表征人类血液的突变负荷与克隆组成

通过该方法，我们能够准确测定单个造血干细胞中的突变数量。这些突变可用于解析突变过程并剖析造血细胞谱系。我们的方法通过在体外克隆造血干细胞，避免了全基因组扩增技术的使用，从而降低了错误率，有利于后续分析。

造血干细胞基因组中存在的突变模式可以揭示其暴露于其中的致突变因素及DNA修复过程。首先按照文本方案中的描述准备样品材料并进行染色，然后配制25毫升造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养基。在384孔细胞培养板的每个孔中加入75微升HSPC培养基。

为防止外周孔中培养基蒸发，向外围孔中加入 75 µL 无菌水或 PBS，且不要将这些孔用于细胞分选。活细胞信号 HSPC 的正确分选是本方案中最关键的步骤。根据染色样本中 10,000 个细胞的未染色对照设置 HSPC 分选的门控。

通过在前向散射光高度（forward scatter height）与前向散射光面积比例（forward scatter area fraction）的线性图上圈定细胞群来门控单个细胞。使用未染色对照样本确定谱系（lineage）细胞群的门控范围。圈定CD34阳性细胞的门，并进一步针对CD38阴性、CD45RA阴性细胞设置特定门控，以对该亚群进行表征。

将384孔板放入分选仪中，进行单细胞分选。如果分选仪支持，请开启保存索引分选数据的选项，以便后续追溯已分选的细胞。为了培养单细胞分选的造血干细胞（HSCs），需将带盖的384孔培养板用透明聚乙烯薄膜包裹。

将384孔板转移至含5%二氧化碳的湿润化37摄氏度培养箱中，孵育三至四周，直至可见克隆形成。培养四周后，确定哪些孔的融合度达到30%或更高。对于每个克隆，预先在1.5毫升离心管中加入一毫升含1% BSA的PBS溶液，并根据对应的孔位标记离心管。

用含1% BSA的PBS预润洗移液枪头，以减少细胞黏附在枪头上的数量。使用200微升移液器并调至75微升，反复吹打液体至少五次，同时用枪头刮擦孔板底部。将细胞悬液收集至与孔对应标记的微量离心管中。

用最多 75 µL 新鲜的 1% BSA 和 PBS 在孔中重复吹打，以确保细胞最大程度地被收集。单克隆培养的细胞可能会贴附在孔底。使用标准的倒置光学显微镜检查各孔，确认所有细胞是否均已收集。

如果所有汇合度超过30%的孔均已收获，则将384孔板放回培养箱中。单克隆培养物可增殖长达五周。以350 × g离心细胞悬液5分钟。

应可见少量沉淀。小心移除上清液，仅保留约五微升。细胞沉淀可在负20摄氏度下冷冻，并在DNA提取前储存数月。

存在于谱系早期分支中的突变也会在 bulk 样本中以亚克隆形式存在。晚期分支谱系由仅在 HSPC 之间共享的突变定义。为了鉴定存在于部分克隆中且在 bulk 样本中以亚克隆形式存在的突变，首先需筛选克隆间共有的体细胞突变。

在基于 Unix 的终端中，编辑 filtersomatic.ne 文件以设置 pats 并调整其他参数。运行 filtersomatic。

使用基于 Unix 的终端中的 r 脚本，通过 determine lowVAF bulk 分析，筛选在大量样本中亚克隆性存在的突变。

这将为共有和独有的单核苷酸变异分别生成独立的 vcf 文件。通过比对所有突变位点，确定克隆之间共有但不在混合样本中出现的所有突变。使用 Integrative Genomic Viewer（简称 IGV）进行人工检查，以排除假阳性结果。

当突变存在于所有克隆的种系中或位于比对质量较差的区域时，所检测到的突变被视为假阳性。真正的突变可能在两个克隆之间共享，或在群体样本中以亚克隆形式存在。需使用靶向测序或Sanger测序对所有共享位点进行独立的重新测序验证。

利用共有突变构建突变与测序克隆的二进制表格，其中“0”表示该突变不存在，“1”表示该突变存在。使用基于R语言的函数将突变二进制表以热图形式输出，并附上显示细胞间谱系关系的树状图。热图表示每个细胞的突变状态。

图中显示了由对照三号样本c生成的拷贝数分析结果示例，用于检测拷贝数变异。通过单核苷酸变异筛选生成的变异等位基因频率图，是样本中变异等位基因频率的直方图。密度图中在0.5处出现峰值，表明该样本为克隆性样本。

此处展示的是典型的突变模式分析，生成包含 96 种三核苷酸组合的图谱。除了对不同类型的突变进行定量分析外，还可利用该工具进行突变特征提取。克隆间共享的突变或在克隆中存在于胚系对照中的突变，将使用 IGV 进行验证。

当突变存在于样本中，且在生殖系中变异等位基因频率不高时，被视为真实突变。当突变在IGV中不存在时，被视为假阳性突变，这可能发生在比对质量较差的区域。在其他情况下，由单核苷酸变异过滤检测到的事件可能是被遗漏的生殖系变异。

强烈建议对所选克隆中的这些突变进行靶向重测序以独立验证。在检测到克隆间共有的体细胞突变后，生成二元矩阵，并构建包含具有或不具有共有突变A至M的细胞的热图。图中显示了发育谱系树。对于本研究展示的元分析，下一步可利用突变特征分析来确定造血干细胞中活跃的突变过程。