Name: 分化肝细胞中的血管性脂细胞病的诱导和特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 了解在分化HepaRG细胞中使用油酸钠诱导肝脏囊性脂肪变性的方法，结合CARS显微镜和细胞荧光分析技术检测并定量脂质积累。该体外模型为研究肝脏代谢及相关疾病提供了可靠的实验工具。

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我们感谢法国里昂INSERM U871的Christian Trepo教授慷慨提供HepaRG细胞。我们感谢Rita Appodia在行政事务上的帮助。本研究由意大利教育大学研究部（MIUR- Ministero dell’istruzione, dell'università e della ricerca，项目编号FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC）以及罗马Sapienza大学（项目编号C26A13T8PS；C26A142MCH；C26A15LSXL）资助。

1. 培养基与试剂的制备
<ol>
	<li>增殖培养基：在William's E培养基中添加GlutaMAX、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、5 μg/mL胰岛素和0.5 μM氢化可的松半琥珀酸酯。</li>
	<li>分化培养基：在William's E培养基中添加GlutaMAX、10% FBS、1%青霉素/链霉素、5 μg/mL胰岛素、50 μM氢化可的松半琥珀酸酯和2% DMSO。</li>
	<li>冻存培养基：在增殖培养基中添加10% DMSO。</li>
	<li>油酸钠：用99%甲醇溶解至100 mM浓度，搅拌过夜，于-20 °C保存。</li>
	<li>油红O：配制储备液。称取0.35 g油红O，溶于100 mL异丙醇中，搅拌过夜，经0.2 µm滤膜过滤后，室温保存。配制工作液：取6 mL油红O储备液与4 mL ddH2O混合，室温静置20分钟，再用0.2 µm滤膜过滤。为获得理想的染色效果并避免背景干扰，强烈建议进行充分过滤。</li>
	<li>Bodipy（505/515）：将Bodipy（505/515）染料溶于DMSO中，配制成100 µM的储备液，避光保存于-20 °C，使用时稀释至终浓度为100 nM。</li>
	<li>为CARS实验获取透明玻璃底培养皿。</li>
</ol>
2. HepaRG 细胞的解冻、扩增与冻存
<ol>
	<li>将液氮冻存的HepaRG细胞放入37 °C水浴中快速解冻，直至完全融化。选择低代次批次（&#60;20代）。HepaRG细胞可从商业途径获得。</li>
	<li>迅速将细胞转移至含有10 mL增殖培养基的15 mL离心管中，于200 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用5 mL增殖培养基重悬细胞。</li>
	<li>计数细胞，并稀释至接种密度为2.5 × 104 个细胞/cm2。</li>
	<li>每2至3天更换一次培养基。细胞增殖倍增时间约为24小时。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，用0.05%胰蛋白酶溶液孵育3–5分钟使细胞脱落。用增殖培养基收集细胞，并于200 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用5 mL增殖培养基重悬细胞。</li>
	<li>计数细胞，并稀释至接种密度为2.5 × 104 个细胞/cm2。</li>
	<li>在此阶段，可通过重复步骤2.5–2.8扩增细胞，以获得足够数量的细胞用于实验起始，或按照步骤2.10进行冻存。</li>
	<li>如需冻存HepaRG细胞，于接种后24小时，用0.05%胰蛋白酶溶液孵育3–5分钟使细胞脱落。用增殖培养基收集细胞，并于200 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL/管冻存液中，每管含1.5 × 106 个细胞，随后将细胞管置于液氮中冻存。</li>
