Name: 通过亲和色谱与西布洛特或质谱结合的亲致色谱,识别磷酸磷酸磷酸磷酸醇或磷酸蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习利用亲和色谱结合生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇，通过免疫印迹或质谱技术分离并鉴定与之结合的蛋白质。该方法适用于研究真核细胞中代谢物的调控功能。

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本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC, RGPIN-2019-04658）；NSERC 针对早期职业研究人员的发现启动补充基金（DGECR-2019-00081）以及麦吉尔大学资助。&#160;

1. 通过亲和层析和蛋白质印迹法分析IP-或PI-结合蛋白
<ol>
	<li>细胞生长、裂解与亲和层析
	<ol>
		<li>将 T. brucei 细胞培养至对数中期，并监测细胞活力和密度。每次结合实验使用 5.0 × 107 个细胞即可。
		<ol>
			<li>对于血液形态，将细胞在 HMI-9 培养基中（添加 10% 胎牛血清（FBS））于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。维持细胞密度在 8.0 × 105 至 1.6 × 106 个细胞/mL 之间。 
			注：细胞密度高于 1.8 × 106 个细胞/mL 可能影响细胞活力。T. brucei 427 菌株体外培养的倍增时间为 5.5 至 6.5 小时。</li>
			<li>对于前循环形态，将细胞在 SDM-79 培养基中（添加 10% FBS）于 27 °C 培养，并维持细胞密度在 1.0 × 107 至 3.0 × 107 个细胞/mL 之间。</li>
			<li>对于纯化蛋白（例如重组蛋白），取 0.5 至 1 µg 蛋白，加入 450 µL 结合缓冲液（25 mM HEPES，150 mM NaCl，0.2% 4-壬基苯基-聚乙二醇，pH 7.4）稀释。保留稀释后蛋白总量的 5%（上样对照）用于 Western 印迹分析。继续进行步骤 1.1.7。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在室温（RT）下以 1,600 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。 
		注：有关大体积培养物离心的更多信息，请参见步骤 2.1.2。</li>
		<li>用 10 mL 预热至 37 °C 的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）加 6 mM 葡萄糖（PBS-G）轻柔重悬沉淀以洗涤细胞，随后在室温下以 1,600 × g 离心 5 分钟。重复该步骤两次。</li>
		<li>将沉淀重悬于 1 mL PBS-G 中，转移至 1.5 mL 离心管，以 1,600 × g 在室温下离心 5 分钟，弃去上清液。 
		注：细胞沉淀可迅速在液氮中冷冻，并储存在 -80 °C 或液氮中。</li>
		<li>将沉淀重悬于 0.5 mL 裂解缓冲液（25 mM HEPES，150 mM NaCl，1% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，pH 7.4）中，该缓冲液需预先在冰上预冷，并添加 1.5× 蛋白酶抑制剂混合物和 1× 磷酸酶抑制剂混合物（材料表），以裂解细胞。在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育裂解液 10 分钟。 
		注：此步骤至关重要，若未按指示操作，蛋白可能发生降解。必要时可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS/PAGE）检测蛋白裂解物的完整性。 
		警告：t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇具有毒性，可引起皮肤和眼睛刺激。操作时需佩戴手套、眼罩和面罩。</li>
		<li>在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 10 分钟，将上清液收集至新的 1.5 mL 离心管中用于结合实验。保留总裂解液的 5%（上样对照）用于 Western 印迹分析。上清液中含有用裂解缓冲液提取的寄生虫蛋白。</li>
