Name: RNA甲基转移酶活性分析的无抗体测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 了解RNA甲基转移酶活性分析的无抗体测定方法，使用氚标记S-腺苷甲硫氨酸进行体外甲基化检测。该技术可定量与定性分析RNA甲基化，适用于研究RNA修饰酶功能及抑制剂筛选。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢 Dr. Turja Kanti Debnath 在 ChemDraw 使用方面提供的帮助。Xhemalçe 实验室的研究工作得到了美国国防部—&#160;国会指定医学研究计划—&#160;乳腺癌突破性奖项（W81XWH-16-1-0352）、NIH 基金 R01 GM127802，以及美国德克萨斯大学奥斯汀分校细胞与分子生物学研究所和自然科学学院启动资金的支持。

1. 目标RNA的体外转录及凝胶纯化
<ol>
	<li>使用已建立的分子克隆技术12或试剂盒，将目标序列克隆至含有T7和/或SP6启动子的质粒中。</li>
	<li>为体外转录线性化DNA模板
	<ol>
		<li>使用特异性引物对质粒进行PCR扩增，获得目标序列，引物设计需包含T7启动子区域及插入片段上下游各+20–30 bp，具体方法如前所述13。</li>
		<li>或者，根据限制性内切酶（RE）供应商提供的说明，使用插入片段下游存在的限制性内切酶切点消化5 µg质粒。 
		注意：务必确认所选限制性内切酶不会切割插入片段。本步骤中限制性内切酶的选择会显著影响转录产物的产量。优先选择产生平末端或5'突出末端的限制性内切酶，以避免T7 RNA聚合酶在相反DNA链上发生模板转换14。若初始产量不足，可尝试不同的限制性内切酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用DNA琼脂糖凝胶提取与纯化试剂盒纯化所得DNA，用30 µL水洗脱DNA。</li>
	<li>涡旋充分混匀，取1.5 µL用微量分光光度计测定DNA浓度。</li>
	<li>取250 ng DNA，在1x TBE缓冲液中进行1%琼脂糖凝胶电泳（4 V/cm，1小时），以检测纯化后DNA的质量和大小。</li>
	<li>解冻体外转录试剂盒中的冷冻试剂。将T7 RNA聚合酶混合液置于冰上，其余试剂置于室温摇床上。完全解冻后，立即对rNTP管短暂离心5秒，使溶液沉至管底，并放回冰上。10x反应缓冲液保持在室温，以防沉淀析出。</li>
	<li>在室温下，按以下顺序向1.5 mL离心管中加入20 µL体外转录反应体系各组分：6 µL水、2 µL（0.1–1 µg）线性DNA模板、2 µL 75 mM ATP溶液、2 µL 75 mM GTP溶液、2 µL 75 mM CTP溶液、2 µL 75 mM UTP溶液、2 µL 10x反应缓冲液和2 µL T7 RNA聚合酶混合液。 
	注意：对于PCR获得的DNA模板，使用100–&#160;200 ng DNA；对于质粒经限制性内切酶消化获得的DNA模板，使用约1 µg。具有活性的重组His6-标签T7 RNA聚合酶可在E. coli中纯化获得15。</li>
	<li>充分混匀反应管，短暂离心5秒使反应液沉至管底，然后在37 °C孵育2–4小时。 
	注意：每种转录产物的行为会因其DNA模板、长度、序列或结构不同而有所差异。可通过测试不同孵育时间（最长至6小时）、不同DNA模板浓度、T7 RNA聚合酶浓度或NTP浓度，或在T7 RNA聚合酶混合液基础上额外添加MgCl2，优化体外转录条件。</li>
	<li>孵育结束后，每20 µL反应体系加入1 µL DNase I，在37 °C继续孵育15分钟。 
	注意：转录反应可在冰上暂时保存，直至聚丙烯酰胺凝胶准备就绪。</li>
	<li>进行聚丙烯酰胺凝胶纯化。 
	注意：由于RNA对pH敏感且易受RNase污染，应使用专用于RNA操作的设备和无RNase试剂。</li>
	<li>根据目标转录本的大小确定聚丙烯酰胺凝胶的百分比：3.5%用于100–2000 nt（XC：460 nt；BB：100 nt），5%用于80–500 nt（XC：260 nt；BB：65 nt），8%用于60–400 nt（XC：160 nt；BB：45 nt），12%用于40–200 nt（XC：70 nt；BB：20 nt），15%用于25–150 nt（XC：60 nt；BB：15 nt），20%用于6–100 nt（XC：45 nt；BB：12 nt）。</li>
	<li>在50 mL锥形管中混合以下试剂，配制含尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶：9.6 g分子级尿素、2 mL 10x TBE、x mL 40%丙烯酰胺:双丙烯酰胺混合液（29:1），加水至总体积20 mL，其中x = 20 mL / (40% / 凝胶百分比%)。 
	警告：聚丙烯酰胺凝胶常含有未聚合的丙烯酰胺，该物质具有毒性，可能对环境造成危害。应通过机构的化学废弃物处理程序处置聚丙烯酰胺凝胶。</li>
	<li>在30%功率下微波加热15秒，室温置于摇床上约10分钟，直至尿素完全溶解。</li>
	<li>在凝胶混合物旋转期间，取出凝胶板（18孔，1 mm厚；13.3 x 8.7 cm（宽 x 长）），取出梳子并放置凝胶板以准备灌胶。</li>
	<li>对50 mL锥形管短暂离心5秒，使凝胶溶液沉至管底。加入125 µL 10%过硫酸铵溶液（APS），置于摇床上约1分钟，再次短暂离心5秒。</li>
	<li>加入25 µL四甲基乙二胺（TEMED），用25 mL移液器轻轻吹打5次，充分混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>将混合液注入凝胶模具中，小心插入梳子，避免产生气泡。</li>
	<li>在凝胶板顶部加一个大号文件夹夹紧密封。</li>
	<li>让凝胶聚合1小时。</li>