</ol>
3. HepaRG 细胞的分化（第 0–21 天）（图 1A）
<ol>
	<li>第0天。将HepaRG细胞以低密度（2.5 × 104 个细胞/cm2）接种于含适当体积增殖培养基的培养处理皿中（图1B）。每项检测（油红O染色、FACS分析、qPCR）需接种两个培养皿：一个用于对照细胞，另一个用于油酸处理的细胞。若需进行CARS检测（步骤8），则需平行接种于透明玻璃底培养皿中。作为对照，收集一个未经处理的培养皿（第0天增殖细胞），用于检测分化标志基因的基因表达（见步骤3.6）。</li>
	<li>第2天和第4天。更换为适当体积的增殖培养基，继续培养细胞至完全汇合。</li>
	<li>第7天。细胞必须达到100%汇合（图1C）。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，吸除PBS后加入适当体积的分化培养基。</li>
	<li>第8、9、12、15、18天。&#160;用1× PBS洗涤细胞一次，吸除PBS后加入适当体积的分化培养基。</li>
	<li>第21天。在显微镜下观察HepaRG细胞，确认细胞已形成完全汇合并完成分化的培养状态（图1D）。</li>
	<li>作为对照，收集一个对照培养皿（第21天分化细胞），用于进行分化标志基因的基因表达分析（步骤7）（图1E）。</li>
	<li>在第21天，分化的HepaRG细胞可于液氮中冷冻保存。</li>
</ol>
4. 诱导囊泡性脂肪变性（第21–26天）
<ol>
	<li>第21天。用适量的完全分化培养基将油酸钠（100 mM）稀释至终浓度为250 μM（1:400）。在另一份分化培养基中加入99%甲醇至1:400（与油酸钠等体积），以制备溶剂对照处理组。（例如：向10 mL培养基中加入25 μL油酸钠，同时平行向10 mL培养基中加入25 μL 99%甲醇）。用1×PBS洗涤细胞一次，然后加入溶剂对照或含油酸钠的培养基。</li>
	<li>第23天和第25天。按照步骤4.1的方法，更换为新鲜配制的适当体积的培养基。</li>
	<li>第26天。在光学显微镜下观察，可见油酸钠处理的细胞中脂滴在细胞质内聚集，并呈现为透明的小滴状结构，易于识别，如图2A所示。</li>
</ol>
5. 脂质过载与脂肪变性诱导的评估：油红O染色
<ol>
	<li>用 1× PBS 清洗细胞一次，并彻底去除 1× PBS。</li>
	<li>加入 4% 多聚甲醛（用 1× PBS 稀释），在室温下孵育 15 分钟。 
	注意：多聚甲醛具有毒性，因此该步骤必须在通风橱中进行，并佩戴包括手套、实验服和口罩在内的防护装备。</li>
	<li>去除多聚甲醛，用 1× PBS 清洗细胞两次。染色前可将细胞置于 1× PBS 中，4 °C 保存数天。用封口膜包裹并用铝箔覆盖，以防止细胞干燥。</li>
	<li>去除 1× PBS。在室温下用 60% 异丙醇孵育细胞 5 分钟。</li>
	<li>去除异丙醇，并在室温下让细胞完全干燥。</li>
	<li>加入 Oil Red O 工作液，在室温下孵育 30 分钟。每份样品所需的工作液体积应与培养细胞时所用的培养基体积相同。</li>
	<li>去除 Oil Red O 溶液，立即加入 ddH2O。用 ddH2O 洗涤细胞 4 次。</li>
	<li>在显微镜下获取图像以进行分析（图 2B）。</li>
	<li>如需洗脱 Oil Red O 染料：完全去除所有水分并使其干燥；加入 1 mL 100% 异丙醇，在室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。</li>
	<li>用移液器将含有洗脱 Oil Red O 染料的异丙醇反复吹打数次，确保所有 Oil Red O 均溶解于溶液中。将溶液转移至比色皿中。使用分光光度计测定 OD500 nm 值，并以 100% 异丙醇作为空白对照（图 2C）。</li>
</ol>
6. 脂质过载与脂肪变性诱导的评估：Bodipy 染色与流式细胞分析 &#160;
<ol>
	<li>用 1× PBS 洗涤细胞一次。在避光条件下，加入用 1× PBS 稀释的 100 nM Bodipy 溶液，37 °C 孵育 40 分钟。流式细胞术检测时应包括未染色对照样本。自此步骤起，应尽可能保护样本免受光照。 