		<li>取 50 µL 与琼脂糖珠偶联的 IPs 或 PIs（即 50 µL 悬液）或 50 µL 琼脂糖珠，在 1,000 × g 下离心 1 分钟。弃去上清液，用 50 µL 结合缓冲液重悬以平衡珠子。使用未偶联的珠子作为对照。使用具有不同磷酸化构型的 IP/PI-珠（包括非磷酸化形式）以控制非特异性相互作用。</li>
		<li>向细胞裂解液或纯化蛋白中加入 50 µL IP-或 PI-珠（每 1 mL 珠子含 10 nmol 偶联的 IPs 或 PIs）。IP-或 PI-珠的体积应控制在总裂解液体积的 10% 以内，必要时可用结合缓冲液调整结合反应总体积。
		<ol>
			<li>对于竞争实验，向结合反应中加入不同浓度的非偶联 IPs 或 PIs（例如，相对于 IP-或 PI-珠为 1-、10-、100-倍摩尔过量）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育反应体系 1 小时或过夜。 
		注：纯化蛋白的结合反应可根据蛋白稳定性在室温下进行。若使用仅与生物素偶联的 IPs 或 PIs，则仅进行步骤 1.1.9.1；否则进行步骤 1.1.10。
		<ol>
			<li>向结合反应中加入 50 µL 链霉亲和素偶联的磁珠，在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育 1 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟，移除上清液（流穿液），保留沉淀。保留 5% 上清液用于 Western 印迹分析。 
		注：若使用磁珠，可通过磁力架移除上清液并进行后续洗涤（无需离心）。</li>
		<li>加入 1 mL 洗涤缓冲液（25 mM HEPES，300 mM NaCl，0.2% 4-壬基苯基-聚乙二醇，pH 7.4），通过轻敲或旋转离心管重悬树脂（避免使用移液器，以防珠子粘附在枪头上）。在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。重复该步骤共洗涤五次。 
		警告：4-壬基苯基-聚乙二醇具有毒性，可引起皮肤和眼睛刺激。操作时需佩戴手套、眼罩和面罩。</li>
		<li>向珠子中加入 50 µL 含 710 mM 2-巯基乙醇的 2× Laemmli 缓冲液，通过轻敲或涡旋混匀以洗脱蛋白。在 95 °C 加热 5 分钟，然后以 10,000 × g 离心 1 分钟，收集上清液（含洗脱蛋白）。或者，使用 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸（pH 2.9）洗脱蛋白以避免使用 SDS。将洗脱液在 -80 °C 冻存，或直接进行 Western 印迹分析。 
		警告：2-巯基乙醇具有毒性，可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。操作时需佩戴手套并在通风橱中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western 印迹分析
	<ol>
		<li>将步骤 1.1.6 中的上样对照（input）或步骤 1.1.10 中的流穿液（flow-through）样品各取 15 µL，与 5 µL 4× Laemmli 缓冲液混合。将上样对照和流穿液样品在 95 °C 加热 5 分钟。对于用 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸（pH 2.9）洗脱的样品，取 15 µL 洗脱液与 5 µL 4× Laemmli 缓冲液混合，95 °C 加热 5 分钟。 
		注：使用 2× Laemmli 缓冲液洗脱的样品无需此步骤。</li>
		<li>在 4–20% SDS/PAGE 凝胶的加样孔中分别加入 2.5 µL 上样对照、2.5 µL 流穿液和 20 µL 洗脱样品，并根据制造商推荐加载蛋白分子量标记。 
		注：根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。</li>
		<li>在电泳缓冲液中以 150 V 电压运行 SDS/PAGE 30–45 分钟，或直至 Laemmli 缓冲液中的蓝色染料迁移至凝胶底部。 
		注：运行时间可能因实验室设备而异。</li>
		<li>将凝胶从玻璃（或塑料）板中取出，浸入转移缓冲液中 15 分钟。</li>
		<li>将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素膜。将膜和 3 mm 滤纸浸入转移缓冲液中。组装“三明治”结构：三层滤纸、硝酸纤维素膜或 PVDF 膜、凝胶、再加三层滤纸。确保三明治中无气泡残留，必要时可用滚轮排除气泡。将膜置于转印夹的阴极侧，凝胶置于阳极侧。 
		注：请参考膜制造商的说明书了解膜活化或转印前处理的相关信息。</li>
