Name: 毛里小肠内皮淋巴细胞的内质成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解利用倒置转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像的方法，以可视化GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞。该技术可实时追踪黏膜免疫细胞动态长达4小时，助力研究肠道免疫-上皮相互作用。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R21 AI143892项目、新泽西健康基金会资助项目以及Busch生物医药资助项目（KLE）支持。我们感谢Madeleine Hu在稿件编辑以及提供代表性结果中所示数据方面的帮助。

所有研究均在经国际实验动物评估和认可委员会（AALAC）认证的设施中进行，并遵循罗格斯新泽西医学院比较医学资源部门批准的方案。
1. 小鼠准备
注意：以下操作步骤，包括动物准备和手术，将耗时30–40分钟。手术前，请打开显微镜，并将显微镜上的封闭式培养箱预热至37 °C。
<ol>
	<li>使用8至10周龄、背景为C57BL/6的TcrdEGFP小鼠进行实验，该小鼠由法国巴黎INSERM的Bernard Malissen提供。根据IACUC批准的操作规程，根据动物体重通过腹腔注射给予氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过呼吸频率（55–65次/分钟）21、脚趾夹捏反应及眼睑反射评估麻醉深度。</li>
	<li>当达到外科手术麻醉水平后，用胶带将小鼠后肢固定在加热垫上以维持体温，并可通过直肠温度计监测体温。若出现麻醉减退迹象（如呼吸频率增加、眨眼和/或眼睑反射引起的眼肌抽搐），则每次追加注射50 μL氯胺酮/赛拉嗪混合液，直至小鼠完全镇静。</li>
	<li>通过将50 µL Hoechst 33342（10 mg/mL）与315 µL 0.9%生理盐水混合配制核染料；根据小鼠体重，最终剂量为37.5 mg/kg（注射体积约为200 µL）。小鼠麻醉成功后，使用结核菌素注射器缓慢经眶后静脉窦注射Hoechst染料。 
	注意：注射后需等待1–2分钟再进行下一步操作，以便小鼠适应眶后注射引起的循环血量变化。</li>
	<li>在眼睛表面涂抹少量润滑剂，防止角膜干燥。</li>
</ol>
2. 小鼠手术：剖腹术暴露肠黏膜
<ol>
	<li>沿下腹部正中线做一条2 cm的纵向切口，切开皮肤和腹膜，将待成像的肠段暴露于体外。</li>
	<li>使用弯头镊子小心地将盲肠从腹腔中拉出，并确定待成像的小肠区域。操作过程中注意避免撕裂肠系膜血管。为尽量减少可能的损伤或出血，切勿用镊子夹持或抓取肠管。</li>
	<li>选择一段适合成像的小肠区域（2–3 cm），该区域应含有最少的粪便内容物。小心地将盲肠和其余小肠还纳至腹腔内，仅使目标肠段保持外置。 
	注意： 此步骤中应避免穿刺盲肠或破坏肠系膜血管系统。</li>
	<li>在肠系膜下方的血管之间，于两侧各放置一对镊子，轻轻摩擦镊尖以在膜上制造一个小孔（图1）22。此孔可用于在肠道下方缝合腹膜时引导针头穿过肠系膜。</li>
	<li>在保持肠段外置的同时关闭腹壁切口。使用弯头镊子和连接于5 cm缝线上的弯曲锥形针，从腹膜一侧穿入，穿过上一步制造的孔，再从另一侧腹膜穿出。在切口上端和下端各缝合一针。 
	注意： 此步骤中应避免损伤血管系统。</li>
	<li>重复上述操作以关闭肠段下方的皮肤切口，在切口中间位置缝合一针，该位置应位于腹膜层先前缝合线之间。 
	注意： 仅将需要成像的区域外置至关重要，这可减少成像过程中的额外移动。务必避免结扎肠系膜动脉。</li>
	<li>使用电灼器沿对系膜缘进行连续点状灼烧形成穿孔线。电灼后立即在肠表面滴加数滴水，以防止热损伤进一步扩大。用Kimwipe纸轻轻吸干残留水分。</li>
	<li>使用Vannas剪刀在电灼组织的远端边缘剪开一个小的横向切口，然后沿电灼线向近端方向剪开，直至完成约1.5 cm长的切口，以暴露黏膜面。 