	注意：每个样本所需的染色液体积应与培养细胞时所用的培养基体积相对应。</li>
	<li>去除染色液，用 1× PBS 洗涤细胞一次。随后进行步骤 6.3–6.6 进行 FACS（荧光激活细胞分选）分析，或进行步骤 6.7 进行显微镜成像。</li>
	<li>用 1× PBS 轻轻刮取细胞，并转移至 15 mL 离心管中。离心 10 分钟（200 × g，4 °C）。</li>
	<li>小心弃去上清液，避免扰动沉淀，加入 3 mL 1× PBS 洗涤。离心 5 分钟（200 × g，4 °C）。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 300 μL 1× PBS 中，然后转移至 FACS 管中。</li>
	<li>立即通过细胞荧光分析检测 Bodipy 荧光强度，激发/发射波长为 505/515 nm（图 3A,B）。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤细胞一次，并彻底去除 PBS。</li>
	<li>加入 4% 多聚甲醛（用 1× PBS 稀释），室温孵育 15 分钟。 
	注意：多聚甲醛具有毒性，因此该步骤必须在通风橱中进行，并佩戴防护装备，包括手套、实验服和口罩。</li>
	<li>去除多聚甲醛，用 PBS 洗涤样本 3 次，每次 5 分钟。细胞可置于 1× PBS 中于 4 °C 保存，或立即进行成像（图 3C）。如需储存，应用封口膜密封并用铝箔包裹，以防细胞干燥。</li>
</ol>
7. 脂质过载与脂肪变性诱导的评估：qPCR
<ol>
	<li>用 1× PBS 洗涤细胞一次。用 1× PBS 刮取细胞，200 × g 离心，弃上清液。此步骤中，细胞可于 -80 °C 保存，或按步骤 7.2 进行后续处理。</li>
	<li>使用商品化试剂，按照制造商说明书中的标准方法进行总 RNA 提取。</li>
	<li>通过紫外分光光度法测定 RNA 浓度，并根据 A260/A280 读数确保 RNA 纯度较高（接近 2.0）。</li>
	<li>使用标准 cDNA 合成试剂盒，从 1 μg 总 RNA 合成 cDNA。</li>
	<li>用 H2O 将 cDNA 稀释至终体积为 50 μL。</li>
	<li>对每个 cDNA 样本进行三复孔 qPCR 分析：配制一份 qPCR 预混液（表 1），总量足以满足每对引物所需的反应数，包括用于内参对照的三个看家基因特异性引物：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、肌动蛋白 B（actinB）和核糖体 18S（引物序列见 材料表）：</li>
	<li>在 PCR 多孔板的每孔中加入 18 μL 预混液。</li>
	<li>向每孔加入 2 μL cDNA 样本。密封反应板。</li>
	<li>按照热循环仪的操作说明运行样本。</li>
</ol>
8. 脂质过载与脂肪变性诱导的评估：CARS
<ol>
	<li>按照步骤 5.1–5.3 所述方法，对先前在玻璃底培养皿上制备的细胞进行固定。</li>
	<li>开启商用可调谐皮秒脉冲激光系统，并调节以获得两个不同波长的输出。两个输出之间的频率差必须为 2,840 cm-1，以产生对应于亚甲基对称伸缩振动的强相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）光信号；对于固定波长输出 1,064 nm（&#34;斯托克斯" 光），另一波长应调节至 817 nm（&#34;泵浦" 光）。</li>
	<li>确保 817 nm 输出与 1,064 nm 输出在空间和时间上重叠：使用适当的二向色镜（即在 817 nm 和 1,064 nm 之间具有分光截止特性的镜片）实现光束的空间合并，并使用光学延迟线实现激光脉冲的时间重叠。</li>
	<li>确保两个共传播光束均为准直状态，且其光束直径相近并适合显微镜光学系统的要求，以便将光束聚焦到样品上；如有必要，在合并光束的二向色镜之前分别对两束光进行准直。</li>