		<li>将含“三明治”结构的转印夹放入含转移缓冲液的转印槽中，将槽置于冰浴或 4 °C 环境（如冷室）中。以 100 V 电压转移 1 小时（电流在 200–400 mA 之间变化）。或者，在 4 °C 下以 15 mA 恒定电流过夜转移。</li>
		<li>从转印夹中取出膜，将其在含 0.05% 吐温 20 的 6% 脱脂奶粉 PBS 溶液（PBS-T）或兼容的封闭液中于室温孵育 1 小时以封闭膜。 
		注：封闭前可用 Ponceau S 染色检测转印质量。将膜在 15 mL Ponceau S 溶液中孵育 1 分钟，用水冲洗后观察条带。</li>
		<li>弃去封闭液，将膜在含一抗的 PBS-T 稀释液（含 6% 脱脂奶粉）中于室温以 50 rpm 转速旋转孵育 1 小时。或者，在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育过夜。 
		注：孵育时间可能因抗体质量而异；但大多数抗体在室温下孵育 1–3 小时即可。请遵循制造商推荐的抗体浓度或稀释比例。</li>
		<li>将膜在 PBS-T 中于室温以 50 rpm 转速旋转孵育 5 分钟进行洗涤。重复该步骤 3–5 次。根据抗体质量可能需要更多次洗涤。</li>
		<li>将膜在含辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗的 PBS-T 稀释液（含 6% 脱脂奶粉）中于室温以 50 rpm 转速旋转孵育 1 小时。 
		注：请遵循制造商推荐的抗体浓度或稀释比例。</li>
		<li>按步骤 1.2.9 所述方法洗涤印迹膜。</li>
		<li>加入化学发光底物覆盖膜表面。去除多余底物，在避光条件下室温孵育 5 分钟。 
		注：请参考制造商说明书获取化学发光试剂的使用建议。</li>
		<li>使用基于相机的成像系统捕获化学发光信号。或者，使用 X 光片捕获化学发光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过亲和层析和质谱法分析 IP/PI 结合蛋白
<ol>
	<li>细胞生长、裂解及亲和层析
	<ol>
		<li>将 T. brucei 细胞培养至对数中期，并监测细胞活力和密度。 
		注意：总共 1.0 × 1010 个细胞足以进行两次结合实验。若使用的细胞数量少于建议值，可能会影响质谱检测低丰度蛋白的能力。
		<ol>
			<li>对于 T. brucei 血液形态，将细胞在 HMI-9 培养基（含 10% 胎牛血清）中于 37 °C、5% CO2 条件下培养至对数中期（8.0 × 105–1.6 × 106 个细胞/mL）。对于 427 菌株，5 L 培养液可获得 0.5–1.0 × 1010 个细胞。监测细胞生长，避免细胞密度超过 1.8 × 106 个细胞/mL，否则可能影响细胞活力。细胞培养体积应保持为培养瓶总体积的 1/10；否则，由于通气不良，细胞生长速率将受到影响。 
			注意：427 菌株的倍增时间为 5.5–6.5 小时。</li>
			<li>对于前循环形态，将细胞在 SDM-79 培养基（含 10% 胎牛血清）中于 27 °C 培养，细胞密度维持在 1.0 × 107 至 3.0 × 107 个细胞/mL。500 mL 培养液可获得 0.5–1.5 × 1010 个细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在室温下以 1,600 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 200 mL 预热至 37 °C 的 PBS-G 中。使用圆底离心管（材料表），因为使用固定角度转子时，T. brucei 血液形态的沉淀容易被扰动。再次在室温下以 1,600 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 10 mL PBS-G 中。在室温下以 1,600 × g 离心 5 分钟。重复该步骤，最后一次洗涤后弃去上清液。 
		注意：沉淀可用液氮速冻，并保存于 -80 °C 或液氮中。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 5 mL 预冷的裂解缓冲液中（含 1.5× 蛋白酶抑制剂混合物和 1× 磷酸酶抑制剂混合物）（材料表）。将裂解物在 4 °C 下以 50 rpm 转速旋转孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟。收集上清液（可溶性蛋白），并将其稀释于 20 mL 结合缓冲液中。</li>
