Name: 人体血液的突变载荷和克隆成分的特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解造血干细胞和祖细胞中体细胞突变的计算方法。该方法通过体外克隆培养避免全基因组扩增，实现准确测定突变数量并解析造血谱系关系，为研究血液细胞发育和疾病提供可靠框架。

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&#65279;本研究由以下资助 &#65279;荷兰科学研究组织（NWO）的 VIDI 项目（编号：016.Vidi.171.023）对 R. v. B. 的资助

样本的获取必须遵循适当的伦理规范，且捐赠者须在操作前签署知情同意书。
1. 样品材料的制备
注意：处理新鲜样品时，请从步骤 1.1 开始；处理冻存样品时，请从步骤 1.2 开始。
<ol>
	<li>准备新鲜的骨髓、脐带血或外周血
	<ol>
		<li>按照制造商的说明，使用密度梯度离心法从样本中分离单个核细胞组分（参见材料表），并使用血细胞计数板对单个核细胞进行计数。在完成单个核细胞分离后，继续进行步骤 1.3。</li>
		<li>可选：分选一整块 384 孔板的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）所需的推荐细胞数量为 1–2 × 107。若在密度梯度离心过程中获得的细胞数量更多，可将多余的细胞储存于液氮中。</li>
		<li>每 1 × 107 个细胞用 500 μL IMDM + 10% FBS 重悬，并逐滴加入等体积的 IMDM + 30% FBS + 20% DMSO，最终获得 1 mL 含 1 × 107 个细胞的细胞悬液，其组成为 IMDM + 20% FBS + 10% DMSO。</li>
		<li>立即将单个核细胞转移至 1 mL 冻存管中，并在程序降温冻存盒中于 -80 °C 冷冻过夜。次日将细胞转移至液氮中长期保存，以备后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复苏冻存的骨髓、脐带血或外周血来源的单个核细胞
	<ol>
		<li>准备 50 mL 细胞复苏培养基，包含 45 mL Iscove 改良 Eagle 培养基（IMDM）和 5 mL 胎牛血清（FBS），并在 37 °C 水浴中预热。</li>
		<li>从液氮中取出冻存细胞管，迅速转移至干冰上，并立即在 37 °C 水浴中快速解冻。</li>
		<li>当样品即将完全解冻时，用 70% 乙醇擦拭管壁，将内容物转移至 50 mL 锥形管中。用 1 mL 预热的 IMDM + 10% FBS 冲洗原冻存管，以回收残留细胞，并将此冲洗液逐滴（每滴间隔约 5 秒）加入解冻后的细胞悬液中，同时轻轻旋转锥形管混匀。</li>
		<li>继续向样品中逐滴加入额外的 15 mL 预热 IMDM + 10% FBS，同时轻轻旋转锥形管。</li>
		<li>以 350 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，仅保留约 ±3 mL。将细胞沉淀用剩余上清液重悬，并在轻轻振荡下逐滴加入 20 mL IMDM + 10% FBS 进行稀释。</li>
		<li>取 10 μL 细胞悬液用于细胞计数。将这 10 μL 与 20 μL 0.4% 台盼蓝溶液混合稀释，使用血细胞计数板进行细胞计数。解冻后细胞数量可能下降，最多可损失 50% 的细胞。细胞活力应在 70% 至 90% 之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用骨髓或脐带血细胞，取 5 × 106 个单个核细胞用于间充质干细胞（MSC）培养（步骤 2.1）；若使用外周血，则取 2–5 × 106 个细胞用于 T 细胞分离（步骤 2.2）。</li>
	<li>将剩余细胞以 350 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞后重悬于 3 mL FACS 缓冲液（PBS 中含 0.05% BSA 和 1 mM EDTA）中。</li>
	<li>取 1 × 105 个细胞转移至含有 200 μL FACS 缓冲液的微量离心管中，作为流式细胞术的阴性对照（步骤 3.8），并置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 细胞培养
注意：为了获得体细胞获得性突变的目录，需要过滤掉供体特异性的种系变异。当起始材料为骨髓活检样本或脐带血时，可使用间充质基质细胞（MSCs）作为匹配的对照样本，以过滤种系变异。在此情况下，请遵循第2.1节。当使用（经动员的）外周血时，请按照步骤2.2分离T细胞，并将其作为匹配的对照样本以过滤种系变异（图1）。 bulk T细胞群体与HSPCs具有相同的谱系关系。
<ol>
	<li>MSC 培养
	<ol>
		<li>配制 50 mL MSC 培养基，包含 45 mL DMEM/F12 培养基、10% FBS、500 μL 200 mM L-谷氨酰胺或 L-谷氨酰胺替代物，以及 500 μL 青霉素/链霉素溶液。</li>
		<li>每孔加入 1.5 mL MSC 培养基，接种约 5 × 105 个单个核细胞。将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中培养。</li>
		<li>24 小时后更换培养基，之后每 3 天更换一次培养基，以确保所有造血细胞被洗脱。持续培养至细胞融合度达到 100%。</li>
		<li>当 MSC 细胞融合时，用 1 mL PBS 洗涤细胞，每孔加入 200 μL 胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物消化细胞。在 37 °C 下孵育 5 分钟，随后加入 800 μL MSC 培养基，用移液器反复吹打使细胞从培养板孔底脱落。</li>
		<li>将 MSC 转移至微量离心管中，在 350 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞沉淀。弃去上清液，立即进行 DNA 提取，或在 -20 °C 保存沉淀以备后续 DNA 提取（第 4 节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T 细胞分离 