	<li>开启商用倒置显微镜系统，该系统应包含红外激光扫描单元和双通道反射式红/绿检测单元，并将共传播的激光束导入扫描单元。</li>
	<li>打开双通道反射式检测单元，取出滤光立方体，并将其红色波长检测滤光片更换为带通滤光片，以选择在 817/1,064 nm 泵浦/斯托克斯激发方案下中心波长为 663 nm 的 2,840 cm-1 CARS 信号。建议使用窄带宽（20 nm）滤光片，以避免收集到高强度的荧光背景信号。</li>
	<li>将培养皿放置于倒置 CARS 显微镜的载物台上，使用 100 倍油浸物镜，调节物镜的垂直位置以对细胞进行聚焦。</li>
	<li>设置显微镜软件，以在 127 μm × 127 μm 的视场范围内采集高分辨率（1024 × 1024 像素）图像。</li>
	<li>设置显微镜软件持续采集并实时显示 127 μm × 127 μm 视场的图像，并在优化图像采集参数的同时检查所显示的图像。确保激光功率平衡，以实现快速成像并尽量减少损伤；必要时在光路中插入适当的中性密度滤光片，并选择合适的像素驻留时间，以便在选定的激光功率条件下获得具有优良信噪比的图像。</li>
	<li>在优化条件下，采集并保存培养皿内多个不同视场的图像。可选地，可通过另一反射式检测器同时采集由绿光发射产生的多光子荧光图像（主要来自 817 nm 的双光子激发）。对每一块培养皿重复执行步骤 8.7–8.10。</li>
	<li>对于 CARS 图像分析，使用 ImageJ 的 FIJI 实现版本处理图像。在进一步分析前，对每幅图像应用“去斑点”功能（或类似的去噪工具），以在不损失细节的前提下提高信噪比。</li>
	<li>使用 FIJI 手动选择细胞，然后自动统计各分割后单个细胞内的脂滴数量，从而获得每个细胞以及每块培养皿整个图像数据集的脂滴面积和数量的统计结果。</li>
</ol>
9. MTT 细胞活力检测
<ol>
	<li>将分化后的HepaRG细胞以每孔100 μL终体积、密度为1 × 105 个细胞/孔的条件接种至96孔板中，使用分化培养基。</li>
	<li>接种24小时后，每孔加入99%甲醇（溶剂对照）以及用100 μL分化培养基稀释的100 μM、250 μM和500 μM油酸钠与棕榈酸钠处理细胞，每组设三个复孔。</li>
	<li>每隔24小时更换一次培养基，加入含99%甲醇或100 μM、250 μM、500 μM油酸钠与棕榈酸钠的100 μL分化培养基/孔。</li>
	<li>甲醇/油酸钠/棕榈酸钠处理96小时后，每孔加入用100 μL分化培养基稀释的2 μM阿霉素处理细胞，设三个复孔，作为对照。</li>
	<li>阿霉素处理18小时后，更换培养基为每孔100 μL新鲜分化培养基。</li>
	<li>向含细胞的96孔检测板各孔（含100 μL分化培养基）中加入20 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑（MTT试剂）（材料表）。另设无细胞的背景对照孔，每组三个复孔，每孔加入100 μL分化培养基和20 μL试剂。&#160;</li>
	<li>将96孔板置于37 °C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中孵育。</li>
	<li>加入MTT四氮唑试剂后分别孵育30、60和90分钟，使用96孔板读板仪在490 nm波长处测定吸光度。以无细胞对照孔的背景吸光度值扣除其他样品的吸光度值。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案描述了如何分化HepaRG细胞，以及如何通过油酸钠处理诱导细胞发生泡状脂肪变性（图1A）。事实上，与其他人肝细胞癌（HCC）细胞系相比，HepaRG细胞系表现出成人人类肝细胞的特征，是体外培养的原代人肝细胞的一种有价值的替代模型13,14,15。HepaRG细胞系已被广泛应用于肝脏细胞毒性研究、药物代谢研究以及病毒学研究15,16,22。
与 HepaRG 细胞相比，其他肝细胞癌（HCC）细胞系（如 HepG2、HUH7、HUH6 和 Hep3B）的代谢能力较低，缺乏大量肝特异性功能<sup class="xref...