		<li>取 400 µL 与琼脂糖珠偶联的 IPs 或 PIs（即 400 µL 悬液）或 400 µL 对照珠，在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，并用 400 µL 结合缓冲液重悬以平衡珠子。使用琼脂糖珠作为阴性对照，以确定蛋白-代谢物相互作用的特异性富集，排除非特异性结合（例如蛋白非特异性结合珠子）。使用具有不同磷酸化构型的 IPs 或 PIs（包括非磷酸化形式），以控制因磷酸电荷或生物素结合引起的非特异性相互作用。</li>
		<li>将 400 µL IP/PI-珠或对照珠加入 10 mL 裂解液中，在 4 °C 下以 50 rpm 转速孵育 1 小时或过夜。若使用仅与生物素偶联（无珠）的 IPs 或 PIs，则进入步骤 2.1.7.1；否则进入步骤 2.1.8。
		<ol>
			<li>加入 100 µL 与链霉亲和素偶联的磁珠，在 4 °C 下以 50 rpm 转速孵育 1 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟，移除上清液（流穿液），保留沉淀。保留 5% 上清液用于 Western blot 分析。</li>
		<li>向沉淀中加入 5 mL 洗涤缓冲液，轻轻混匀（通过轻柔旋转离心管），然后在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 1 分钟。弃去上清液。重复洗涤五次。若使用磁珠，则使用磁力架收集上清液并进行洗涤（无需离心）。</li>
		<li>向珠子中加入 50 µL 2× Laemmli 缓冲液（或 8 M 尿素/100 mM 甘氨酸 pH 2.9，以避免使用 SDS），通过轻弹或涡旋混匀（避免使用移液器，因为珠子可能粘附在枪头上），然后在 95 °C 加热 5 分钟。以 10,000 × g 离心 1 分钟，收集上清液（洗脱蛋白）。重复该步骤两次，共收集三个洗脱组分。</li>
		<li>将洗脱液在 -80 °C 冻存，或立即进行 SDS/PAGE 分离，或保持在溶液中用于胰蛋白酶消化及质谱分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于质谱分析的蛋白质胰蛋白酶消化 
	注意：本步骤提供两种操作方式，分别对应第 2.2.1 节（凝胶内）和第 2.2.2 节（溶液中）的蛋白质消化。建议使用低吸附蛋白管以防止样品损失。请咨询蛋白质组学平台的分析化学专家，确认该方案是否适用于您的样品及可用的质谱仪器。
	<ol>
		<li>凝胶内蛋白质胰蛋白酶消化
		<ol>
			<li>在 SDS/PAGE 分离蛋白质后，用高纯度水短暂冲洗凝胶。将凝胶转移至洁净的玻璃板上。使用洁净刀片切取蛋白条带，避免切取条带外多余的凝胶。将凝胶切成小块（约 1 mm 见方），并转移至 1 mL 离心管中。必要时可使用移液枪头，但需确保枪头在使用前用乙醇冲洗。 
			注意：佩戴手套以避免凝胶污染。凝胶块可保存于 -20 °C。</li>
			<li>向管中加入 100 μL 高纯度水或高效液相色谱级水冲洗凝胶块，弃去水。
			<ol>
				<li>对于考马斯亮蓝或钌基荧光染色的凝胶块，将凝胶块在脱色液（25 mM NH4HCO3&#160;溶于 50% 乙腈）中孵育 1 小时，然后弃去溶液。重复该步骤直至染色不可见。 
				注意：NH4HCO3&#160;溶液应通过稀释 100 mM NH4HCO3 储备液（pH 7.8）配制。 
				警告：乙腈为挥发性溶剂，易燃且有毒。NH4HCO3&#160;可能引起皮肤或眼睛刺激。请佩戴手套并在通风橱中操作。</li>
				<li>对于银染凝胶块，将凝胶块在 50 μL 银染脱色液（15 mM K3[Fe(CN)6]，50 mM Na2S2O3）中孵育 30 分钟。弃去溶液，并用 200 μL 水洗涤凝胶块。重复洗涤五次或直至凝胶黄色不可见。 
				警告：K3[Fe(CN)6] 可能引起皮肤或眼睛刺激。请佩戴手套。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>使用 200 μL 乙腈在室温下脱水 10 分钟，然后弃去溶液。 
			注意：脱水后的凝胶块体积更小，呈不透明且发黏。若多个凝胶块合并于同一管中，需重复该步骤以确保充分脱水。</li>
			<li>加入 50 µL（或足以覆盖凝胶块的体积）还原液（10 mM 二硫苏糖醇 [DTT] 溶于 100 mM NH4HCO3），在 56 °C 孵育 1 小时。之后将管冷却至室温，并弃去多余的还原液。</li>
			<li>加入 50 µL（或足以覆盖凝胶块的体积）烷基化液（50 mM 碘乙酰胺溶于 100 mM NH4HCO3），在室温避光孵育 30 分钟。之后弃去多余的烷基化液。</li>
			<li>使用 200 μL 乙腈在室温下脱水 10 分钟，弃去乙腈，再用 100 mM NH4HCO3 在室温下水化 10 分钟。</li>
