Name: 通过有针对性的测序方法进行比较病变分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习通过靶向测序技术对原发灶与转移灶进行多病灶比较分析，整合组织病理学与免疫表型数据，精准识别克隆及亚克隆突变，为肿瘤异质性评估和个性化靶向治疗策略设计提供可靠方法。

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本研究由意大利癌症基因组计划（资助号：FIRB RBAP10AHJB）、意大利癌症研究协会（AIRC；资助号：12182 至 AS，18178 至 VC）以及欧盟第七框架计划资助（Cam-Pac 项目编号 602783 至 AS）提供支持。资助机构在数据的收集、分析与解释以及论文撰写过程中未发挥任何作用。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方法通过整合单个患者不同病灶的纵向数据（即形态学、DNA测序和免疫组织化学），能够识别实体瘤进展过程中涉及的分子改变。我们已证实该方法可在一种突变沉默型肿瘤（即胰腺实性假乳头状瘤，SPN）中检测克隆性和亚克隆性事件，检测范围涵盖409个与癌症相关基因的编码序列8。本研究采用基于扩增子的靶向测序策略，其优势在于测序覆盖的均一性：在典型的平均测序深度达1000x的情况下，90%的目标碱基覆盖深度达到100x，95%达到20x，覆盖区域共计15,992个。高测序深度结合显微切割对肿瘤细胞的富集，确保了对低等位基因频率事件的高灵敏度检测。正如我们先前所证实9，该靶向测序方法可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织来源的DNA样本中检测到低至2%等位基因频率的突变。例如，在本研究中，我们成功识别出一个转移性样本中等位基因频率为4%的TP53错义突变作为亚克隆事件（图5），并通过免疫组织化学验证了该结果（图6）。本方案设计包含配对的肿...

下一代测序（NGS）技术的出现彻底改变了癌症的诊断与治疗方式1。NGS 结合多区域测序揭示了实体瘤中高度的肿瘤内异质性（ITH）2，这在一定程度上解释了靶向治疗失败的原因，即由于存在具有不同药物敏感性的亚克隆2。全基因组测序研究带来的重要挑战之一，是在个体癌症中区分乘客（即中性）突变与驱动突变的必要性3。已有若干研究表明，在某些肿瘤中，乘客突变构成了ITH的主体，而驱动改变则倾向于在同一患者的各个病灶之间保持保守4。还需注意的是，较高的突变负荷（如在肺癌和黑色素瘤中所见）并不一定意味着较高的亚克隆突变负荷2。因此，在突变负荷较低的肿瘤中也可能存在高度的ITH。
转移灶导致了全球超过90%的癌症相关死亡5；因此，捕获原发灶与转移灶之间驱动基因的突变异质性，对于设计治疗晚期疾病的有效疗法至关重要。临床测序通常使用固定组织提取的核酸进行，由于DNA质量较差，这使得全基因组范围的探索变得困难。另一方面，临床测序的目的是识别可靶向的突变和/或可能预测患者对特定治疗方案响应性或无响应性的突变。目前，为及时获取临床相关的信息，测序可局限于基因组中较小的一部分区域。从低通量DNA分析（例如Sanger测序）向高通量测序（NGS）的转变，使得能够以高覆盖深度分析数百个与癌症相关的基因，从而检测出亚克隆事件。本文报道了一种比较病灶分析方法，可在同一患者的不同样本中识别克隆性和亚克隆性细胞群。此处描述的方法整合了三种成熟的技术手段（组织学分析、高覆盖度多病灶测序以及免疫表型分析），以预测所发现变异的功能性后果。该方法的流程示意图见图1，并已应用于5例胰腺实性假乳头状瘤（SPN）转移病例的研究。尽管本文描述的是甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织样本的处理与分析过程，但相同流程也可用于新鲜冷冻组织来源的遗传物质。