肝脂肪变性定义为肝内甘油三酯脂滴中脂肪积聚，且脂肪含量至少占肝脏重量的5%。长期的肝内脂质蓄积是一种潜在可逆的过程，但可能导致肝脏代谢功能障碍、炎症以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进展，而NAFLD是全球许多地区慢性肝病的主要病因1,2。NAFLD是一种多因素疾病，可能发展为更具侵袭性的非酒精性脂肪性肝炎（NASH），后者可进一步进展为肝硬化，并在少数患者中发展为肝细胞癌（HCC）1,3。目前尚无获批的针对NAFLD的特异性治疗方法，饮食与生活方式干预的联合策略仍是NAFLD和NASH管理的基石4,5,6。
分子&#173;非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病过程中导致肝脂肪变性的潜在机制仍有待阐明7在此背景下，已开发出多种小鼠模型用于研究人类脂肪变性疾病的进展。这些模型种类繁多，各具优缺点，包括基因修饰、营养干预以及化学诱导模型，亦有结合多种方法的复合模型。经基因改造（转基因或基因敲除）的小鼠可自发形成肝病。但需注意的是，此类突变在人类中极为罕见，且单个基因的缺失或过表达（例如ob/ob小鼠）在分子层面上可能无法准确模拟多因素所致的人类疾病病因。8,9同样，通过饮食或药物干预在小鼠身上诱导的疾病可能无法模拟与人类非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发生相关的饮食所产生的人体效应。8然而，动物模型促进了人们对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的理解，目前这一方法仍是实验室研究中最常用的策略。尽管如此，动物模型中获得的结果在人体中的重复验证屡屡失败，导致临床转化效果不佳。10.
因此，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的体外模型在阐明NAFLD进展的分子机制方面可能发挥基础性作用，并且是筛选大量化合物的有力工具。原代细胞培养、永生化细胞系和肝活检已被广泛用于研究目的11。原代人肝细胞在很大程度上模拟了人类临床状况，但供体数量有限，且由于细胞的异质性，原代细胞培养的可重复性较差。这些因素，加上伦理和操作上的问题，导致原代人肝细胞的应用受到限制12。因此，肝细胞系成为一种便捷的替代方案，相较于原代培养具有多项关键优势：肝细胞系增殖稳定、寿命几乎不受限制，且表型稳定。此外，细胞系易于获取，其培养条件比原代肝细胞更简单，并已在不同实验室之间实现标准化。
本文详细描述了一种基于体外细胞的肝脏泡状脂肪变性模型，该模型由经脂肪酸钠油酸盐处理的肝细胞分化型HepaRG细胞构建而成。HepaRG细胞系源自一名患有丙型肝炎感染及Edmondson I级高分化肝肿瘤的女性患者14。HepaRG细胞系是一种人类双潜能前体细胞系，在2%二甲基亚砜（DMSO）诱导下可分化为两种不同表型的细胞：胆管样细胞和肝细胞样细胞。分化后的HepaRG细胞（dHepaRG）具有与成年肝细胞相似的部分特征和功能，并能稳定表达多种肝脏特异性基因，如白蛋白（Albumin）、醛缩酶B（AldolaseB）、细胞色素P450 2E1（CYP2E1）和细胞色素P450 3A4（CYP3A4）13（步骤3）。将dHepaRG细胞用脂肪酸盐钠油酸盐（250 μM）处理5天，可诱导细胞质内脂滴的形成，模拟脂肪肝的病理变化14,15,17,18（步骤4）。脂滴的积聚可通过油红O染色法轻松检测（步骤5），该方法使用一种溶酶体染料——油红O，其为脂溶性染剂，可将中性甘油三酯和脂质染成红橙色。为了高效定量脂肪变性dHepaRG细胞中的脂质含量，本文展示了使用4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚满（Bodipy 505/515）染色后的流式细胞荧光分析方法（步骤6）。Bodipy 505/515是一种亲脂性荧光探针，可定位于细胞内脂质小体，已被广泛用于脂滴标记19。此外，本文还介绍了如何通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测dHepaRG细胞中多个代谢相关基因的表达失调，从而评估脂肪变性程度（步骤7）。为进一步表征并定量钠油酸盐处理后脂滴的积聚情况，我们采用了相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像技术（步骤8），该创新技术无需标记即可实现对脂滴的可视化与定量分析20,21。

<table><tbody><tr><td>Hyclone HyClone 胎牛血清 II&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30066</td><td></td></tr><tr><td>William&amp;rsquo;s E 培养基（含 GlutaMAX&amp;nbsp;）</td><td>Thermofisher</td><td>32551087</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松半琥珀酸酯</td><td>SIGMA</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，二甲基亚砜</td><td>SIGMA</td><td>D2438&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>油酸钠</td><td>SIGMA</td><td>O7501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>SIGMA</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>SIGMA</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 