	<li>凝胶完全凝固后，取下夹子，将凝胶板插入电泳槽中，向上下槽加入1x TBE缓冲液。</li>
	<li>取出转录反应产物，加水至总体积100 µL，再加入100 µL 2x上样缓冲液。另取一个1.5 mL离心管，将推荐量的DNA标记物与水混合至10 µL，并加入10 µL 2x上样缓冲液，配制上样标记物。</li>
	<li>将标记物和体外转录反应产物在恒温混匀仪中70 °C孵育15分钟。</li>
	<li>当样品在70 °C变性时，小心取出梳子，用P1000移液器反复吹打每个加样孔以清洗孔道，然后立即以100 V预电泳10分钟。</li>
	<li>样品完成70 °C、15分钟变性后，从恒温混匀仪中取出离心管，立即置于冰上。</li>
	<li>再次用P1000移液器清洗凝胶的每个加样孔。在最左侧第一个孔加入20 µL标记物，接下来10个孔各加入20 µL RNA样品，未使用的孔加入20 µL 1x上样缓冲液。</li>
	<li>以100 V电泳60–240分钟，具体时间取决于聚丙烯酰胺凝胶的百分比。 
	注意：上样缓冲液中的染料在凝胶中迁移时会分离为两条带，一条是迁移较慢的溴酚蓝（BB）蓝色带，另一条是迁移较快的二甲苯青（XC）青色带。这些染料在不同浓度聚丙烯酰胺凝胶中的大致迁移位置已知（见步骤1.11），可用于估计RNA在凝胶中的迁移情况。</li>
	<li>电泳结束后，小心将凝胶从凝胶板中取出。</li>
	<li>将凝胶放入盛有50 mL 1x TBE缓冲液和50 µL核酸染色液的洁净容器中，在摇床上染色5分钟，使RNA显色。</li>
	<li>在凝胶成像系统上拍摄切胶前后的图像，建议使用蓝光而非紫外透射光源。</li>
	<li>使用无核酸酶的一次性凝胶切割头切下目标条带。每切一个条带后，将含有凝胶片的切割头转移至一个1.5 mL离心管中，短暂离心以收集凝胶片。重复此操作，直至所有目标条带均收集至同一1.5 mL离心管中。</li>
	<li>收集完所有凝胶片后，向1.5 mL离心管中加入100 µL无核酸酶水或TE缓冲液，4 °C保存约48小时。此步骤可使RNA从凝胶片中扩散至溶液中。</li>
	<li>48小时后，将液体转移至新的1.5 mL离心管中，弃去剩余凝胶片。按以下步骤使用纯化试剂盒纯化RNA：
	<ol>
		<li>将离心柱在室温平衡至少30分钟。</li>
		<li>向步骤1.32中新1.5 mL离心管中的100 µL RNA溶液中加入350 µL RLT缓冲液，在摇床上充分混匀2分钟。以200 x g短暂离心1秒，使溶液沉至管底。</li>
		<li>加入675 µL 100%乙醇，在摇床上充分混匀2分钟。以200 x g短暂离心1秒，立即进行下一步。</li>
		<li>将565 µL混合液转移至离心柱中，以15,000 x g离心1分钟。用移液器吸弃收集管中的废液。</li>
		<li>对样品的另一半重复上一步操作。</li>
		<li>向离心柱中加入500 µL RPE缓冲液，以15,000 x g离心1分钟。用移液器吸弃收集管中的废液。</li>
		<li>向离心柱中加入750 µL 80%乙醇，以15,000 x g离心1分钟。用移液器吸弃收集管中的废液。</li>
		<li>将离心柱放入新的2 mL收集管中，开盖以15,000 x g离心5分钟。</li>
		<li>将离心柱转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>在离心柱中心加入17 µL水，以15,000 x g离心1分钟进行洗脱。再用另外17 µL水洗脱一次。总回收体积应为32 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>涡旋充分混匀，取1.5 µL用微量分光光度计测定RNA浓度。</li>
	<li>使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（参照步骤1.11–1.29）检测RNA纯化的质量。</li>
</ol>
2. 体外RNA甲基转移酶实验
<ol>
	<li>在冰上用1.5 mL离心管配制100 µL RNA甲基转移酶反应体系，具体如下：23 µL水，10 µL 10x TBS（500 mM Tris-HCl，pH 7.5；1.5 M NaCl），2 µL 0.05 M EDTA，5 µL 100 mM DTT，40 µL 50%甘油，4 µL 58 µM 3H-SAM，5 µL 20x蛋白酶抑制剂混合液，1 µL RNaseOUT（可选），5 µL RNA和5 µL甲基转移酶。 
	警告：放射性氚标记物质具有危害性，操作时必须佩戴手套、实验服及其他必要的个人防护装备。所有接触过放射性物质的移液枪头和离心管均视为固体放射性废物。请根据实验室批准的放射性废物处理规程妥善处置所有固体和液体放射性废物。 
	注意：应设置不含甲基转移酶和不含RNA的对照样品。试剂浓度可能需要优化，或添加二价阳离子盐（如MgCl2）或未标记的SAM。RNA终浓度的最佳范围为50 nM至1 µM，甲基转移酶终浓度为25 nM至300 nM。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀。在200 x g下离心5秒，使溶液沉至管底。将离心管于37 °C孵育2小时。</li>
	<li>使用柱纯化法对反应产物进行纯化，操作同步骤1.32。 
	警告：处理放射性材料时需格外小心，尤其是在柱洗涤过程中（应使用移液器排出废液，而非抽吸收集管中的废液）。</li>
	<li>进行液体闪烁计数
	<ol>
		<li>准备闪烁计数架，每个样品使用一个计数瓶，另设一个背景测量瓶和一个擦拭测试瓶。向各瓶中加入5 mL闪烁计数液。</li>
		<li>取10 µL每份洗脱的放射性RNA样品加入一个计数瓶中，拧紧瓶盖并轻轻混匀。</li>
		<li>准备擦拭测试瓶。用棉签彻底擦拭实验过程中使用的所有表面和设备。将棉签放入盛有5 mL闪烁液的计数瓶中，拧紧瓶盖。</li>