	注意： 如有必要，可用镊子轻轻清除暴露的黏膜表面残留的多余粪便内容物。</li>
	<li>用湿润的Kimwipe纸覆盖小鼠腹部，防止组织脱水。将小鼠置于密闭容器中并运送至显微镜处进行成像。</li>
</ol>
3. 采用旋转盘共聚焦显微镜进行图像采集
<ol>
	<li>用移液器将150 µL浓度为1 µM的AlexaFluor 633 HBSS溶液滴加到35 mm培养皿的玻璃盖玻片底部。调整小鼠位置，使其暴露的黏膜表面直接接触盖玻片。</li>
	<li>将显微镜头部向后倾斜，将小鼠放置在成像载物台上的盖玻片培养皿中，并置于预热的培养箱内。或者，可用加热毯覆盖小鼠以维持其体温。</li>
	<li>启动成像软件。为避免光漂白并最小化时间点之间的间隔，每种激光的激发强度和曝光时间分别不应超过10–15 mW或120–150 ms。将帧平均值设为“2”，并开启EM增益功能以降低背景噪声。选择63倍物镜校准，以确保像素尺寸的准确测量。 
	注意：上述设置旨在提供初始参考，具体参数可能因不同显微镜配置而有所调整。</li>
	<li>使用405 nm激光和20倍空气物镜，观察细胞核以定位一片无明显运动或漂移的绒毛区域。避免因呼吸、蠕动或心跳引起伪运动的区域。</li>
	<li>使用XY扫描功能记录目标区域的XY坐标，然后切换至甘油浸没式63倍物镜。</li>
	<li>通过在405 nm通道获取最多1分钟的实时图像，确认所选视野中的绒毛处于稳定状态。</li>
	<li>在405 nm通道持续获取实时图像的同时，调节焦距以找到绒毛顶端正下方的正交平面。使用1.5 µm步长，从绒毛顶端上皮下方开始向下采集Z轴层扫图像，直至难以分辨细胞核为止，深度约为15–20 µm。 
	注意：当使用上述曝光时间对三个通道（405、488、640 nm）进行成像时，可依次以约20秒的时间间隔获取全部三个通道的图像。</li>
	<li>在开始采集后3–5分钟，以分析模式打开软件，确认图像稳定性及γδ IEL的运动性。对每片绒毛区域继续采集图像30–60分钟。每只小鼠记录2–3个视野。成像过程中，每5分钟监测一次小鼠状态。 
	注意：若麻醉效果开始减弱，可用镊子轻轻夹住小鼠颈部皮肤，每次追加50 µL的氯胺酮/赛拉嗪混合物。持续监测麻醉深度，并在必要时重复给药。</li>
	<li>不建议对同一只小鼠进行超过4小时的成像。图像采集完成后，通过颈椎脱位继以双侧气胸法处死小鼠。</li>
</ol>
4. 图像的4D分析
<ol>
	<li>将成像文件直接导入4D渲染软件。</li>
	<li>分别为内弹性层（IELs）和管腔创建表面，然后以表1中列出的参数作为初始参考，对这些表面前后时间点进行追踪。对于IELs，启用“分割接触物体”功能，并使用指定的种子点直径。</li>
	<li>使用自回归追踪算法确定IEL的运动性。尽管该追踪算法相对准确，但仍必须对每个IEL的轨迹进行目视检查。若发现轨迹错误，可在编辑轨迹选项卡下使用断开连接和连接功能进行修正。</li>
	<li>为确定每个IEL到管腔的距离，选择管腔的表面，然后在工具菜单下执行距离变换功能。提示时选择表面外部。计算完成后，距离变换结果将以第4通道的形式显示。</li>
	<li>通过筛选第4通道的最小强度，选择位于侧向细胞间间隙（LIS）内的γδ IELs。该阈值应接近15 µm，依据为柱状上皮细胞的高度。处于此范围内的γδ IELs占总γδ IELs的百分比，即报告为LIS中γδ IELs的频率。</li>
	<li>为进一步分析，导出包括IEL轨迹速度、位移、轨迹直线度和轨迹长度在内的统计学数据。或者，可使用Vantage模块进行数据分析。根据实验需求，从获取的数据中提取额外参数，如IEL在LIS内的停留时间或IEL与上皮细胞的相互作用。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

活体显微技术的发展为观察难以接近的组织中亚细胞结构的重组8,9,22、细胞间相互作用12,25以及细胞迁移行为13,14,15,16,26提供了前所未有的机会。长期以来，缺乏有效的工具用于研究γδ型肠上皮内淋巴细胞（γδ IELs）在体内的调控机制与功能18,27，而活体成像技术的应用则为探究IEL...