505/515</td><td>Thermofisher</td><td>D3921</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>无RNA酶的DNA酶I</td><td>Promega</td><td>M198A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Willco Wells</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>油红O溶液</td><td>SIGMA</td><td>O625</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One 溶液</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;q-PCR 引物名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;序列&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACACB 正向引物</td><td>CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACACB 反向引物</td><td>CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin 正向引物</td><td>GCACTCTTCCAGCCTTCCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin 反向引物</td><td>AGGTCTTTGCGGATGTCCAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白蛋白 正向引物</td><td>TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白蛋白 反向引物</td><td>AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALDOB 正向引物</td><td>GCATCTGTCAGCAGAATGGA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALDOB 反向引物</td><td>TAGACAGCAGCCAGGACCTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOB 正向引物</td><td>CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOB 反向引物</td><td>&amp;nbsp;CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOC3 正向引物</td><td>CTCAGCTTCATGCAGGGTTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOC3 反向引物</td><td>GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPT1A 正向引物</td><td>TCATCAAGAAATGTCGCACG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPT1A 反向引物</td><td>GCCTCGTATGTGAGGCAAAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP2E1 正向引物</td><td>TTGAAGCCTCTCGTTGACCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP2E1 反向引物</td><td>CGTGGTGGGATACAGCCAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP3A4 正向引物</td><td>CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP3A4 反向引物</td><td>TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 正向引物</td><td>TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 反向引物</td><td>AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPAM 正向引物</td><td>TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPAM 反向引物</td><td>ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL6 正向引物</td><td>CCTGAACCTTCCAAAGATGGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL6 反向引物</td><td>ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDK4 正向引物</td><td>ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDK4 反向引物</td><td>TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN2 正向引物</td><td>TTGCAGTTGCCAATACCTATGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN2 反向引物</td><td>CCAGTCACAGTAGTCGTCACA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN4 正向引物</td><td>AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN4 反向引物</td><td>GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 正向引物</td><td>TCTAGCTCCTATACCACCACCA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 反向引物</td><td>TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 正向引物</td><td>TGCTCATCAACCGCAACGAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 反向引物</td><td>CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S 正向引物</td><td>CGCCGCTAGAGGTGAAATTC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S 反向引物</td><td>TTGGCAAATGCTTTCGCTC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在分化型heparg细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

肝脂肪变性是一种代谢功能障碍，由肝细胞内甘油三酯脂滴的积聚引起。过量脂肪积聚可导致非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），&#160;该疾病具有潜在可逆性，但也可能发展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并最终进展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。目前，肝细胞内脂质积聚与NASH进展、不可逆性肝损伤、纤维化、肝硬化乃至HCC之间的分子机制仍不明确。为此，已开发出多种体外和体内模型，以阐明导致NAFLD的病理过程。在本研究中，我们描述了一种诱导肝泡状脂肪变性的细胞模型，该模型由DMSO诱导分化的 HepaRG 人肝细胞系组成，并使用脂肪酸盐油酸钠进行处理。事实上，经油酸钠处理的 HepaRG 细胞在细胞质中积聚脂滴，并表现出典型的脂肪变性特征。这种体外人源模型为体内小鼠模型以及原代人肝细胞提供了一种有价值的替代方案。我们还比较了多种用于定量和评估 HepaRG 细胞脂质积聚的方法，包括油红O染色、流式细胞术Bodipy检测、通过qPCR进行的代谢相关基因表达分析，以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像。CARS成像结合了拉曼光谱的化学特异性（一种在材料科学领域广泛应用的化学分析技术）与高速、高分辨率非线性光学显微技术的优势，能够精确量化脂质积聚及脂滴动态变化。建立高效的体外泡状脂肪变性诱导模型，结合准确的脂质积聚定量与表征方法，有望通过识别分子标志物实现NAFLD的早期诊断，并推动新型治疗策略的开发。

本方案描述了一种通过油酸钠处理诱导并表征DMSO分化HepaRG细胞中泡状脂肪变性的高效方法（图1A）。
HepaRG 细胞的分化。 
为了有效诱导分化，必须将增殖期细胞以低密度（2.5 × 104 个细胞/cm2）接种于增殖培养基中。在低密度接种条件下，细胞活跃分裂，并呈现细长的未分化形态（图 1B）。细胞应在增殖培养基中培养 7 天，直至达到 100% 汇合度（图 1C）。经 2% DMSO 处理后，细胞开始分化，形成典型的肝细胞样克隆，周围环绕胆管上皮样细胞（图 1D）。分化的 HepaRG 细胞表达肝细胞特异性标志物，如白...

本研究中，我们描述了一种使用脂肪酸盐油酸钠在分化型HepaRG细胞中诱导肝泡性脂肪变性的详细方案，并介绍了脂质积聚的检测与定量方法，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像、细胞荧光分析、油红O染色以及定量PCR。&#160;