		<li>在闪烁计数器上运行样品，操作如下：打开计数器盖，将计数架放入仪器中并关闭盖子。选择计数单个架子。选择选择用户程序。选择或创建一个针对氚（3H）测量60秒的程序。点击计数架子。重复闪烁计数三次。 
		注意：仪器将测量每个样品的闪烁计数，并在屏幕和打印输出中显示结果。如需可在此暂停实验流程。步骤2.3中剩余的RNA样品应于-80 °C冷冻保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行放射自显影
	<ol>
		<li>按照步骤1.11–1.20准备并预电泳尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。</li>
		<li>将20 µL放射性RNA样品转移至新的1.5 mL离心管中，加入20 µL 2x上样缓冲液，充分混匀。按步骤1.21准备DNA标记物。将样品于70 °C孵育15分钟。</li>
		<li>上样前立即再次冲洗凝胶加样孔。分别在对应泳道中加入20 µL已准备好的DNA标记物、20 µL样品以及剩余泳道中加入20 µL 1x上样缓冲液。根据聚丙烯酰胺浓度，以100 V电压电泳60–180分钟。</li>
		<li>电泳结束后，将凝胶从夹板中取出，放入盛有50 mL 1x TBE缓冲液和5 µL&#160;超敏核酸染料的盒子中。</li>
		<li>在摇床上染色5分钟，使RNA着色。</li>
		<li>小心将凝胶从盒子中取出，放置于凝胶成像系统的紫外透射仪上，确保加样孔朝上，标记物位于左侧。</li>
		<li>调整相机对焦于凝胶，打开紫外灯，根据信号强度曝光50毫秒至1秒，拍摄凝胶图像。</li>
		<li>关闭紫外曝光，将图像保存为Tiff文件。</li>
		<li>将凝胶放回盒子中，倒掉TBE缓冲液。加入50 mL固定液（50%甲醇，10%乙酸，40%超纯水），在摇床上室温固定30分钟。</li>
		<li>将凝胶轻轻转移至盛有25 mL放射自显影增强液的新黑色盒子中。若无黑色盒子，可用铝箔包裹盒子以避光保护溶液。</li>
		<li>在摇床上室温孵育30分钟。</li>
		<li>小心提起凝胶，将其加样孔朝上、标记物位于右侧的一面朝下放置于一张塑料膜上。在凝胶背面放置两张层析滤纸。轻轻翻转整个叠层。</li>
		<li>将凝胶干燥仪预热至80 °C。拉开干燥仪的塑料盖，将塑料膜、凝胶和层析滤纸叠层插入盖下，再将塑料盖推回以形成密封。</li>
		<li>在80 °C下干燥1小时。</li>
		<li>关闭凝胶干燥仪，小心取出叠层。去除塑料膜和第二张层析滤纸。将带有干燥凝胶的剩余层析滤纸用胶带固定于放射自显影暗盒中。</li>
		<li>在暗室中放入一张放射自显影胶片。</li>
		<li>将暗盒置于-80 °C，根据信号强度（可依据先前测得的闪烁计数判断）曝光1小时至4周：250–1,000 cpm对应1–4周，1,000–10,000 cpm对应24小时至1周，&#62;10,000 cpm对应1小时至24小时。</li>
		<li>胶片显影后，将其覆盖在暗盒上，用实验标记笔仔细标记凝胶的四个边缘、每个加样孔以及XC和BB染料的位置。</li>
		<li>以300或600像素/英寸的分辨率扫描胶片，并将图像保存为Tiff文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+histones+to+RNA%3A+role+of+methylation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+Watches+the+Watchmen%3A+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).</li>
<li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+methylation+of+m%286%29Am+in+the+5%27+cap+controls+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U6+snRNA+m%286%29A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+UTR+m%286%29A+Promotes+Cap-Independent+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li>
<li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li>
<li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li>
<li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).</li>
<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了一种简单且可靠的体外验证RNA甲基转移酶对特定转录本活性的方法。该检测方法利用了S-腺苷甲硫氨酸的甲基供体位置可被氚标记的特性（图1），从而无需使用抗体即可准确检测甲基化的RNA。然而需要注意的是，该方法无法确定酶催化甲基化修饰的具体残基或化学基团。若要鉴定或验证某一特定残基是否被甲基化，可将RNA甲基转移酶检测方法与突变分析、逆转录阻滞或RNA底物的质谱分析等其他技术联合使用。
RNA 的选择及其合成方式取决于 RNA 的大小。长度在 18 到 120 个核苷酸之间的特定 RNA 可以方便地从多家知名的核酸供应商处进行定制合成。然而，更常见的情况是通过体外转录来制备不同大小的特定 RNA。用于体外转录的 DNA 模板可通过多种方式获得，且需要将目标序列置于 T7 或 SP6 启动子的下游。当 RNA 的精确末端至关重要时，建议使用 pRZ 质粒17。该检测方法具有高灵敏度（图 3），因此也可用细胞 RNA...