	注意：若使用（经动员的）外周血，可分离 T 细胞并用作种系对照。
	<ol>
		<li>将细胞沉淀重悬于 100 μL 抗 CD3 染色液中（抗 CD3 抗体以 1:100 比例稀释于 FACS 缓冲液中）。</li>
		<li>加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，在 350 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞，再重悬于 300 μL FACS 缓冲液中。</li>
		<li>使用流式细胞分选仪（FACS 分选仪）分选至少 5 × 105 个 CD3+ 细胞，收集至预先加入 1 mL FBS 的 5 mL 聚苯乙烯管中。</li>
		<li>将分选后的细胞在 350 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞沉淀，弃去上清液，立即进行 DNA 提取（第 4 节），或在 -20 °C 保存沉淀以备后续 DNA 提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. HSPC 的分离、分选与培养
<ol>
	<li>将 1–2 × 107 个单个核细胞在 350 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，重悬于 50 μL FACS 缓冲液中（见步骤 2.2.1），然后将细胞转移至微量离心管中。 
	注意：当分选细胞数量 &#62;2 × 107 时，应相应增加抗体混合液和 FACS 缓冲液的体积。</li>
	<li>根据 表 1 中的配方配制 50 μL 的 2× HSC 染色混合液。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>体积 [μL]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421-CD34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-谱系混合抗体（CD3/14/19/20/56）</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD38</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-CD90</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-CD45RA</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7-CD49f</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CD16</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CD11b</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS 缓冲液</td>
			<td>25.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：造血干细胞分选混合液。 下表列出了用于分选造血干细胞（HSCs）的抗体稀释比例。
<ol start="3">
	<li>将50 μL细胞悬液与配制好的HSC染色混合液混合，室温孵育15分钟，或冰上孵育1小时，使抗体充分结合。</li>
	<li>加入1 mL FACS缓冲液洗涤细胞，350 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞重悬于300 μL FACS缓冲液中，并通过装有35 µm细胞滤网的5 mL聚苯乙烯管过滤细胞悬液，以去除细胞团块，随后进行荧光激活细胞分选（FACS）。</li>
	<li>配制25 mL HSPC培养基，包含1× SFEM培养基，并添加100 ng/mL SCF、100 ng/mL Flt3、50 ng/mL TPO、10 ng/mL IL-3、20 ng/mL IL-6以及100 ng/mL抗生素混合物（参见材料表）。</li>
	<li>在384孔细胞培养板的每个孔中加入75 μL HSPC培养基。 
	注意：为防止边缘孔中培养基蒸发，将边缘孔加入75 μL无菌水或PBS，这些孔不用于细胞分选。</li>
	<li>单个HSPC的分选
	<ol>
		<li>根据未染色对照（步骤1.9）和染色样本中的10,000个细胞设定HSPC分选门控。门控设置的代表性结果见图1。通过在FSC-高度与FSC-面积的线性图上圈选单细胞区域来设定单细胞门控。使用未染色对照样本设定lineage-细胞群的门控。设定CD34+细胞门控，并进一步通过设定CD38- CD45RA-细胞的特异性门控对该亚群进行表征。</li>
		<li>将384孔板装载至FACS仪器上，进行单细胞分选。 
		注意：若FACS仪器支持，请开启索引分选数据记录功能，以便后续追溯分选细胞的信息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞分选HSC的培养
	<ol>
		<li>立即将384孔板转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱中。 
		注意：为防止培养过程中培养基蒸发，需用透明聚乙烯薄膜将384孔板（带盖）包裹密封。</li>
		<li>将384孔板在培养箱中培养3–4周，直至可见克隆形成。克隆培养的代表性图像见图2。根据起始材料的状态，约有5%–30%的分选细胞可实现克隆扩增。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 收获 HSPC 克隆
<ol>
	<li>培养 4 周后，确定哪些孔的融合度达到 30% 或更高。</li>
	<li>为每个单克隆后代预先在 1.5 mL 离心管中加入 1 mL 含 1% BSA 的 PBS，并根据对应的孔标记管子。</li>
	<li>用含 1% BSA 的 PBS 预润湿移液枪头，以尽量减少细胞黏附在枪头上的数量。</li>
	<li>使用 200 μL 移液器（设定体积为 75 μL）在孔中剧烈吹打培养基上下至少 5 次，并刮擦孔底以松动细胞，然后将细胞悬液收集至对应标记的离心管中。</li>
