通过有针对性的测序方法进行比较病变分析

我们的协议允许通过识别与疾病进展有关的分子变化来捕获原发性病变和转移性病变之间的遗传相关性。该方法为探索高灵敏度、高特异性的临床标本遗传相关性提供了机会。这是因为分子和组织病理学分析的整合。

癌症研究领域肿瘤内异质性的评价对于设计有效的抗肿瘤策略至关重要，该方法广泛适用于许多实体肿瘤类型。在准备和量化感兴趣的库后，将每个库稀释到无核酸酶水中的 100 个皮摩尔浓度，并将每个稀释库的 10 微升混合在一个管中进行单次运行。然后通过移液混合池库。

要启动排序运行，请首先打开连接到测序系统的计算机上的 Torrent 浏览器。使用所选应用程序的通用模板计划新运行，并在套件选项卡下选择离子质子系统或 Ion Gene Studio S5 系统。从芯片类型下拉菜单中选择合适的芯片，然后从库套件下拉列表中选择 Ion AmpliSeq 2.0 库套件。

选择模板套件的 Ion Chef 按钮，然后从模板套件下拉列表中选择相应的 Chef 套件。从测序套件下拉菜单中选择相应的测序套件，然后从条形码集下拉列表中选择 Ion Express。在插件选项卡下，选择覆盖率分析插件。

在计划选项卡下，从参考库下拉列表中选择 GRCH37HG19 基因组。从目标区域下拉列表中，选择要排序的适当面板。然后设置要排序的条形码数量，并设置每个库的条形码名称和样本名称。

对于池库稀释，用无核酸酶水稀释库存库至 25 皮摩尔浓度，用于离子质子芯片，每个稀释库的移液器 50 微升稀释到适当的库样品管的底部。将包含池稀释库的样品管加载到库准备系统中，并开始克隆放大。对于下一代测序，请按照屏幕上的说明初始化仪器。

克隆扩增完成后，打开离子 Chef 仪器门，然后打开芯片加载离心机的盖子，然后从库准备系统中卸下两个芯片。将芯片放入单独的芯片存储容器中，将其中一个芯片装入仪器中的芯片室。然后关闭芯片舱盖并开始排序。

对于突变分析，打开覆盖分析插件，并使用覆盖分析输出验证覆盖深度和均匀性。使用洪流变体呼叫者插件执行变体调用选择细菌线或躯体工作流。然后下载筛选的变体变体呼叫格式文件，并使用 NCBI RefSeq 数据库中的变体效果预测器软件对变体进行注释。

要估计拷贝数变化，使用离子报告器上传器插件将测序数据加载到离子报告器软件中，并使用综合癌面板肿瘤正常对工作流程分析数据。根据软件分配的分数手动筛选突变和拷贝数变异，并使用综合基因组查看器直观地验证变异。然后目视检查对齐方式是否生成异常读取，并检查给定基因上所有安普利子的规范化覆盖，以验证复制数变异。

对于每种情况下，从正常组织或血液或原发性肿瘤或转移的测序对突变调用进行索引。标记为细菌线和丢弃调用，这也从细菌线DNA的测序数据中可见。标记为克隆或创始人的突变，共享在给定患者的所有病变。

然后标记为亚克隆或进展或突变，检测到在一些，但不是所有给定患者的病变。在这个具有代表性的实验中，针对409个癌症相关基因编码序列的5个固体伪膜肿瘤病例的多病变测序，共确定了8个基因中的27个体细胞突变。突变被定义为在给定患者的所有病变和进展或亚克隆之间共享时，当检测到给定患者的某些（但不是所有）病变时，突变被定义为创始人或克隆。

始终如一，β-卡特宁和KMD6A的免疫体化学染色在具有相应基因突变的病例的不同病变中是同质的。KMD6A在突变标本中的适度染色表明，基因改变可能会改变蛋白质的功能，而不是蛋白质的表达。KMD6A在胰腺肿瘤中功能丧失与缺氧标记胶质-1的调节有关。

因此，GLUT-1在携带KMD6A突变的情况下过度表达。BAP1和TP53的免疫基础化学证实这些基因的突变是亚克隆的。在这个具有代表性的案例的虚拟 karyotype 中，显示改变基因的位置、接近和拷贝数状态，使用测序数据进行拷贝数变异分析，揭示了所分析的所有样本的变化。

与点突变相比，大多数拷贝数变异变化是亚克隆。验证突变和拷贝数变异的验证和索引，并使用肿瘤正常的DNA比较，对于避免生成可能使结果无效的神性调用非常重要。该程序还可用于全基因组测序研究，旨在询问整个基因组，以识别不同实体肿瘤类型病变之间的突变。

在癌症研究领域，这些技术是了解具有重要临床意义的疾病生物学的关键工具，旨在设计个性化和有效的靶向疗法。