DNA、RNA 和蛋白质都会发生修饰，这些修饰严格调控基因表达1。在这些修饰中，甲基化可发生在上述三种生物大分子上。过去三十年中，DNA 和蛋白质的甲基化已被广泛研究。相比之下，近年来由于发现能够书写、擦除或识别 RNA 甲基化的蛋白质在发育和疾病中发挥重要作用，RNA 甲基化的研究才重新受到关注2。除了在丰度较高的核糖体 RNA 和转运 RNA 中具有较明确的功能外，RNA 甲基化通路还调控特定信使 RNA 的稳定性3,4、剪接5以及翻译6,7、miRNA 加工8,9和转录暂停与释放10,11。
本文报道了一种在分子生物学实验室条件下体外验证RNA甲基转移酶活性的简单且稳健的方法（总结见图1）。许多研究通过使用针对目标RNA修饰的抗体进行点印迹（dot-blot）来评估RNA甲基转移酶的活性。然而，点印迹无法验证RNA在与RNA甲基转移酶孵育后的完整性。这一点至关重要，因为即使重组蛋白中存在微量核酸酶污染，也可能导致RNA部分降解，从而产生干扰性结果。此外，即使是高度特异性的RNA修饰抗体，也可能识别具有特定序列或结构的未修饰RNA。本文所述的体外RNA甲基转移酶检测方法利用了S-腺苷甲硫氨酸的甲基供体可被氚标记的特性（图1），从而无需使用抗体即可准确检测甲基化RNA。本文提供了目标转录本的体外转录与纯化，以及利用目标酶检测该转录本甲基化情况的操作步骤。该方法具有良好的灵活性和稳健性，可根据具体研究需求进行调整。例如，可使用体外转录并纯化的RNA、化学合成的RNA，也可使用细胞来源的RNA。该检测可提供以闪烁计数形式呈现的定量信息，以及通过凝胶电泳显示甲基化RNA迁移位置的定性信息。当以细胞RNA作为底物时，该方法可提供关于RNA甲基转移酶功能的独特见解，因为它能够直接观察被甲基化靶向的RNA或多种RNA的大小。