	<li>吸取 75 μL 新鲜的含 1% BSA 的 PBS，重复吹打孔内以确保最大程度回收细胞。 
	注意： 单克隆培养的细胞可能黏附在孔底。需使用标准倒置光学显微镜检查各孔，确认是否所有细胞均已收集。</li>
	<li>若所有融合度 &#62;30% 的孔均已收集完毕，将 384 孔板放回培养箱继续培养。单克隆培养物可增殖长达 5 周。</li>
	<li>将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 5 分钟，应可见少量沉淀。</li>
	<li>小心弃去上清液，仅保留约 5 μL。细胞沉淀可在 -20 °C 冻存，并在数月内保存以备后续 DNA 提取。</li>
</ol>
5. DNA 提取
<ol>
	<li>按照以下调整步骤，使用微量DNA提取试剂盒根据制造商说明书分离HSPC和MSC/T细胞的DNA：
	<ol>
		<li>在第2步加入缓冲液AL后，添加2 μL RNase A。在加入蛋白酶K之前，孵育2分钟。</li>
		<li>在56 °C孵育30分钟，而非10分钟。</li>
		<li>用50 μL低EDTA的TE缓冲液（10 mM Tris，0.1 mM EDTA）上样至柱子中洗脱DNA。为获得最佳洗脱效果，可将洗脱液重新上样至同一柱子，再次离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用DNA浓度检测方法测定DNA浓度，每克隆取2 μL进行检测。DNA得率通常在0.5–3 ng/μL之间。</li>
</ol>
6. 测序
<ol>
	<li>按照 Jager 等人所述方法进行 DNA 测序13</li>
</ol>
7. 绘制图谱与体细胞突变检测
<ol>
	<li>按照 Jager 等人13所述方法，将测序输出结果（FASTQ 文件）比对至参考基因组并进行突变检测。</li>
	<li>使用拷贝数分析工具（如 Control-FreeC14）对测序克隆及群体数据中的异常核型变化进行检查。截至目前，我们尚未报道任何具有核型异常的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。</li>
	<li>生成一个黑名单，该黑名单由一组自身样本中不匹配的正常样本组成，用于过滤目的，具体方法如前所述13；或使用以下上传的黑名单：&#60;https://data.mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3&#62;。</li>
	<li>使用 SNVFI 工具对单核苷酸变异进行过滤&#60;https://github.com/ToolsVanBox/SNVFI&#62;。
	<ol>
		<li>预先设置 SNVFI.config 文件，确保所有辅助功能的路径正确无误。</li>
		<li>根据<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/SNVFI.zip" target="_blank">补充文件 1</a>（SNVFI.ini）中的设置配置 .ini 文件后运行 SNVFI。为排除体外诱导的突变，我们对 VAF ≥0.3 的变异进行过滤9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查 SNVFI 输出的变异等位基因频率（VAF）结果（图 4），确认密度图的峰值是否接近 0.5，以判断样本是否为克隆性来源。</li>
	<li>可选步骤：为确定在过滤过程中基因组被覆盖的区域，可使用 GATK（Genome Analysis ToolKit）中的 CallableLoci 工具，沿生殖系样本和对照样本确定可调用区域： 
	java -jar GenomeAnalysisTK.jar \ 
	        -T CallableLoci \ 
	        -R reference.fasta \ 
	        -I myreads.bam \ 
	        -summary table.txt \ 
	        -o callable_status.bed</li>
	<li>可选步骤：从 CallableLoci 的输出结果中提取可调用区域，并使用位于 <a href="https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor">https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor</a> 的 Python 脚本 CallableLoci_processor.py 对样本与群体数据之间进行成对交集分析。生成的 bed 文件可用于进一步过滤 SNVFI 的输出结果，并用于第 9 节中的突变谱分析： 
	CallableLoci_processor.py dir_in dir_out sample_name bulk_name –samples sample1 sample2 sample3</li>
</ol>
8. 插入缺失突变检测
<ol>
	<li>使用 GATK SelectVariants 从 raw_variants.vcf 文件中选择所有插入缺失突变（Indels）： 
	java -Xmx12G \ 
	&#160; &#160; &#160;   -jar GenomeAnalysisTK.jar \ 
	&#160; &#160; &#160;   -T SelectVariants \ 
	&#160; &#160; &#160;   -R reference_genome.fasta \ 
	&#160; &#160; &#160;   -V raw_variants.vcf \ 
	&#160; &#160; &#160;   -o raw_INDELs.vcf \ 
	&#160; &#160; &#160;   -selectType INDEL</li>
	<li>使用 INDELFI &#60;https://github.com/ToolsVanBox/INDELFI&#62; 对 raw_INDELs.vcf 列表进行过滤： 
	perl INDELFI.pl -i input.vcf （来自步骤 8.1） \ 
	&#160; &#160; &#160;   -s column test sample \ 