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer 仪器</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>&amp;nbsp;自动化电泳工具</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td>用于纯化 PCR 产物的磁珠技术；基于磁珠的纯化试剂</td></tr><tr><td>Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4627</td><td>文库定量</td></tr><tr><td>Anti-BAP1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28383</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Anti-GLUT1</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9052</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Anti-KDM6A</td><td>Cell Signaling</td><td>#33510</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Anti-p53</td><td>Novocastra</td><td>NCL-L-p53-DO7</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;catenin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7207</td><td>抗体</td></tr><tr><td>封闭溶液</td><td>自制</td><td>-</td><td>含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBST 溶液</td></tr><tr><td>内源性过氧化物酶灭活溶液</td><td>自制</td><td>-</td><td>含 3% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的 1× Tris 缓冲盐水（TBS）</td></tr><tr><td>Leica CV ultra</td><td>Leica</td><td>70937891</td><td>Entellan 封片介质</td></tr><tr><td>表位修复溶液 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9961</td><td>柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）表位修复溶液</td></tr><tr><td>表位修复溶液 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9640</td><td>EDTA 缓冲液（pH 9.0）表位修复溶液</td></tr><tr><td>Eppendorf 0.2 ml PCR 管，透明</td><td>Eppendorf</td><td>951010006</td><td>管</td></tr><tr><td>Eppendorf DNA LoBind 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>管</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>DIAPATH</td><td>A0123</td><td>IHC 脱蜡试剂</td></tr><tr><td>ImmEdge 笔&amp;nbsp;疏水&amp;nbsp;屏障&amp;nbsp;笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H&amp;shy;4000</td><td>疏水笔</td></tr><tr><td>ImmPACT DAB&amp;nbsp;过氧化物酶</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK&amp;shy;4105</td><td>HRP 底物</td></tr><tr><td>ImmPRESS Anti&amp;shy;兔&amp;nbsp;Ig&amp;nbsp;试剂&amp;nbsp;过氧化物酶</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP&amp;shy;7401&amp;shy;50</td><td>二抗</td></tr><tr><td>ImmPRESS Anti&amp;shy;鼠&amp;nbsp;Ig&amp;nbsp;试剂&amp;nbsp;过氧化物酶</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP&amp;shy;7402&amp;shy;50</td><td>二抗</td></tr><tr><td>整合基因组浏览器（IGV）</td><td>Broad Institute</td><td>-</td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 综合癌症检测面板</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4477685</td><td>多重靶向选择 409 个与癌症相关的基因。https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq 文库制备试剂盒 2.0</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4480441</td><td>使用 Ion AmpliSeq 面板制备扩增子文库</td></tr><tr><td>Ion Chef 仪器</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4484177</td><td>自动化文库制备、模板制备和芯片上样</td></tr><tr><td>Ion PI 芯片试剂盒 v3 或 Ion 540 芯片</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A26771 或 A27766</td><td>带条形码的测序芯片</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q Chef 试剂盒或 Ion 540 Kit-Chef</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A27198 或 A30011</td><td>模板制备</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q 测序 200 试剂盒或 Ion S5 测序试剂盒</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A26433 或 A30011</td><td>测序</td></tr><tr><td>Ion Proton 或 Ion GeneStudio S5 系统</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4476610 或 A38196</td><td>测序系统</td></tr><tr><td>Ion Reporter 软件 - AmpliSeq 综合癌症检测面板肿瘤-正常配对分析流程</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4487118</td><td>分析流程</td></tr><tr><td>Ion Reporter 软件 - 上传插件</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4487118</td><td>数据分析工具</td></tr><tr><td>Ion Torrent Suite 软件 - 覆盖度分析插件</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4483643</td><td>描述测序覆盖水平的插件</td></tr><tr><td>Ion Torrent Suite 软件 - 变异检测插件</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4483643</td><td>能够在参考序列基础上识别样本中的单核苷酸多态性（SNPs）、插入和缺失的插件</td></tr><tr><td>Ion Xpress 条形码接头 1-96 试剂盒</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4474517</td><td>唯一性条形码接头</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>DNA 纯度检测</td></tr><tr><td>NCBI 参考序列（RefSeq）数据库</td><td>NCBI</td><td>-</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix 高保真酶</td><td>Fisher Scientific</td><td>12532-016 或 12532-024</td><td>用于 PCR 扩增的 SuperMix；高保真 PCR 混合液</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 血液小型试剂盒</td><td>Quiagen</td><td>51106 0r 51104</td><td>DNA 血液提取试剂盒</td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒</td><td>Quiagen</td><td>56404</td><td>DNA FFPE 组织提取试剂盒</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 定量试剂盒</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Q32850</td><td>用于 Qubit 2.0 荧光计进行 DNA 定量的试剂盒</td></tr><tr><td>TBST</td><td>自制</td><td>-</td><td>Tris 缓冲盐水（TBS）含 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus &amp; Tissue-Tek Film</td><td>Sakura Europe</td><td>6172</td><td>自动化组织切片染色仪</td></tr><tr><td>变异效应预测（VEP）软件</td><td>EMBI-EBI</td><td>-</td><td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td></tr><tr><td>二甲苯，异构体混合物</td><td>Carlo Erba</td><td>492306</td><td>IHC 脱蜡试剂</td></tr></tbody></table>