<table><tbody><tr><td>10 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>10 bp DNA Ladder 试剂盒。</td></tr><tr><td>10% 过硫酸铵（APS）&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶（配制 10 mL：将 1 g 溶解于 8 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 10 mL；使用装有 0.45 &amp;micro;m 滤膜的 10 mL 注射器过滤溶液）。</td></tr><tr><td>10X TBE 缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶（配制 1 L：在含搅拌子的量筒中加入 108 g Tris 碱和 55 g 硼酸，加入 800 mL 蒸馏水并搅拌溶解；加入 40 mL 0.5 M Na₂EDTA（pH 8.0）；用去离子水定容至 1 L；使用 0.22 &amp;micro;m 滤膜过滤溶液）。</td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>配制 1 L：在含搅拌子的量筒中加入 60.5 g Tris 碱和 87.6 g NaCl，加入 800 mL 蒸馏水并搅拌溶解；用浓盐酸调节 pH 至 7.5；用去离子水定容至 1 L；使用 0.22 &amp;micro;m 滤膜过滤溶液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>丙烯酰胺：双丙烯酰胺 29:1（40% 溶液/电泳级），Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]；（SAM[3H]）</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155V250UC</td><td>用于体外 RNA 甲基化；浓度 = 1.0 mCi/mL；比活性 = 17.1 Ci/mmol；摩尔浓度=&lt;br/&gt; (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &amp;micro;M。&amp;nbsp;&amp;nbsp; 收到冷冻的 3H-SAM 管后，在 4&amp;deg;C 下解冻，分装为每份 20 &amp;micro;L，于 -30&amp;deg;C 冻存。严禁将部分使用过的分装样品再次冻存或重复使用。</td></tr><tr><td>Amersham Hypercassette 自显影暗盒</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>用于凝胶自显影曝光。</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>用于凝胶自显影曝光。</td></tr><tr><td>Beckman 闪烁计数仪</td><td>Beckman</td><td>LS6500</td><td>用于液体闪烁计数。</td></tr><tr><td>Biorad Mini 水平电泳系统</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>Mini 水平电泳系统。</td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>配制 20X 溶液：将 1 片溶解于 0.525 mL 无核酸酶水中。</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>无 RNase 的聚丙烯酰胺凝胶空夹板。</td></tr><tr><td>Criterion 空夹板</td><td>Biorad</td><td>1656001</td><td>垂直中型格式电泳槽。</td></tr><tr><td>DeNovix DS-11 微量分光光度计</td><td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>用于测定 DNA 和 RNA 浓度的微量分光光度计。</td></tr><tr><td>Ecoscint 原液</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>用于液体闪烁计数。</td></tr><tr><td>Fisherbrand 7 mL HDPE 闪烁瓶</td><td>Fisher</td><td>03-337-1</td><td>用于液体闪烁计数。</td></tr><tr><td>Fluoro-Hance-Quick Acting 自显影增强剂</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>用于凝胶自显影前处理。</td></tr><tr><td>凝胶干燥仪</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>用于干燥凝胶。</td></tr><tr><td>上样缓冲液 II（Gel Loading Buffer II）</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>用于在变性尿素聚丙烯酰胺凝胶中上样 RNA（成分：95% 甲酰胺、18 mM EDTA、0.025% SDS、二甲苯蓝和溴酚蓝）。</td></tr><tr><td>GeneCatcher 一次性凝胶切割吸头</td><td>Gel Company</td><td>NC9431993</td><td>用于从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中切除条带。</td></tr><tr><td>Megascript 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>用于 T7 RNA 聚合酶介导的体外转录。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Perfectwestern 超大容器</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382（透明）/ NC9965364（黑色）</td><td>凝胶染色盒。</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>用于产生具有均一末端的体外转录本的质粒</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>用于 RNA 纯化，采用本方案中提供的改良操作流程。</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>用于回收和纯化用于体外转录的双链 DNA 片段。</td></tr><tr><td>Saran Premium 塑料保鲜膜</td><td>Saran Wrap</td><td>Amazon</td><td>用于凝胶干燥。</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>超灵敏核酸凝胶染料。</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>核酸凝胶染料。</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 mM Tris-HCl，1 mM 二钠 EDTA，pH 8.0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>配备 SMARTBLOCK 24X 1.5 mL 管的 Thermomixer</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>用于对 1.5 mL 管进行温度控制孵育。</td></tr><tr><td>TOPO TA 克隆试剂盒</td><td>life technologies</td><td></td><td>用于快速克隆 Taq 聚合酶&amp;ndash;扩增的 PCR 产物至含有 T7 和/或 SP6 启动子的载体中，以进行体外 RNA 转录。</td></tr><tr><td>TURBO DNase（2 U&amp;frasl;&amp;micro;L）</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>用于从体外转录反应中去除 DNA。</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>51456-500G</td><td>用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>Whatman 3MM 滤纸</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-154</td><td>用于凝胶干燥的层析纸。</td></tr></tbody></table>