	&#160; &#160; &#160;   -c column control sample</li>
</ol>
9. 突变谱分析
<ol>
	<li>使用步骤 7.6（或结合可选的可调用位点分析的步骤 7.9）中 SNVFI 输出得到的 .vcf 文件，通过 R 软件包 MutationalPatterns15： &#60;http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/MutationalPatterns.html&#62; 分析基因组突变谱、突变类型及突变特征。有关可由所得 .vcf 文件生成的代表性结果（例如 96 种三核苷酸突变谱），请参见 图 5。</li>
</ol>
10. 利用碱基替换构建发育谱系树
<ol>
	<li>为构建发育谱系树，需检测克隆之间的共有突变。谱系树早期分支中存在的突变也可能在 bulk 样本（MSCs/T细胞）中以亚克隆形式存在。后期分支的谱系则由仅在HSPC克隆间共有的突变来定义。</li>
	<li>为鉴定在部分克隆中存在且在 bulk 样本中以亚克隆形式存在的突变，请执行以下步骤。</li>
	<li>为筛选克隆间共有的体细胞突变，在基于 Unix 的终端中运行 filterSomatic.py 脚本。该脚本可在 <a href="https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic">https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic</a> 获取。在运行此脚本前，请编辑 filterSomatic.ini 文件（参见 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/filterSomatic.zip" target="_blank">补充文件2</a>），设置路径并调整其他参数。</li>
	<li>运行 filterSomatic.py（python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini）。</li>
	<li>在基于 Unix 的终端中使用 Determine_lowVAF_bulk.R 脚本筛选在 bulk 样本中以低等位基因频率（subclonally）存在的突变。该脚本可在 <a href="https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts">https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts</a> 获取。此步骤将生成分别对应共有和独特SNV的独立.vcf文件： 
	Rscript Determine_lowVAF_bulk.R 
	&#160; &#160; &#160;   --vcf Path/To/Filter_somatic_output.vcf 
	&#160; &#160; &#160;   --bulk bulk_name 
	&#160; &#160; &#160;   --sample_name sample-name 
	&#160; &#160; &#160;   --gender [M|F] 
	&#160; &#160; &#160;   --out_dir out_dir</li>
	<li>通过叠加所有突变位点（合并SNVFI输出的第1列和第2列）确定克隆间共有但 bulk 样本中不存在的所有突变。</li>
	<li>使用IGV16通过人工检查排除步骤10.5和10.6中获得的假阳性结果。若突变不存在、存在于种系中或位于比对质量较差的区域，则视为假阳性，参见 图7。 
	注意：我们强烈建议使用靶向测序或Sanger测序对所有共有位点进行独立的重新测序验证。</li>
	<li>利用步骤10.1和10.2中获得的共有突变构建突变与测序克隆之间的二进制表格，其中0表示突变不存在，1表示突变存在。</li>
	<li>使用R将突变二进制表以热图形式输出，并附上表示细胞间谱系关系的树状图。热图显示每个细胞的突变状态。参见该函数的输出结果（图6）。 
	&#160; &#160; &#160;    
	Clones &#60;- read.table(“Path/To/BinaryTable”) 
	&#160; &#160; &#160;    
	my_palette &#60;- colorRampPalette(c(&#34;#cccccc&#34;, &#34;#333333&#34;))(n = 2) 
	col_breaks &#60;- c(0,0.5,1) 
	&#160; &#160; &#160;    
	heatmap.2(clones, distfun=function(x) dist(x,method = 'binary'), 
	&#160; &#160; &#160;   hclustfun=function(x) hclust(x,method = average), 
	&#160; &#160; &#160;   dendrogram = &#34;column&#34;, Rowv = F, 
	&#160; &#160; &#160;   col=my_palette, breaks=col_breaks, 
	&#160; &#160; &#160;   trace=&#34;none&#34;, density.info=&#34;none&#34;)</li>
</ol>

<ol><li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Hematopoiesis+and+Blood-Cancer+Risk+Inferred+from+Blood+DNA+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Clonal+Hematopoiesis+Associated+with+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+haematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> Nature Communications. 7, 1-7 (2016).</li>