上皮内淋巴细胞（IEL）位于肠上皮内，分布在基底膜以及相邻上皮细胞之间的侧向细胞间隙中1。每5–10个上皮细胞中约有一个IEL；这些IEL作为哨兵细胞，对广阔的肠上皮屏障进行免疫监视2。表达γδ T细胞受体（TCR）的IEL可占小鼠小肠总IEL群体的60%。在缺乏γδ T细胞的小鼠模型中的研究表明，这些细胞在应对肠道损伤、炎症和感染时具有显著的保护作用3,4,5。尽管已成功构建Tcrd基因敲除小鼠模型6，但由于尚未明确γδ TCR所识别的配体，目前对γδ IEL生物学特性的理解仍十分有限7。因此，由于缺乏研究该细胞群体的有效工具，人们难以探究γδ TCR在生理和病理条件下激活及其功能的具体机制。为填补这一空白，我们开发了活体成像技术，用于可视化观察γδ IEL的迁移行为及其与邻近肠上皮细胞的相互作用，从而进一步揭示γδ IEL在体内对外界刺激的功能响应特性。
在过去十年中，活体成像技术极大地拓展了我们对肠道生物学多个方面所涉及的分子事件的理解，包括上皮细胞脱落8、上皮屏障功能的调控9,10、髓系细胞对管腔内容物的取样11,12，以及宿主与微生物之间的相互作用11,13,14,15,16。在肠上皮内淋巴细胞（IEL）生物学的研究背景下，活体显微技术揭示了IEL运动的时空动态及其介导巡视行为的相关因素13,14,15,16。TcrdH2BeGFP（TcrdEGFP）报告小鼠模型的建立可使γδ IEL通过核内表达GFP被标记17，该模型揭示了γδ IEL在上皮层内具有高度运动性，并表现出一种对微生物感染具有响应的独特巡视行为17,13,14。最近，另一种γδ T细胞报告小鼠模型（Tcrd-GDL）被开发出来，其在细胞质中表达GFP，从而实现对整个细胞的可视化18。类似的方法已被用于研究特定趋化因子受体（如G蛋白偶联受体（GPCR）-18和-55）在IEL运动动态中的必要性19,20。在缺乏细胞特异性报告系统的情况下，研究人员使用荧光标记的抗CD8α抗体在体内对IEL的运动进行可视化和追踪19,20。尽管双光子激光扫描显微镜常用于活体成像，但转盘共聚焦激光显微镜具有独特优势，能够以极低背景噪声获取高速、高分辨率的多通道图像。该技术非常适合阐明肠道黏膜复杂微环境中免疫细胞与上皮细胞相互作用的时空动态。此外，结合多种转基因和/或基因敲除小鼠模型的应用，这些研究有助于深入理解肠道免疫细胞和/或上皮细胞功能的分子调控机制。

<table><tbody><tr><td>35 mm 培养皿，No. 1.5 盖玻片</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 肼</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 皮下注射针头 - 27 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip 无菌注射器 - 1 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD 结核菌素注射器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>电凝器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>封闭式培养孵育室</td><td>OKOLAB</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>眼科针，尺寸 #3；1/2 圆弧，锥形尖端，12 mm 弦长</td><td>Roboz</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris（v. 9.2.1），含 Start、Track、XT 模块</td><td>Bitplane</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>倒置显微镜 DMi8</td><td>Leica</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>IQ3（v. 3.6.3）</td><td>Andor</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Putney</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 剪刀 3&amp;rdquo;（7.5 cm）长，5 × 0.15 mm 直头锐利</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收外科缝线，丝线卷，黑色编织</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>Nugent 镊子 4.25&amp;rdquo;（11 cm）长，弯头光滑，尖端 1.2 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏</td><td>Dechra</td><td></td><td>润滑性眼用软膏</td></tr><tr><td>转盘式 Yokogawa CSU-W1，配备 63× 1.3 N.A. HC PLAN APO 甘油浸没物镜、iXon Life 888 EMCCD 相机、405 nm 二极管激光器、488 nm DPSS 激光器、640 nm 二极管激光器</td><td>Andor</td><td></td><td>共聚焦系统</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr></tbody></table>