无需抗体的rna甲基转移酶活性分析检测法

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

目前已发现超过100种化学性质不同的RNA修饰，其中约三分之二为甲基化修饰。由于介导RNA修饰“书写”与“擦除”的酶在疾病和癌症相关的生物学过程中发挥重要作用，人们对RNA修饰、尤其是甲基化修饰的兴趣重新兴起。本文提供了一种灵敏的体外检测方法，可用于准确分析RNA甲基化“书写”酶在合成RNA或体外转录RNA上的活性。该方法采用氚标记的S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine），使甲基化的RNA直接被氚标记。由于氚辐射能量较低，该方法安全性高；同时，已有成熟的氚信号放大技术，使得无需使用易产生假象的抗体，即可对甲基化RNA进行定量和可视化检测。尽管本方法主要针对RNA甲基化，但稍加调整即可适用于其他可用放射性同位素标记的RNA修饰研究，例如利用14C标记的乙酰辅酶A检测RNA乙酰化。总体而言，该检测方法可快速评估RNA甲基化的反应条件、小分子抑制剂的抑制效果，或RNA及酶突变体的影响，为验证和拓展细胞实验结果提供了一种强有力的工具。

体外转录反应 
图2A 展示了使用T7 RNA聚合酶对7SK snRNA进行体外转录反应的典型结果。7SK snRNA是一种相对较短（331个核苷酸）且具有高度结构的RNA。如该原始图像所示，除7SK条带外还存在多个长短不一的非特异性条带，可能源于随机的转录起始或终止事件。因此，在体外转录反应后进行凝胶纯化至关重要，以获得纯净的RNA样品，如图2B所示。此时，可通过目标RNA在分子量标记（ladder）中的相对位置进行鉴定，并通过凝胶纯化进行回收。
如前所述，在凝胶纯化步骤之前，可能需要优化转录反应的时间。转录反应时间过长可能导致RNA产量极高，从而难以在后续步骤中识别正确的转录产物。此外，还应使用特异性引物通过逆转录定量PCR（RTqPCR）验证纯化后转录产物的身份。
体外RNA甲基转...