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<li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+normal+cells+reveals+developmental+lineages+and+mutational+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes.</a> Nature. 513, 422-425 (2014).</li>
<li>Blokzijl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mutation+accumulation+in+human+adult+stem+cells+during+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life.</a> Nature. 538, 260-264 (2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种检测个体造血干细胞（HSPC）在生命过程中累积的突变的方法，并利用这些突变数据构建早期发育谱系树。
成功进行这些检测必须满足若干关键条件。首先，必须确保样本的活性。快速处理样本是保证操作效率的关键。其次，生长因子活性的降低会负面影响造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的克隆扩增。为确保生长因子具有高活性，应避免反复冻融，并制备成单次使用的小份分装。第三，在完成全基因组测序（WGS）、突变识别与过滤后，验证克隆培养物的单克隆性至关重要。为确认培养物的单克隆性，在核型正常的样本中，突变的等位基因频率（VAF）应集中在0.5左右（图3）。在突变负荷较低的细胞中（例如脐带血HSPCs），由于突变数量较少，确定克隆性更为困难。
我们的方法依赖于单细胞的体外扩增，以实现全基因组测序（WGS）。因此，该方法仅适用于具有克隆扩增潜能的细胞，例如造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。在我们的实验中，所有经单细胞分选后的细胞中约有5%至30%能够充分扩增。扩增效率降低可能会导致选择性偏差。如前所述，采用全基因组扩增（WGA）的方法可克服这种选择性偏差，因为该技术不依赖细胞扩增。然而，WGA本身也存在局限性，而克隆扩增仍是唯一能够在全基因组范围内准确确定突变数量的方法，避免等位基因丢失并实现基因组上均匀的覆盖度，尤其是在真实体细胞突变数量较低的样本中。
利用该方法生成的数据可用于确定造血系统的系统发育关系，因为单细胞中检测到的突变可用于解析细胞谱系，如图6所示。通常，在健康供体中，每个分支可由一到两个突变定义1。由于谱系在受精后早期即发生分支，因此定义这些最初分支的突变也会以较低的VAF出现在用于过滤种系变异的配对正常样本中1,18,19。在此情况下，优先使用非造血细胞（如MSCs），因为它们在发育过程中与造血系统分离较早。由于T细胞起源于造血系统，因此将其作为配对正常样本用于过滤种系变异可能会干扰发育谱系树最早分支的构建。通过靶向深度测序可检测到某些成熟血细胞群体中存在分支特异性突变的亚克隆，这表明该分支的子代能够产生此类成熟细胞类型。此外，我们的方法可用于评估体内致突变暴露的突变后果，并最终阐明其如何促进白血病的发生发展。

造血干细胞和祖细胞（HSPCs）在一生中暴露于内源性或外源性的致突变因素，会导致DNA中突变的逐渐累积1。HSPCs中突变的逐步累积1可导致与年龄相关的克隆性造血（ARCH）2,3，这是一种由携带白血病驱动突变的HSPCs所驱动的无症状状态。最初认为，患有ARCH的个体患白血病的风险增加2,3。然而，近期研究表明，在老年人群中ARCH的发生率高达95%4，使得其与恶性肿瘤之间的关联变得不明确，并引发了一个问题：为何部分携带ARCH的个体最终会发展为恶性肿瘤，而另一些则不会。尽管如此，HSPCs中的体细胞突变仍可能带来严重的健康风险，因为骨髓增生异常综合征和白血病的特征之一便是存在特定的癌症驱动突变。
为了识别突变过程并研究血液克隆性，需要对单个造血干细胞和祖细胞（HSPC）中的突变累积情况进行表征。突变过程会在基因组中留下特征性的模式，即所谓的突变特征，这些特征可在全基因组范围的突变集合中被识别和量化5。例如，紫外线照射、烷化剂暴露以及DNA修复通路的缺陷各自均与不同的突变特征相关联6,7。此外，由于突变累积具有随机性，大多数（即使不是全部）获得性突变在不同细胞之间是独特的。如果同一机体的多个细胞共享某些突变，则表明这些细胞拥有共同的祖先8。因此，通过评估共享的突变，可以确定细胞之间的谱系关系，并逐分支构建发育谱系树。然而，由于正常健康组织具有多克隆特性，在生理状态正常的细胞中系统记录稀有体细胞突变在技术上具有挑战性。
本文介绍一种准确识别和确定单个造血干细胞（HSPC）基因组中体细胞突变的方法。该方法包括在体外分离并进行HSPC的克隆扩增。这些克隆培养物反映了原始细胞的遗传组成（即原始细胞中的突变将被培养物中所有其他细胞共同携带）。此方法使我们能够获得足够的DNA用于全基因组测序（WGS）。我们先前已证明，在体外克隆培养过程中积累的突变将仅被部分细胞共享，这使得所有体外突变可通过过滤去除，因为与体内获得的突变相比，这些突变在测序读段中所占比例较小9。以往的方法通过全基因组扩增（WGA）从单个细胞中获取足够用于WGS的DNA10。然而，WGA的主要缺点是其基因组扩增相对容易出错且不均衡，可能导致等位基因丢失11。尽管如此，由于本方法依赖于单细胞的体外扩增，因此仅适用于具有足够复制潜能的血细胞，而基于WGA的方法则无此限制。早期对克隆培养物进行测序的研究依赖饲养层细胞以确保单个HSPC的克隆扩增12。然而，饲养层细胞的DNA可能污染克隆培养物的DNA，从而干扰后续的突变识别与过滤。本文所述方法完全依赖特定培养基实现单个HSPC的克隆扩增，因此避免了DNA污染问题。迄今为止，我们已成功将该方法应用于人骨髓、脐带血、可存活冷冻保存的骨髓以及外周血样本。