			<li>再次使用 200 μL 乙腈在室温下脱水 10 分钟，并弃去多余溶液。</li>
			<li>加入 15 µL 质谱级胰蛋白酶（溶于 50 mM NH4HCO3 缓冲液），或加入足以覆盖水化凝胶块的体积，在 37 °C 孵育 4 小时或过夜。胰蛋白酶总量应控制在 100 至 500 ng（或每微克蛋白使用 20 ng 胰蛋白酶）。</li>
			<li>将样品冷却至室温，在微量离心机中以 2,000 × g 离心 1 分钟。加入 10–20 μL 5% 甲酸水溶液，室温孵育 10 分钟。 
			警告：甲酸易燃、腐蚀性强且有毒。请佩戴手套并在通风橱中操作。</li>
			<li>按步骤 2.2.1.9 所述离心，收集上清液（含提取的肽段）至另一管中。向原管中加入 20 μL 5% 甲酸溶于 50–60% 乙腈的溶液，室温孵育 10 分钟。将提取的肽段组分收集至同一管中。</li>
			<li>在真空浓缩仪中干燥样品，用 10 μL 含 0.5% 乙酸和 2% 乙腈的溶液重新溶解，用于质谱分析。离心并将溶液收集至管底，于 -20 °C 或 -80 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>溶液中蛋白质胰蛋白酶消化
		<ol>
			<li>沉淀蛋白质以减少样品体积、去除盐分并进行缓冲液置换。向样品中加入六倍体积的预冷（-20 °C）丙酮，例如向 100 μL 样品中加入 600 μL 丙酮。涡旋混匀，并在 -20 °C 孵育 15 分钟至 1 小时。溶液将变浑浊或形成沉淀。 
			警告：丙酮有毒且易燃。请佩戴手套并在通风橱中操作。</li>
			<li>在 4 °C 下离心 30 分钟。倾去丙酮，将沉淀在空气中干燥 15 分钟。</li>
			<li>加入 10 µL 6–8 M 尿素或含 1% SDS 的 50 mM NH4HCO3 溶液以溶解沉淀，并涡旋混匀。对于蛋白量较大（&#62; 10 µg）的样品，可使用最多 20 µL 溶解缓冲液。</li>
			<li>加入 5 µL 还原液并涡旋。使用微量离心机离心沉降液体。若样品溶于尿素，则在室温孵育 1 小时；若溶于 SDS，则在 56 °C 孵育 1 小时。</li>
			<li>使用微量离心机离心沉降液体。加入 3 µL 烷基化液并涡旋。再次离心沉降，避光室温孵育 30 分钟。</li>
			<li>加入 3 μL 还原液以中和反应。使用 50 mM NH4HCO3 缓慢稀释样品至 1 M 尿素或 0.05% SDS。 
			注意：胰蛋白酶消化缓冲液必须含有去垢剂或变性剂。变性剂的浓度限制如下：0.05% SDS；0.1% 正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷；0.1% 4-壬基苯基-聚乙二醇；0.1% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；0.1% 吐温 20；0.1% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐；&#60; 1 M 尿素或硫脲。</li>
			<li>加入 5 µL 质谱级胰蛋白酶（溶于 50 mM NH4HCO3 缓冲液），在 37 °C 孵育 4 小时或过夜。胰蛋白酶总量应控制在 100 至 500 ng（或每微克蛋白使用 20 ng 胰蛋白酶）。</li>
			<li>将样品冷却至室温，使用微量离心机离心沉降液体。加入 5% 乙酸（或 5% 甲酸溶于 50% 乙腈）以终止反应。</li>
			<li>按步骤 2.2.1.11 所述在真空浓缩仪中干燥样品。样品保存于 -80 °C。使用反相柱（如 C18 Zip-tip）对肽段进行脱盐和浓缩，然后进行质谱分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鉴定与IPs或PIs结合的蛋白质对于理解这些代谢物的细胞功能至关重要。亲和层析联合Western印迹或质谱分析为鉴定与IP或PI相互作用的蛋白质提供了可能，从而有助于揭示其调控功能。通过化学标记（例如将Ins(1,4,5)P₃与生物素共价连接）并将IPs或PIs经链霉亲和素交联至琼脂糖微珠，或由链霉亲和素磁珠捕获，可分离出相互作用的蛋白质，随后通过质谱或Western印迹进行鉴定。本文所述方案已被用于鉴定与这些代谢物结合的T. brucei3,8及哺乳动物细胞47中的蛋白质。使用定制标签（非生物素）的该方法变体也已在酵母中应用46。该方法的一个重要考虑因素是使用对照以区分特异性与非特异性相互作用。未偶联的微珠是必要的对照，其他对照还可包括非磷酸化的PIs或与微珠偶联的肌醇3。也可使用具有不同磷酸化组合的IPs或PIs3</su...