在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

肝脂肪变性是一种代谢功能障碍，由肝细胞内含甘油三酯的脂滴积聚所致。过量……

本方案描述了如何在已分化的 HepaRG 细胞中诱导肝泡状脂肪变性，以及检测和定量脂质积累的方法。这种体外人源细胞模型是体内小鼠模型和原代人肝细胞的有价值的替代方案。将液氮保存的低代次 HepaRG 细胞冻存管浸入 37 摄氏度水浴中，直至完全解冻。迅速将细胞转移至含有10毫升增殖培养基的15毫升离心管中。以5分钟离心后，弃去上清液，并将细胞重悬于5毫升增殖培养基中。计数细胞，并调整浓度以使每平方厘米接种250,000个细胞。将细胞接种于100毫米细胞培养皿中，每两到三天更换一次培养基。细胞增殖的倍增时间约为24小时。当HepaRG细胞达到80%融合度时，用0.05%胰蛋白酶溶液孵育3至5分钟，使细胞脱离。收集增殖培养基中的细胞，并如前所述离心五分钟。弃去上清液，用五毫升增殖培养基重悬细胞。再次计数细胞，并调整浓度，使每平方厘米接种250,000个细胞。在此阶段，通过重复这些步骤扩增细胞，以获得足够数量的细胞用于开始实验。如需冻存 HepaRG 细胞，可在接种后 24 小时，使用 0.05% 胰蛋白酶溶液孵育 3 至 5 分钟使细胞脱落。用增殖培养基收集细胞，并如前所述离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于每批1毫升的冻存液中，并将各批次在液氮中进行冻存。在第0天，将HepaRG细胞以每平方厘米250,000个细胞的密度接种至经培养处理的培养皿中，加入适量的增殖培养基。每项检测需接种两个培养皿，分别用于对照组细胞和油酸处理组细胞。在第二天和第四天，更换适量的增殖培养基，继续培养细胞直至其达到汇合状态。第七天时，细胞必须达到100%汇合。用1× PBS洗涤细胞一次。然后，吸除1X PBS，并加入适量的分化培养基。在第8、9、12、15和18天，每次加入适量分化培养基前，用1X PBS洗涤细胞一次。在第21天，在显微镜下观察HepaRG细胞，确保细胞已形成融合的分化培养物。作为对照，收获一个对照培养皿，用于进行分化标志基因的基因表达分析。在第21天，分化的HepaRG细胞可在液氮中冷冻保存。在第21天，用适量的完全分化培养基稀释油酸钠，使其终浓度为250 µM。取另一份分化培养基，按1:400的比例加入99%甲醇，配制阴性对照处理液。用1×PBS洗涤细胞一次，然后加入阴性对照液或油酸钠培养基。在第23天和第25天，更换为适当体积的新鲜配制的培养基。第26天，通过光学显微镜观察细胞。油酸钠处理的细胞中会积累脂滴，在细胞质中可清晰观察到透明的液滴状结构。进行油红O染色时，首先用1× PBS洗涤细胞一次，并彻底去除1× PBS。加入4%多聚甲醛，室温孵育15分钟。去除多聚甲醛，用1×PBS洗涤细胞两次。去除PBS后，加入60%异丙醇，室温孵育5分钟。去除异丙醇，并在室温下将细胞完全干燥。然后向细胞中加入油红O工作液，在室温下孵育30分钟。每个样本所需工作液的体积应与培养细胞时使用的培养基体积相同。移除油红O溶液，并立即加入双蒸水。用双蒸水洗涤细胞4次后，在显微镜下获取图像以进行分析。为洗脱油红O染料，需移除所有水分并使其干燥。然后，加入1毫升100%异丙醇，在室温下轻轻振荡孵育10分钟。用移液器将含有洗脱的油红O染料的异丙醇反复吹打数次，确保所有油红O均溶解于溶液中。将溶液转移至比色皿中。通过分光光度法在500纳米处测定光密度，以100%异丙醇作为空白对照。用1×PBS洗涤细胞一次。然后，在37摄氏度避光条件下，用100纳米摩尔浓度的Bodipy溶于1×PBS中孵育40分钟。流式细胞术检测中应包含未染色对照。去除染色液后，用1× PBS洗涤细胞一次。然后再次洗涤细胞，并彻底去除PBS。加入4%多聚甲醛，室温孵育15分钟。去除多聚甲醛，用PBS洗涤样本三次，每次五分钟。细胞可置于4°C的1×PBS中保存，或立即进行成像。储存时，用封口膜包裹，并用铝箔覆盖，以防止细胞干燥。为验证脂肪变性的诱导效率，使用油酸处理的和对照组的HepaRG细胞经油红O染色。染色后，脂滴可清晰可见，呈红色颗粒状。可通过分光光度法测定异丙醇洗脱的油红O染料来定量染色结果。从细胞中洗脱的油红O吸光度与细胞质脂滴的积累量成正比。油酸钠浓度和处理时间通过MTT比色法细胞活力检测确定。通过在490纳米处的吸光度来定量检测甲型产物，其值与培养物中活细胞数量成正比。将油酸钠处理与棕榈酸钠处理进行比较。以凋亡诱导药物阿霉素作为对照。为了定量分析油酸钠处理后细胞脂质含量的增加，使用Bodipy染料对脂滴进行染色。通过流式细胞荧光分析，可利用Bodipy的平均荧光强度来定量甘油三酯含量，油酸处理组细胞的荧光强度高于对照组细胞。这表明油酸处理后脂质有效积累。事实上，经Bodipy染色的细胞图像显示，油酸处理组细胞中出现明亮的绿色荧光脂滴，而在对照组细胞中则不可见。为进一步表征油酸钠处理后脂滴的积累情况，可按照文中所述方案进行CARS显微成像，该技术无需标记即可实现脂滴的定量分析。这种基于细胞的模型可能增进对非酒精性脂肪性肝病相关分子机制的理解，并有助于开发用于早期诊断的新标志物以及新的治疗策略。

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在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

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