<table><tbody><tr><td>0.20 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 注射器，鲁尔锁扣</td><td>BD</td><td>613-3925</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11c FITC</td><td>BioLegend</td><td>301603</td><td>克隆 3.9</td></tr><tr><td>CD16 FITC</td><td>BioLegend</td><td>302005</td><td>克隆 3G8</td></tr><tr><td>CD3 BV650</td><td>Biolegend</td><td>300467</td><td>克隆 UCHT1</td></tr><tr><td>CD34 BV421</td><td>BioLegend</td><td>343609</td><td>561</td></tr><tr><td>CD38 PE</td><td>BioLegend</td><td>303505</td><td>克隆 HIT2</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>304121</td><td>克隆 HI100</td></tr><tr><td>CD49f PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>313621</td><td>克隆 GoH3</td></tr><tr><td>CD90 APC</td><td>BioLegend</td><td>328113</td><td>克隆 5E10</td></tr><tr><td>细胞筛网 5 mL 管</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 384 孔板，130 &amp;micro;L，F 型底，组织培养级，带盖</td><td>Greiner</td><td>781182</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>人 Flt3 配体，优质级</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-479</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液重悬，分装为单次使用量（25 &amp;mu;L），浓度为 100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>人重组 IL-3（大肠杆菌表达）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>78040.1</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液重悬，分装为单次使用量（2.5 &amp;mu;L），浓度为 100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>人重组 IL-6（大肠杆菌表达）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>78050.1</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液重悬，分装为单次使用量（5 &amp;mu;L），浓度为 100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>人 SCF，优质级</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液重悬，分装为单次使用量（25 &amp;mu;L），浓度为 100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>人 TPO，优质级</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-752</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 溶液重悬，分装为单次使用量（12.5 &amp;mu;L），浓度为 100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>整合基因组浏览器 2.4 版</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/download</td></tr><tr><td>Isocove 改良 Eagle 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>谱系标记抗体（CD3/14/19/20/56）FITC</td><td>BioLegend</td><td>348701</td><td>克隆：UCHT1、HCD14、HIB19、2H7、HCD56</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#07861</td><td>用于密度梯度分离</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>由研究所设施自行配制，也可使用市售 PBS</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>抗生素混合制剂</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 微量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNA酶 A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>SH800S 细胞分选仪</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM，500 mL</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液 pH 8.0，低 EDTA</td><td>G-Biosciences</td><td>786-151</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605-10</td><td></td></tr></tbody></table>

表征人类血液的突变负荷与克隆组成