本文描述了一种无需抗体的体外检测方法，用于直接分析甲基转移酶在合成RNA或体外转录RNA上的活性。

无需抗体的RNA甲基转移酶活性分析检测法

已知的RNA化学修饰超过100种，其中三分之二为甲基化修饰。近年来，人们对RNA修饰，特别是……

目前已发现超过100种不同的RNA修饰，其中三分之二为甲基化修饰。本实验方案提供了一种灵敏且准确的RNA甲基化“书写”酶活性分析方法。该技术操作简便，无需使用易产生假象的抗体，即可实现对甲基化RNA的定量与可视化检测。本实验操作将由我实验室的研究生 Samantha Shelton 演示。按照文本方案所述，在冰上用一个 1.5 毫升离心管配制 100 微升 RNA 甲基转移酶反应体系。涡旋振荡混匀管内溶液，并在 200 × g 条件下离心 5 秒，使溶液聚集于管底。将试管在 37 摄氏度下孵育两小时。然后，按照文本方案中所述，使用柱层析法纯化反应产物。进行液体闪烁计数时，为闪烁计数架设置每个样品一个样品瓶，另设一个用于本底测量的样品瓶和一个用于擦拭测试的样品瓶。向小瓶中加入五毫升闪烁计数液。将每种洗脱的放射性RNA样品各10微升加入一个瓶中。拧紧瓶盖，并轻轻混匀。为准备擦拭测试小瓶，需用棉签彻底擦拭操作过程中接触的所有表面和设备。将这些棉签放入装有闪烁液的小瓶中，并拧紧瓶盖。在液体闪烁计数器上运行样品时，打开计数器的屏蔽罩，将样品架插入仪器内，然后关闭屏蔽罩。选择计数单管架。选择用户程序。选择或创建一个测量氚60秒的程序，然后点击计数管架。重复闪烁计数三次。随后，按照文本方案中的说明，制备并重新运行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。将20 µL放射性RNA样品转移至含有20 µL 2×上样缓冲液的新1.5 mL离心管中。制备好分子量标准品后，将样品在70摄氏度下孵育15分钟。在上样前，立即用移液器将电泳槽中的缓冲液加入凝胶的加样孔中，对凝胶孔进行最后一次洗涤。然后，向凝胶的各泳道中分别加入20 µL制备好的分子量标准品、20 µL样品以及20 µL 1×凝胶上样缓冲液。根据聚丙烯酰胺的百分比，以100伏电压电泳60至180分钟。电泳结束后，将凝胶从夹心中取出，并放入含有50毫升1X TBE缓冲液和5微升超敏核酸凝胶染色剂的容器中。在摇床上孵育5分钟，以对RNA进行染色。此后，小心地将凝胶从盒子中取出，放置在凝胶成像系统的紫外透射仪上，加样孔朝上，分子量标记在左侧。调整相机对准凝胶，打开紫外光源，拍摄凝胶图像。然后关闭紫外照射，将图像保存为 TIFF 文件。将凝胶放回盒子中，除去TBE，加入50毫升固定液，在室温下于摇床上固定30分钟。接着，将凝胶轻轻转移至含有25毫升放射自显影增强液的新鲜黑色盒子中，在室温下于摇床上孵育30分钟。轻轻提起凝胶，将其正面朝下放置在一张塑料膜上，加样孔朝上，蛋白/核酸标准品在右侧。在凝胶背面放置两张层析纸，然后将整个叠层翻转。将凝胶干燥器预热至 80 °C。将凝胶干燥器上的塑料盖向后拉开。将整个凝胶夹层装置放入塑料盖下方，然后将塑料盖重新盖回，以形成密封。在 80 °C 下干燥凝胶 1 小时。然后关闭凝胶干燥器，轻轻取下凝胶夹层。移除保鲜膜和第二层层析滤纸。将带有干燥凝胶的剩余层析滤纸用胶带固定在放射自显影胶片盒中。在暗室中，放入一张放射自显影胶片。将暗盒置于负80摄氏度保存，并根据信号强度在适当时间取出显影。胶片显影后，将其覆盖在暗盒上，用实验标记笔仔细标记凝胶的四边、每个加样孔以及XC和BB染料的位置。以每英寸 300 或 600 像素的分辨率扫描胶片，并将图像保存为 TIFF 文件。本研究展示了一种无抗体检测方法，用于分析 RNA 甲基转移酶活性。利用 T7 RNA 聚合酶对 7SK 小核 RNA 进行体外转录反应的典型结果显示出相对较短且具有高度结构的 RNA。存在多个非特异性条带，长度既短于也长于7SK，可能由随机的转录起始或终止事件引起。因此，在体外转录反应后进行凝胶纯化对于获得高纯度的RNA样品至关重要。此时，可通过目标RNA在凝胶中相对于分子量标记的位置来识别，并通过凝胶纯化进行分离。此处展示的是使用推荐的 RNA 和蛋白质浓度下限的代表性 RNA 甲基转移酶活性检测实验。该实验既可通过液体闪烁计数获得定量结果，也可通过放射自显影获得定性结果。在此实验中，已知可甲基化 7SK 的 RNA 甲基转移酶也被证明能够甲基化 U6。此外，与近期在 7SK 中观察到的结果类似，组蛋白 H4 与 MePCE 的结合也会抑制 U6 的甲基化。这一结果在闪烁计数和放射自显影图中均可观察到，表明本实验方案具有良好的稳健性。RNA 易于降解，因此请务必使用无 RNase 的试剂，并彻底清洁所有表面和设备。通过该甲基转移酶实验获得的放射性标记 RNA 可直接用于评估 RNA 去甲基化酶活性或 RNA 结合活性，例如通过电泳迁移率变动实验。该方法可使研究人员检测不同因素对RNA甲基转移酶活性的影响，包括点突变和小分子抑制剂处理。该方法使用放射性物质，因此操作时务必穿戴适当的个人防护装备（PPE），并小心处理和处置放射性材料。