通过靶向测序方法进行比较性病变分析

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

评估肿瘤内异质性（ITH）对于预测靶向治疗的失败并据此设计有效的抗肿瘤策略至关重要。尽管由于样本处理方法和测序深度的差异常引发关注，但通过对实体瘤进行下一代测序，已揭示不同肿瘤类型中ITH程度存在高度变异性。通过识别克隆性和亚克隆性细胞群，明确原发灶与转移灶之间的遗传相关性，对于晚期疾病治疗方案的设计尤为关键。本文报道了一种可用于比较不同病灶的分析方法，能够识别同一患者不同样本中的克隆性和亚克隆性细胞群。该实验方法整合了三种成熟的技术：组织学分析、高覆盖度多病灶测序以及免疫表型分析。为最大限度减少不当样本处理对亚克隆事件检测的影响，我们对组织样本进行了细致的病理学检查，并富集了肿瘤细胞。随后，对经质量控制的肿瘤病灶及正常组织DNA进行高覆盖度测序，靶向409个与癌症相关的重要基因的编码区。尽管该方法仅检测有限的基因组区域，但仍可评估特定患者不同病灶间体细胞变异（单核苷酸突变和拷贝数变异）的异质性程度。通过测序数据的比较分析，我们能够区分克隆性与亚克隆性变异。大多数ITH通常归因于乘客突变；因此，我们还采用免疫组织化学方法预测突变的功能性后果。尽管本方案已应用于特定类型的肿瘤，但我们预期该方法可广泛适用于其他类型的实体瘤。

研究工作流程如图所示 图1. 对5例SPN病例的多病灶（n = 13）进行靶向409个癌症相关基因编码序列的测序，共鉴定出8个基因中的27个体细胞突变（CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1，以及 FGFR3）。当某一患者的全部病灶中均存在相同突变时，定义为奠基性/克隆性突变；当突变仅存在于同一患者的某些而非全部病灶中时，定义为进展性/亚克隆性突变（图5A，B）。总体而言，该队列中鉴定出的大多数点突变均为克隆性事件，包括以下基因的突变： CTNNB1, KDM6A, TET1 和 FLT1. 一致地，对β-catenin（其基因编码的蛋白质产物）进行免疫组织化学染色显示 CTNNB1）而KDM6A在具有相应...