Characterizing Mutational Load and Clonal Composition of Human Blood

造血干细胞和祖细胞（HSPCs）在生命周期中会逐渐积累DNA突变，这些突变可能与衰老相关疾病（如白血病）的发生有关。对突变积累过程进行表征有助于加深对衰老相关疾病病因的理解。本文介绍一种基于克隆性原代细胞培养物全基因组测序（WGS）的方法，用于系统性地记录单个HSPCs中的体细胞突变。原始细胞中存在的突变会在克隆培养的所有细胞中共享，而在细胞分选后体外获得的突变则仅存在于部分细胞中。因此，该方法能够准确检测个体HSPCs基因组中在生命过程中积累的体细胞突变。这些体细胞突变图谱可为造血组织中活跃的突变过程及其在白血病发生中的作用提供重要见解。此外，通过分析同一个体多个HSPCs之间共享的体细胞突变，可以确定克隆谱系关系及血液细胞群体的动力学特征。由于该方法依赖于单个细胞的体外扩增，因此仅适用于具有足够复制潜能的造血细胞。

实验步骤 
实验流程如图1所示。根据输入材料的类型，需采用不同的操作步骤。在图2中展示了脐血细胞分选的流式细胞术输出结果。首先，通过在该细胞群周围大致圈选门控以选择所有单核细胞。接着，通过选择具有线性FSC-H/FSC-A比值的细胞来分离单细胞，因为较低的FSC-H/FSC-A比值通常包含双细胞或细胞团块。未染色对照样本用于定义谱系-、CD34+、CD38-、CD45RA-的细胞分选门控。此外，CD90和CD49f可用于区分祖细胞与具有自我更新能力的干细胞17（图2）。索引分选技术可实现对单个细胞的追溯，分选后的细胞以棕色圆点表示。在细胞培养过程中，各个克隆的扩增速度可能不同，部分克隆在3周内即可扩增，而其他克隆则需至培养第5周才完全扩增。代表性克隆生长情况见图3A,B。图中还展示了一张接种后11天接近汇合的间充质干细胞（MSC）群体培养的代表性图像（图3C）。
测序后质量检查与突变分析 
图中显示的是由 Control-FreeC14 生成的拷贝数分析示例结果，用于检测拷贝数变异（图4）。核型信息可用于提示在 SNVFI 运行过程中应排除的染色体（步骤 7.6）。SNVFI 生成的 VAF 图（图5）为样本中变异等位基因频率的直方图。若密度图中在 0.5 处出现峰值，则表明样本为克隆性样本。为了进一步探究突变背后的潜在生物学成因，可使用 R 软件包 MutationalPatterns15 对其进行分析。此处展示的是一个典型的分析结果，生成了 96 种三核苷酸突变谱图（图6）。除了对不同类型的突变进行量化外，该工具还可用于突变特征提取。
构建发育谱系树 
通过 IGV 验证克隆之间共享的突变，或在生殖系对照中以低等位基因频率（VAF）存在于克隆中的突变。当突变存在于样本中，但在生殖系中不具有高 VAF 水平时，被视为真实突变（图 7A）。若在 IGV 中未观察到突变，则视为假阳性，这种情况可能出现在比对质量较差的区域（图 7B）。在其他情况下，SNVFI 检测到的事件可能是遗漏的生殖系突变（图 7C）。对于这些突变，强烈建议对选定克隆进行靶向重测序以独立验证。在检测到克隆间共享的体细胞突变后，生成一个二元矩阵（步骤 10.8）。构建包含具有或不具有共享突变 A-M 的细胞的热图。在该热图上方展示发育谱系树（图 8）。
<img alt="细胞分选过程示意图；步骤：MSC培养、T细胞分离、克隆培养、DNA提取。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：基于输入材料的实验流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞分选与统计结果的流式细胞术图示；标记物：CD34、CD38、CD90、CD45RA。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：细胞分选策略。 首先对小型单核细胞进行设门，其次通过线性部分选择对单个细胞进行设门，然后对谱系阴性细胞进行设门。所有 CD34+ CD38- CD45- 细胞均进行单细胞分选。需注意棕色部分的细胞比例，这些细胞是通过“索引分选”（index sorting）选项高亮显示的已分选细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像中的细胞培养生长阶段；单层形成，相差显微可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：代表性细胞培养结果。 384 孔板中典型的 HSPC 克隆，分别为接种后（A）2 周和（B）4 周。(C) 培养基更换 2 周后的 MSC 培养。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="基因拷贝数变异图；基因组位置与拷贝数，HSPC 与 MSC 群体样本比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：核型分析。（A）克隆性HSPC培养物和（B）MSC群体样本。核型通过测序深度分析确定。两个图谱均显示样本核型正常。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="变异等位基因频率（VAF）直方图、密度图；遗传变异分析，数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：变异等位基因频率直方图。 在 SNVFI 最终过滤步骤前（VAF &gt;0.3），克隆中变异的变异等位基因频率（VAF）直方图。VAF = 0.5 处的峰值表明样本为克隆性。在 SNVFI 的最终过滤步骤中（VAF &gt;0.3），低 VAF 的亚克隆突变被排除。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="不同背景下各因素的相对贡献柱状图；基因为不同颜色标注。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：造血干细胞/祖细胞样本中体细胞突变的代表性突变谱分析。 图示为每种三核苷酸改变（中间碱基发生突变）对总突变谱的相对贡献。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因组测序结果示意图，比较样本与对照，突出显示突变和变异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：使用IGV16手动检查突变。（A）当突变存在于克隆中但不存在于混合样本中时，被视为真实突变。（B）当突变位于比对质量较差的区域时，被视为假阳性。（C）当突变存在于种系对照中时，被视为假阳性。垂直线指示被检出突变的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="聚类分析图；突变相互作用；遗传数据可视化；生物信息学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59846/59846fig8.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 8"> 