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

RNA甲基转移酶活性分析的无抗体测定

本方案描述了用于Entamoeba histolytica...

体外 tRNA 甲基化实验：使用溶组织内阿米巴 DNA 和 tRNA 甲基转移酶 Dnmt2 (Ehmeth) 酶

本文介绍了一种改良的Northern印迹法，用于检测RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）修饰。该方法可在不同实验设计条件下，检测多种RNA及其对照样本中的修饰情况。...

一种用于检测细胞和组织中RNA N6-甲基腺苷修饰的方法

本文介绍了一种对酵母RNA修饰酶Mod5进行生化表征的实验方案，并讨论了该方案如何应用于其他RNA修饰酶的研究。...

一个 体外 检测tRNA-异戊烯基转移酶活性的实验方法

本文介绍一种依赖脱氧核酶（DNAzyme）的RNA切割实验方案。该方法可实现对RNA...

DNA酶依赖性分析rRNA的2'-O-甲基化

甲基化RNA免疫沉淀实验是一种基于抗体的方法，用于富集甲基化的RNA片段。结合深度测序技术，可鉴定携带m5C修饰的转录本。...

用于研究拟南芥中 m5C 修饰的甲基化 RNA 免疫沉淀实验

这些方案提供了在细胞中评估蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族各个成员酶活性的方法学。文中详细描述了利用内源性和外源性生物标志物、识别甲基化精氨酸的抗体以及抑制剂工具化合物来评估PRMT活性的具体操作指南。...

研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

RNA修饰在病毒感染中的作用刚刚开始被探索，可能揭示新的病毒-宿主相互作用机制。在本研究中，我们提供了一种用于研究病毒感染背景下m6A和m5C...

探索病毒感染期间的 m6A 和 m5C 表观转录组：以 HIV 为例

DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。...

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

本文介绍了一种利用点杂交法对整体m⁶A水平进行半定量检测的实验方案。首先提取总RNA，经变性后点样于尼龙膜上，使用抗m⁶A抗体进行杂交，再通过化学发光法显影。利用ImageJ软件进行灰度分析，量化信号强度，从而反映相对甲基化水平，为相关研究提供一种可重复的实验流程。...

检测RNA整体N6-甲基腺苷修饰水平的点杂交实验

此处，我们详细说明该方法 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用分析），可实现全基因组范围内分子内和分子间RNA-RNA相互作用的定位 体内SPLASH 可用于研究包括酵母、细菌和人类在内的生物体的 RNA...

利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

了解RNA甲基转移酶活性分析的无抗体测定方法，使用氚标记S-腺苷甲硫氨酸进行体外甲基化检测。该技术可定量与定性分析RNA甲基化，适用于研究RNA修饰酶功能及抑制剂筛选。

无需抗体的RNA甲基转移酶活性分析检测法

探索更多视频