小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

表达γδ T细胞受体的上皮内淋巴细胞（γδ IEL）在肠道上皮的免疫监视中发挥关键作用。部分由于γδ T细胞受体缺乏明确的配体，目前对γδ IEL活化调控机制及其在体内功能的理解仍然有限。这促使人们需要开发替代策略，以探究调控γδ IEL功能的信号通路以及这些细胞对局部微环境的响应能力。尽管普遍认为γδ IEL可限制病原体的易位，但活体成像技术的应用对于理解稳态条件下以及应对侵袭性病原体时IEL与上皮细胞相互作用的时间-空间动态至关重要。本文中，我们介绍了一种利用倒置转盘共聚焦激光显微镜对GFP标记的γδ T细胞报告小鼠小肠黏膜中IEL迁移行为进行可视化观察的实验方案。尽管该方法的最大成像深度相较于双光子激光扫描显微镜有所局限，但转盘共聚焦激光显微镜具有高速图像采集、光漂白和光损伤更少的优势。通过使用4D图像分析软件，可在实验干预后分析T细胞的监视行为及其与邻近细胞的相互作用，从而进一步揭示IEL在肠黏膜中的活化机制与功能特性。

通过活体成像技术观察TcrdEGFP报告小鼠，我们先前已发现γδ型肠上皮内淋巴细胞（γδ IELs）表现出动态的监视行为：在稳态条件下，这些细胞沿基底膜迁移并进入侧向细胞间间隙（LIS），在上皮层中进行巡逻（图2，视频1）。
该方法还可用于评估特定细胞信号通路和/或受体的抑制如何影响γδ上皮内淋巴细胞（γδ IEL）的迁移行为。例如，白细胞介素（IL）-15是一种多效性细胞因子，对γδ IEL的稳态至关重要23,24。为了确定通过IL-2Rβ受体的IL-15信号传导是否影响稳态下γδ IEL运动的动力学特征，我们在给予抗IL-2Rβ抗体（TM-β1）或同型IgG2b对照抗体后2小时，对TcrdEGFP报告小鼠进行了成像。彩色轨迹表示单个γδ IEL在30分钟内的迁移路径（图3A）。尽管在TM-β1处理的小鼠中，固有...

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ IELs）的方法。该技术可实现对黏膜内活细胞长达4小时的动态追踪，可用于研究多种肠道免疫细胞与上皮细胞之间的相互作用。&#160;