图8：发育谱系树的构建。 图示为一个树状图，表示在发育过程中分化的不同发育谱系。树状图下方的热图显示了不同克隆中突变的存在情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59846/59846fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

细胞中的体细胞突变模式反映了既往的致突变暴露，并可揭示发育谱系关系。本文介绍了一种对单个造血干细胞和祖细胞中的体细胞突变进行编目和分析的方法。

造血干细胞和祖细胞（HSPCs）在生命周期中会逐渐积累DNA突变，这些突变可能与年龄相关疾病的发生有关，例如……

通过该方法，我们能够准确测定单个造血干细胞中的突变数量。这些突变可用于解析突变过程并剖析造血细胞谱系。我们的方法通过在体外克隆造血干细胞，避免了全基因组扩增技术的使用，从而降低了错误率，有利于后续分析。造血干细胞基因组中存在的突变模式可以揭示其暴露于其中的致突变因素及DNA修复过程。首先按照文本方案中的描述准备样品材料并进行染色，然后配制25毫升造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养基。在384孔细胞培养板的每个孔中加入75微升HSPC培养基。为防止外周孔中培养基蒸发，向外围孔中加入 75 µL 无菌水或 PBS，且不要将这些孔用于细胞分选。活细胞信号 HSPC 的正确分选是本方案中最关键的步骤。根据染色样本中 10,000 个细胞的未染色对照设置 HSPC 分选的门控。通过在前向散射光高度（forward scatter height）与前向散射光面积比例（forward scatter area fraction）的线性图上圈定细胞群来门控单个细胞。使用未染色对照样本确定谱系（lineage）细胞群的门控范围。圈定CD34阳性细胞的门，并进一步针对CD38阴性、CD45RA阴性细胞设置特定门控，以对该亚群进行表征。将384孔板放入分选仪中，进行单细胞分选。如果分选仪支持，请开启保存索引分选数据的选项，以便后续追溯已分选的细胞。为了培养单细胞分选的造血干细胞（HSCs），需将带盖的384孔培养板用透明聚乙烯薄膜包裹。将384孔板转移至含5%二氧化碳的湿润化37摄氏度培养箱中，孵育三至四周，直至可见克隆形成。培养四周后，确定哪些孔的融合度达到30%或更高。对于每个克隆，预先在1.5毫升离心管中加入一毫升含1% BSA的PBS溶液，并根据对应的孔位标记离心管。用含1% BSA的PBS预润洗移液枪头，以减少细胞黏附在枪头上的数量。使用200微升移液器并调至75微升，反复吹打液体至少五次，同时用枪头刮擦孔板底部。将细胞悬液收集至与孔对应标记的微量离心管中。用最多 75 µL 新鲜的 1% BSA 和 PBS 在孔中重复吹打，以确保细胞最大程度地被收集。单克隆培养的细胞可能会贴附在孔底。使用标准的倒置光学显微镜检查各孔，确认所有细胞是否均已收集。如果所有汇合度超过30%的孔均已收获，则将384孔板放回培养箱中。单克隆培养物可增殖长达五周。以350 × g离心细胞悬液5分钟。应可见少量沉淀。小心移除上清液，仅保留约五微升。细胞沉淀可在负20摄氏度下冷冻，并在DNA提取前储存数月。存在于谱系早期分支中的突变也会在 bulk 样本中以亚克隆形式存在。晚期分支谱系由仅在 HSPC 之间共享的突变定义。为了鉴定存在于部分克隆中且在 bulk 样本中以亚克隆形式存在的突变，首先需筛选克隆间共有的体细胞突变。在基于 Unix 的终端中，编辑 filtersomatic.ne 文件以设置 pats 并调整其他参数。运行 filtersomatic。使用基于 Unix 的终端中的 r 脚本，通过 determine lowVAF bulk 分析，筛选在大量样本中亚克隆性存在的突变。这将为共有和独有的单核苷酸变异分别生成独立的 vcf 文件。通过比对所有突变位点，确定克隆之间共有但不在混合样本中出现的所有突变。使用 Integrative Genomic Viewer（简称 IGV）进行人工检查，以排除假阳性结果。当突变存在于所有克隆的种系中或位于比对质量较差的区域时，所检测到的突变被视为假阳性。真正的突变可能在两个克隆之间共享，或在群体样本中以亚克隆形式存在。需使用靶向测序或Sanger测序对所有共享位点进行独立的重新测序验证。利用共有突变构建突变与测序克隆的二进制表格，其中“0”表示该突变不存在，“1”表示该突变存在。使用基于R语言的函数将突变二进制表以热图形式输出，并附上显示细胞间谱系关系的树状图。热图表示每个细胞的突变状态。图中显示了由对照三号样本c生成的拷贝数分析结果示例，用于检测拷贝数变异。通过单核苷酸变异筛选生成的变异等位基因频率图，是样本中变异等位基因频率的直方图。密度图中在0.5处出现峰值，表明该样本为克隆性样本。此处展示的是典型的突变模式分析，生成包含 96 种三核苷酸组合的图谱。除了对不同类型的突变进行定量分析外，还可利用该工具进行突变特征提取。克隆间共享的突变或在克隆中存在于胚系对照中的突变，将使用 IGV 进行验证。当突变存在于样本中，且在生殖系中变异等位基因频率不高时，被视为真实突变。当突变在IGV中不存在时，被视为假阳性突变，这可能发生在比对质量较差的区域。在其他情况下，由单核苷酸变异过滤检测到的事件可能是被遗漏的生殖系变异。强烈建议对所选克隆中的这些突变进行靶向重测序以独立验证。在检测到克隆间共有的体细胞突变后，生成二元矩阵，并构建包含具有或不具有共有突变A至M的细胞的热图。图中显示了发育谱系树。对于本研究展示的元分析，下一步可利用突变特征分析来确定造血干细胞中活跃的突变过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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