本文介绍了一种用于识别特定患者不同样本中克隆性和亚克隆性改变的方法。尽管此处描述的实验集中于某一特定肿瘤类型，但该方法可广泛适用于其他实体瘤。

评估肿瘤内异质性（ITH）对于预测靶向治疗的失败并据此设计有效的治疗方案至关重要……

本方案通过鉴定疾病进展过程中涉及的分子改变，实现了对原发灶与转移灶之间遗传相关性的捕获。我们的方法能够以高灵敏度和特异性探索临床样本中的遗传相关性，这得益于分子分析与组织病理学分析的整合。在癌症研究领域，评估肿瘤内异质性对于设计有效的抗肿瘤策略至关重要，而我们的方法可广泛适用于多种实体瘤类型。在完成目标文库的制备与定量后，将每个文库用无核酸酶的水稀释至100皮摩尔浓度，并从每种稀释后的文库中各取10微升，合并至同一管中用于单次运行。随后通过移液混匀合并后的文库。要启动测序运行，请首先在连接至测序系统的计算机上打开 Torrent 浏览器。使用所选应用的通用模板规划新运行，并在“试剂盒”选项卡中选择 Ion Proton 系统或 Ion Gene Studio S5 系统。从芯片类型下拉菜单中选择合适的芯片，并从文库试剂盒下拉列表中选择 Ion AmpliSeq 2.0 文库试剂盒。选择模板试剂盒的 Ion Chef 按钮，然后从模板试剂盒下拉列表中选择相应的 Chef 试剂盒。从测序试剂盒下拉菜单中选择相应的测序试剂盒，并从条形码集合下拉列表中选择 Ion Express。在插件选项卡下，选择覆盖度分析插件。在“计划”选项卡下，从参考基因组下拉列表中选择 GRCH37HG19 基因组。从目标区域下拉列表中，选择要测序的相应面板。然后设置要测序的标签（barcode）数量，并为每个文库设置标签名称和样本名称。对于文库混合稀释，使用无核酸酶水将文库原液稀释至25皮摩尔浓度（适用于Ion Proton芯片），然后将每种稀释后的文库各取50微升加入相应文库样本管底部。将含有混合稀释文库的样本管装载到文库制备系统上，启动克隆扩增。进行下一代测序时，按照屏幕上的指示初始化仪器。当克隆扩增完成后，打开 Ion Chef 仪器门，然后打开芯片加载离心机的盖子，从文库制备系统中取出两张芯片。将芯片分别放入独立的芯片储存容器中，并将其中一张芯片装入仪器的芯片仓内。随后关闭芯片仓盖，启动测序程序。进行突变分析时，打开覆盖度分析插件，利用覆盖度分析结果验证测序深度和覆盖均匀性。使用 Torrent 变异检测插件进行变异 calling，根据需要选择生殖系或体细胞工作流程。然后下载经过过滤的变异位点 VCF 文件，并利用 NCBI RefSeq 数据库中的变异效应预测软件对变异进行注释。为了估算拷贝数变异，使用 Ion Reporter 上传插件将测序数据导入 Ion Reporter 软件，并采用全面癌症检测 panel 肿瘤-正常配对工作流程分析数据。根据软件赋予的评分，手动筛选突变和拷贝数变异，并通过整合基因组浏览器（Integrative Genomics Viewer）对变异进行可视化验证。随后，目视检查比对结果中可能产生假阳性变异的异常读段，并将特定基因所有扩增子的标准化覆盖度与基线的标准化覆盖度进行比较，以确认拷贝数变异。针对每个病例，对正常组织、血液、原发性肿瘤或转移灶测序所得的突变调用结果进行索引。若突变在种系DNA测序数据中同样存在，则标记为种系突变并予以剔除。将特定患者所有病灶中均存在的突变标记为克隆性或始祖性突变。随后，将那些在某一特定患者的某些病灶中被检测到、但并非存在于所有病灶中的突变标记为亚克隆性（subclonal）或进展性（progressor）。在此项代表性实验中，对5例实性假乳头状肿瘤病例的多个病灶进行测序，靶向409个癌症相关基因的编码序列，共鉴定出8个基因中的27个体细胞突变。若某一突变存在于某一特定患者的所有病灶中，则定义为奠基性（founder）或克隆性（clonal）突变；若仅存在于该患者的某些而非全部病灶中，则定义为进展性（progressor）或亚克隆性（subclonal）突变。一致地，携带相应基因突变病例的不同病灶在β-catenin和KMD6A的免疫组织化学染色中表现出均一性。突变标本中KMD6A呈中等程度染色，提示基因改变可能更倾向于影响蛋白功能而非其表达水平。胰腺肿瘤中KMD6A功能丧失与缺氧标志物GLUT-1的上调相关。因此，在携带KMD6A突变的病例中，GLUT-1呈过表达。BAP1和TP53的免疫组织化学染色证实，这些基因的突变属于亚克隆性改变。在此例代表性病例的虚拟核型图中，显示了发生改变基因的位置、邻近关系及拷贝数状态，基于测序数据的拷贝数变异分析揭示了所有被分析标本中均存在基因改变。与点突变相反，大多数拷贝数变异的改变属于亚克隆性事件。对突变和拷贝数变异进行验证与注释，并利用肿瘤组织与正常DNA的比对，对于避免产生可能使结果无效的假阳性检测至关重要。该流程也可应用于全基因组测序研究，旨在全面筛查不同实体瘤类型病灶间的基因组变异以识别突变。在癌症研究领域，这些技术是理解具有重要临床意义的疾病生物学的关键工具，旨在设计个性化且有效的靶向治疗方案。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

通过有针对性的测序方法进行比较病变分析

寻找导致自闭症和精神分裂症等常见疾病的新生突变的分子遗传学策略。...

一种在自闭症和精神分裂症等常见疾病中鉴定新生突变的策略

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。...

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

用于NGS测序的基因组DNA富集是研究遗传性突变的一种简便而强大的工具。本文介绍了对11个参与DNA损伤修复的基因进行完整序列分析的实验流程。...

基于转座酶技术的gDNA富集用于NGS分析BRCA1、BRCA2及9个DNA损伤修复相关基因的全序列

本文描述了两种下一代测序 panel 的临床方案。其中一个 panel 检测血液系统恶性肿瘤，而另一个 panel...

用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

本文介绍了一种结合流式细胞分选与低起始量下一代测序文库构建的实验方案，旨在从经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）的霍奇金-里德-斯特恩伯格（HRS）细胞中获得高质量的全外显子组数据。...

流式分选与经典霍奇金淋巴瘤中里-施细胞的外显子组测序

从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。...

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

靶向二代测序是一种高效且经济的方法，正日益广泛应用于疾病研究和临床诊断。本文所述方案介绍了用于测序的复杂工作流程，以及用于识别致病遗传变异的生物信息学分析过程。...

靶向二代测序与生物信息学分析流程用于评估先天性疾病的遗传决定因素

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

本文介绍了一种利用视频分析系统评估小鼠恐惧学习与记忆的场景性和提示性恐惧条件反射实验方案。...

使用视频分析系统对小鼠进行情境与线索性恐惧条件反射测试

学习通过靶向测序技术对原发灶与转移灶进行多病灶比较分析，整合组织病理学与免疫表型数据，精准识别克隆及亚克隆突变，为肿瘤异质性评估和个性化靶向治疗策略设计提供可靠方法。

通过靶向测序方法进行比较性病变分析

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