操作方法通常会引入超出美国食品药品监督管理局（FDA）在修订版《生物分析方法验证指南》中规定的可接受限值的分析误差，该指南涵盖生物标志物和诊断检测2,9。为促进需要制备和分析数千份生物样本的生物标志物研究，建立一种快速、高准确度且无需人工干预的质谱蛋白质样品制备流程十分必要。质谱样品制备步骤繁多，易引入误差，且过程繁琐耗时。
在我们改进的方法中，自动化工作站被编程以执行所有必要的血浆样本制备步骤，总共分为6步（图1），以确保：1）液体转移的准确性；2）反应在一致的时间启动和终止；3）反应在受控温度（即孵育器）下进行；4）所有反应均实现均匀混合。我们还引入了外源性质量控制蛋白和内标物（稳定同位素标记的肽段标准品），以确保在96孔板格式下基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质和肽段定量具有高质量和可重复的通量。若包括试剂制备，手工处理96个样本所需的工时和总计约1,000,000次移液操作需在单个离心管中完成。自动化显著减少了人工操作时间和人为干预次数。

<table><tbody><tr><td>混合健康人血浆</td><td>Bioreclamation Inc.</td><td></td><td>文中测试的人血浆样本</td></tr><tr><td>乙腈，HPLC级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A998SK1</td><td>LC MS/MS溶剂</td></tr><tr><td>大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶重组蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3153-5MG</td><td>外源性对照蛋白</td></tr><tr><td>Biomek i7 自动化工作站</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>蛋白质组学样品制备工作站：Biomek自动化工作站未被设计或验证用于疾病或其他状况的诊断</td></tr><tr><td>Biomek i系列 230&amp;micro;L非无菌吸头</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B85903&amp;nbsp;</td><td>吸头，i7耗材</td></tr><tr><td>Biomek i系列 90&amp;micro;L非无菌吸头</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B85881&amp;nbsp;</td><td>吸头，i7耗材</td></tr><tr><td>FG，TPCK处理的胰蛋白酶试剂盒</td><td>Sciex</td><td>4445250</td><td>消化反应中使用的胰蛋白酶</td></tr><tr><td>硬壳96孔PCR板，低矮型，薄壁，带裙边，绿色/透明&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>#hsp9641</td><td>自动进样器板</td></tr><tr><td>正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9882-5G</td><td>消化过程中使用的去垢剂</td></tr><tr><td>聚丙烯96孔圆底深孔板，无菌</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>267007</td><td>试剂和消化反应板</td></tr><tr><td>Prominence UFLCXR 高效液相色谱系统</td><td>Shimadzu, Japan</td><td></td><td>高流速液相色谱系统</td></tr><tr><td>QTRAP 6500</td><td>SCIEX</td><td></td><td>质谱仪</td></tr><tr><td>水，HPLC级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W54</td><td>LC MS/MS溶剂</td></tr><tr><td>Xbridge BEH30 C18 2.1 mm × 100 mm</td><td>Waters</td><td>186003564</td><td>LC MS/MS色谱柱</td></tr></tbody></table>

使用自动化工作站进行质谱分析的血浆样本制备

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

蛋白质组学中用于质谱分析的样品制备需要通过酶切将蛋白质消化为肽段混合物。该过程涉及多个孵育和液体转移步骤，以实现蛋白质的变性、还原、烷基化和酶切。将此流程应用于自动化工作站可提高效率并降低变异系数，从而为不同样品类型之间的统计学比较提供更可靠的数据。我们此前已报道过一种自动化的蛋白质组样品制备流程1。本文中，我们报告了一种更高效且更可控的流程的开发，具有以下优势：1）通过合并试剂，将液体转移步骤从九步减少至六步；2）采用具有多通道的96孔移液头进行选择性吸头移液，缩短移液时间；3）最多可达45个板位的配置提高了潜在通量；4）系统的完全封闭设计改善了温度和环境控制，并降低了样品或试剂污染的风险；5）向每个样品中添加稳定同位素标记的肽段以及β-半乳糖苷酶蛋白，可在整个流程中实现过程监控和质量控制。这些硬件和工艺改进为基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质和肽段定量提供了良好的重复性，并提高了板内和板间精密度（变异系数低于20%）。在96孔板中对96个样品进行完整消化的整个流程可在约5小时内完成。

本文介绍了一种用于基于质谱的定量蛋白质组学分析的自动化血浆蛋白质消化方法。在本方案中，蛋白质变性、还原、烷基化及胰蛋白酶消化反应中的液体转移和孵育步骤得到了简化并实现自动化。制备一块具有理想精密度的96孔板大约需要五小时。

