在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

本方案描述了如何在已分化的 HepaRG 细胞中诱导肝泡状脂肪变性，以及检测和定量脂质积累的方法。这种体外人源细胞模型是体内小鼠模型和原代人肝细胞的有价值的替代方案。将液氮保存的低代次 HepaRG 细胞冻存管浸入 37 摄氏度水浴中，直至完全解冻。

迅速将细胞转移至含有10毫升增殖培养基的15毫升离心管中。以5分钟离心后，弃去上清液，并将细胞重悬于5毫升增殖培养基中。计数细胞，并调整浓度以使每平方厘米接种250,000个细胞。

将细胞接种于100毫米细胞培养皿中，每两到三天更换一次培养基。细胞增殖的倍增时间约为24小时。当HepaRG细胞达到80%融合度时，用0.05%胰蛋白酶溶液孵育3至5分钟，使细胞脱离。

收集增殖培养基中的细胞，并如前所述离心五分钟。弃去上清液，用五毫升增殖培养基重悬细胞。再次计数细胞，并调整浓度，使每平方厘米接种250,000个细胞。

在此阶段，通过重复这些步骤扩增细胞，以获得足够数量的细胞用于开始实验。如需冻存 HepaRG 细胞，可在接种后 24 小时，使用 0.05% 胰蛋白酶溶液孵育 3 至 5 分钟使细胞脱落。用增殖培养基收集细胞，并如前所述离心 5 分钟。

弃去上清液，将细胞重悬于每批1毫升的冻存液中，并将各批次在液氮中进行冻存。在第0天，将HepaRG细胞以每平方厘米250,000个细胞的密度接种至经培养处理的培养皿中，加入适量的增殖培养基。每项检测需接种两个培养皿，分别用于对照组细胞和油酸处理组细胞。

在第二天和第四天，更换适量的增殖培养基，继续培养细胞直至其达到汇合状态。第七天时，细胞必须达到100%汇合。用1× PBS洗涤细胞一次。

然后，吸除1X PBS，并加入适量的分化培养基。在第8、9、12、15和18天，每次加入适量分化培养基前，用1X PBS洗涤细胞一次。在第21天，在显微镜下观察HepaRG细胞，确保细胞已形成融合的分化培养物。

作为对照，收获一个对照培养皿，用于进行分化标志基因的基因表达分析。在第21天，分化的HepaRG细胞可在液氮中冷冻保存。在第21天，用适量的完全分化培养基稀释油酸钠，使其终浓度为250 µM。

取另一份分化培养基，按1:400的比例加入99%甲醇，配制阴性对照处理液。用1×PBS洗涤细胞一次，然后加入阴性对照液或油酸钠培养基。在第23天和第25天，更换为适当体积的新鲜配制的培养基。

第26天，通过光学显微镜观察细胞。油酸钠处理的细胞中会积累脂滴，在细胞质中可清晰观察到透明的液滴状结构。进行油红O染色时，首先用1× PBS洗涤细胞一次，并彻底去除1× PBS。

加入4%多聚甲醛，室温孵育15分钟。去除多聚甲醛，用1×PBS洗涤细胞两次。去除PBS后，加入60%异丙醇，室温孵育5分钟。

去除异丙醇，并在室温下将细胞完全干燥。然后向细胞中加入油红O工作液，在室温下孵育30分钟。每个样本所需工作液的体积应与培养细胞时使用的培养基体积相同。

移除油红O溶液，并立即加入双蒸水。用双蒸水洗涤细胞4次后，在显微镜下获取图像以进行分析。为洗脱油红O染料，需移除所有水分并使其干燥。

然后，加入1毫升100%异丙醇，在室温下轻轻振荡孵育10分钟。用移液器将含有洗脱的油红O染料的异丙醇反复吹打数次，确保所有油红O均溶解于溶液中。将溶液转移至比色皿中。

通过分光光度法在500纳米处测定光密度，以100%异丙醇作为空白对照。用1×PBS洗涤细胞一次。然后，在37摄氏度避光条件下，用100纳米摩尔浓度的Bodipy溶于1×PBS中孵育40分钟。

流式细胞术检测中应包含未染色对照。去除染色液后，用1× PBS洗涤细胞一次。然后再次洗涤细胞，并彻底去除PBS。

加入4%多聚甲醛，室温孵育15分钟。去除多聚甲醛，用PBS洗涤样本三次，每次五分钟。细胞可置于4°C的1×PBS中保存，或立即进行成像。

储存时，用封口膜包裹，并用铝箔覆盖，以防止细胞干燥。为验证脂肪变性的诱导效率，使用油酸处理的和对照组的HepaRG细胞经油红O染色。染色后，脂滴可清晰可见，呈红色颗粒状。

可通过分光光度法测定异丙醇洗脱的油红O染料来定量染色结果。从细胞中洗脱的油红O吸光度与细胞质脂滴的积累量成正比。油酸钠浓度和处理时间通过MTT比色法细胞活力检测确定。

通过在490纳米处的吸光度来定量检测甲型产物，其值与培养物中活细胞数量成正比。将油酸钠处理与棕榈酸钠处理进行比较。以凋亡诱导药物阿霉素作为对照。

为了定量分析油酸钠处理后细胞脂质含量的增加，使用Bodipy染料对脂滴进行染色。通过流式细胞荧光分析，可利用Bodipy的平均荧光强度来定量甘油三酯含量，油酸处理组细胞的荧光强度高于对照组细胞。这表明油酸处理后脂质有效积累。

事实上，经Bodipy染色的细胞图像显示，油酸处理组细胞中出现明亮的绿色荧光脂滴，而在对照组细胞中则不可见。为进一步表征油酸钠处理后脂滴的积累情况，可按照文中所述方案进行CARS显微成像，该技术无需标记即可实现脂滴的定量分析。这种基于细胞的模型可能增进对非酒精性脂肪性肝病相关分子机制的理解，并有助于开发用于早期诊断的新标志物以及新的治疗策略。