表达 γδ T 细胞受体的上皮内淋巴细胞（γδ IEL）在肠道免疫监视中发挥关键作用……

对小肠黏膜进行活体显微观察，可揭示上皮内不同免疫细胞类型之间，或这些不同区室之间的细胞相互作用在时空上的动态变化。该技术的主要优势在于，能够实时获取肠道黏膜内高速、高分辨率的图像。对肠道进行活体成像，可进一步加深对黏膜免疫、上皮生物学或癌症生物学中细胞相互作用或细胞信号传导的理解。这是一种具有挑战性的方法，需要反复练习手术技术，同时需要耐心并对小鼠进行最佳定位以进行图像采集。在确认经麻醉的转基因小鼠对脚趾夹捏无反应后，该小鼠表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）Gamma-delta T细胞受体，使用结核菌素注射器将200 µL新配制的Hoechst 33342染料溶液缓慢注入小鼠眶后静脉窦。注射后1至2分钟，将眼膏涂抹于动物眼睛上，以防止其眼球干燥。然后，沿下腹部正中线通过皮肤和腹膜做一个2 cm的垂直切口，使用弯头镊子小心地将盲肠从腹腔中拉出。辨认一段2-3 cm、粪便含量较少的小肠，注意避免撕裂肠系膜血管，随后小心地将盲肠和其余小肠还纳至腹腔内，使目标肠段保留在腹腔外。在血管之间的下方肠系膜两侧各放置一对镊子，轻轻摩擦镊尖，使膜上形成一个小孔。使用斜角镊子和连接在5CM缝线上的弯曲圆锥头针，从腹膜膜孔的一侧穿入，再从腹膜内衬的另一侧穿出，在切口顶部和底部附近各缝合一针以闭合切口，同时保持肠段外置。为提高手术成功率，在缝合腹膜时应避免结扎或撕裂任何血管，并尽量减少对肠段的额外操作。随后，以相同方式缝合肠段下方的皮肤，在腹膜下层先前缝线之间的切口中部位置缝合一针。使用电灼器沿肠管对系膜缘进行穿孔划线，并立即在肠管表面滴加少量水，以防止热损伤进一步加重。用无尘纸巾轻拭，去除残留水分。使用Vanna剪刀在灼烧组织的远端边缘，沿灼烧线方向，向体外肠段近端剪开一个约1.5 cm的横向切口。当黏膜表面暴露后，用湿润的擦镜纸覆盖腹部，以保持组织湿润。进行转盘共聚焦显微镜成像时，将小鼠置于密闭容器中转移至显微镜。启动成像软件，向后倾斜显微镜头部，并在玻璃盖玻片的滑落底部加入 150 µL 的 1 µmol 跳蚤 Alexa Fluor 染料与 Hank's 平衡盐溶液。将小鼠放置，使打开的黏膜表面直接接触盖玻片。将小鼠和培养皿置于预热孵育箱内的成像载物台上。将每种激光的激发强度和曝光时间分别设置为不超过10–15毫瓦和120–150毫秒，并将帧平均值调整为2。打开电子倍增增益功能以降低背景噪声，并选择63倍物镜校准，以确保像素尺寸的准确测量。使用405纳米激光和20倍空气物镜，手动观察细胞核，定位一个缺乏明显运动或漂移的绒毛区域，避免因呼吸、蠕动或心跳引起的伪影运动区域。通过X-Y扫描记录目标区域的X-Y坐标，然后切换至甘油浸没式63倍物镜。在405纳米通道上获取活体图像，持续最多1分钟，以确认所选视野中的绒毛处于稳定状态，同时调整焦距以找到绒毛尖端正下方的正交平面。然后开始采集z轴层扫图像，起始于绒毛尖端上皮下方约15–20微米处，以1.5微米为步长向下扫描，直至难以分辨细胞核为止。在开始采集后的3–5分钟，确认图像稳定性及γδ型上皮内淋巴细胞的运动情况，并继续对每组绒毛视野采集图像30–60分钟。γδ 上皮内淋巴细胞表现出一种动态的监视行为，在稳态下沿基底膜迁移并进入侧向细胞间间隙，从而在上皮组织中进行巡逻。在这些代表性图像中，不同颜色的轨迹表示单个 γδ 上皮内淋巴细胞在30分钟内的迁移路径。尽管经抗白细胞介素-2受体β抗体处理的小鼠中，侧向细胞间间隙内的上皮内淋巴细胞频率有所增加，但仍有超过30%的这些 γδ 上皮内淋巴细胞表现出静息状态行为。通过白细胞介素-2受体阻断后，与对照组相比，γδ型上皮内淋巴细胞的瞬时速度和限制性比率均显著降低，从而证实了这种静息表型。此外，静息状态的γδ型上皮内淋巴细胞停留时间更长，并且相较于运动型γδ型上皮内淋巴细胞，更常定位于细胞间的侧向间隙中。由于蠕动作用导致的过度运动，可能难以识别缺乏明显移动的小肠绒毛视野。调整小鼠的位置可能有助于找到更稳定的视野。对细胞追踪数据的进一步分析可能有助于识别特定的运动行为，或提供额外的指标来测量细胞间的相互作用。活体成像及对上皮内淋巴细胞（IEL）运动性的分析已成为评估 IEL 功能的标准方法，有助于揭示固有免疫信号如何调控 γδ 上皮内淋巴细胞（Gamma-delta IEL）的功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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激光消融与活体显微成像技术研究肠道重塑

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小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

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