蛋白质组学中用于质谱分析的样品制备需要将蛋白质酶解为肽段混合物。该过程涉及多个孵育和液体转移步骤，以实现蛋白质的变性、还原、烷基化和酶切。将此工作流程转移至自动化工作站可提高效率并降低变异系数，从而为不同样品类型之间的统计比较提供更可靠的数据。我们此前已描述了一种自动化的蛋白质组样品制备工作流程1。在此，我们报道了一种更高效且更可控的新工作流程，具有以下优势：1）通过合并试剂，将液体转移步骤从九步减少至六步；2）采用具有多通道的96通道移液头进行选择性吸头移液，缩短移液时间；3）最多可提供45个板位，提高潜在通量；4）系统完全封闭，可实现更优的温度与环境控制，并降低样品或试剂污染的风险；5）向每个样品中添加稳定同位素标记的肽段以及β-半乳糖苷酶蛋白，可在整个流程中实现过程监控与质量控制。这些硬件与流程的改进使基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质和肽段定量具有良好的重复性，并提高了板内和板间精密度（变异系数低于20%）。在96孔板中对96个样品进行完整消化的整个工作流程可在约5小时内完成。

该自动化工作流程可实现稳定且重现性优异的蛋白质酶解，并具有高通量优势，从而通过质谱技术提高了生物标志物发现、验证及临床应用的准确性和可靠性。该技术的优势在于，可在约五小时内完成96个样本的全流程处理，且大多数蛋白质在批内和批间检测中的变异系数（CV）均低于20%。这种精确的高通量样品制备使我们能够大规模研究组织或生物流体的疾病蛋白质组。此外，自动化的蛋白质组样品制备流程为高通量和定量蛋白质组学分析提供了坚实的基础。本次实验操作将由西达赛奈医学中心高通量中心负责人Dr. Qin Fu博士以及我实验室的研究助理Mr. Casey Johnson先生进行演示。开始分析前，向一个96孔圆底聚丙烯板中加入五微升混合的健康人血浆。所有样本加样完成后，打开液体处理设备软件，在方法选项卡下选择“归零所有轴”，以校准自动化液体处理系统。确认工作站所有注射器内无可见气泡，新建一个方法并点击“运行”以启动该方法。在方法结束时，若要准备自动进样器板，请在“输入自动进样器提示所用值”处输入 true，然后点击确定。在“输入第一列提示所用值”处输入 1，然后点击确定。在“输入最后一列提示所用值”处输入 12，然后点击确定。如果使用的样品板中每个样品体积至少为 20 微升，请在“输入样品板提示所用值”处输入 true，然后点击确定。按照“引导式耗材设置”窗口中的指示操作，点击继续。将相应的试剂加入对应的孔中，然后点击下一步。再次点击下一步，按照图示布置自动化液体处理工作站的板位，包括试剂板、反应板、样品板和自动进样器板、六个装有 90 微升吸头的六孔盒、一个空的 90 微升吸头盒以及一个装满的 230 微升吸头盒。然后单击“完成”以开始方法。在离心步骤后的提示处，取出反应板并将其放入离心机中。离心结束后，将反应板放回自动化液体处理系统的指定位置，然后单击“继续”。进行液相色谱串联质谱分析时，采用高流速高压液相色谱法，以每分钟 250 µL 的流速，将肽段在 C18 2.1 × 100 毫米 3.5 µm 柱上分离，并在线导入三重四极杆质谱仪进行分析。上样后 5 分钟，用 5% 缓冲液 B 平衡色谱柱，随后在 30 分钟内采用 5–35% 缓冲液 B 的线性梯度洗脱肽段。洗脱结束后，先用 98% 缓冲液 B 冲洗色谱柱 10 分钟，再用 5% 缓冲液 B 冲洗 5 分钟，然后上载下一个样品。进行在线分流时，使用一个两相切换阀将柱后流出液在进入离子源之前引向废液。当所有样品均被洗脱后，可对多重反应监测数据进行处理。在此代表性分析中，监测了来自添加的β-半乳糖苷酶和经处理的血浆白蛋白蛋白的三种β-半乳糖苷酶肽段和两种白蛋白肽段。自动化样品制备流程的精密度通过总蛋白质组学选择反应监测流程的变异系数百分比减去液相色谱串联质谱的变异系数百分比来计算。如预期，人血清白蛋白和β-半乳糖苷酶蛋白均观察到良好的信号强度。为监测液体转移步骤的精密度，可在独立的试剂转移步骤中分别加入稳定同位素标记的肽标准品，用于内源性人血清白蛋白和外源性β-半乳糖苷酶蛋白。为验证自动化蛋白质组学样品制备流程，从同一天制备的21个孔中计算日内变异系数值。40种蛋白质的平均日内百分比变异系数范围为4-20%。为评估基于孔板的自动化工作流程的边缘效应，可从指定列和行中的特定孔计算百分比变异系数。在此代表性实验中，所有列和行配置中的多反应监测信号强度相似，百分比变异系数范围为3-22%。最关键的步骤是根据所需的96孔板图正确添加样品，并根据软件指令正确设置试剂板。这种自动化的蛋白质组学样品制备方法使研究人员能够大规模地获得可靠且定量的蛋白质组学数据。

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使用自动工作站进行质谱测量的等离子体样品制备

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