肌醇磷酸盐（IPs）和磷脂酰肌醇（PIs）通过调控基因表达1,2,3、囊泡运输4、信号转导5,6、代谢7,8,9以及发育8,10等细胞过程，在真核生物生物学中发挥核心作用。这些代谢物的调控功能源于其与蛋白质相互作用并进而调节蛋白质功能的能力。当与蛋白质结合时，IPs 和 PIs 可能会改变蛋白质构象11、催化活性12或相互作用13，从而影响细胞功能。IPs 和 PIs 分布于多种亚细胞区室中，例如细胞核2,3,14,15、内质网16,17、质膜1和细胞质18，可与蛋白质3,19或RNA20结合存在。
磷脂酶C对膜结合型PI(4,5)P2的切割可释放出Ins(1,4,5)P3，后者可分别被IP激酶和磷酸酶磷酸化或去磷酸化。IPs是可溶性分子，能够与蛋白质结合并发挥调控功能。例如，在后生动物中，Ins(1,4,5)P3可通过结合IP3受体作为第二信使，诱导受体构象改变，从而促使细胞内钙库释放Ca2+11。Ins(1,3,4,5)P4可结合组蛋白去乙酰化酶复合物，调控蛋白质复合物的组装与活性13。其他IPs调控功能的例子包括染色质结构的调控21、RNA转运22,23、RNA编辑24以及转录调控1,2,3。相比之下，PIs通常参与将蛋白质招募至质膜或细胞器膜25。然而，PIs新近被发现的特性是其能够在非膜环境中与蛋白质相互作用3,15,19,26。例如，类固醇生成因子这一核受体的转录调控功能受PI(3,4,5)P3的调节19，而多聚腺苷酸聚合酶的酶活性则受核内PI(4,5)P2的调控26。IPs和PIs的调控作用已在多种生物中得到证实，包括酵母22,27、哺乳动物细胞19,23、Drosophila10和线虫28。尤为重要的是这些代谢物在锥虫中的作用，锥虫在真核生物进化支系中较早分离。这些代谢物在Trypanosoma brucei中对转录调控1,3、发育8、细胞器形成及蛋白质运输29,30,31,32具有关键作用，同时也参与调控病原体T. cruzi33,34,35、Toxoplasma36和Plasmodium5,37的发育与感染过程。因此，阐明IPs和PIs在锥虫中的功能，有助于揭示这些分子新的生物学作用，并为发现新的药物靶点提供线索。
蛋白质与肌醇多磷酸（IP）或磷脂酰肌醇（PI）结合的特异性取决于蛋白质相互作用结构域以及肌醇的磷酸化状态13,38，尽管蛋白质也可与PI的脂质部分发生相互作用19。IP和PI的多样性及其修饰激酶与磷酸酶的存在，为调控蛋白质功能提供了一种灵活的细胞机制，该机制受到代谢物的可获得性与丰度、肌醇的磷酸化状态以及蛋白质相互作用亲和力的影响1,3,13,38。尽管某些蛋白质结构域已被充分表征39,40,41，例如pleckstrin同源结构域42和SPX（SYG1/Pho81/XPR1）结构域43,44,45，但仍有部分蛋白质通过尚未明确的机制与IP或PI相互作用。例如，布氏锥虫（T. brucei）的阻遏-激活蛋白1（RAP1）缺乏典型的PI结合结构域，却能与PI(3,4,5)P3结合，并调控参与抗原变异相关基因的转录3。通过对锥虫、酵母或哺乳动物细胞中与IP或PI相互作用的蛋白质进行亲和层析和质谱分析，已鉴定出多个缺乏已知IP或PI结合结构域的蛋白质8,46,47。这些数据提示存在其他尚未被鉴定的蛋白质结构域可与这些代谢物结合。因此，鉴定与IP或PI相互作用的蛋白质可能揭示蛋白质-代谢物相互作用的新机制，并阐明这些小分子在细胞调控中的新功能。
本文所述方法结合亲和层析与蛋白质印迹或质谱技术，用于鉴定与肌醇多磷酸（IP）或多磷酸肌醇（PI）结合的蛋白质。该方法使用生物素标记的IP或PI，可通过交联至与琼脂糖微珠偶联的链霉亲和素进行捕获，或 alternatively 通过与链霉亲和素偶联的磁性微珠进行捕获（图1）。该方法提供了一种操作简便、灵敏度高、无需放射性标记、无需脂质体的实验流程，适用于检测细胞裂解液或纯化蛋白中与IP或PI结合的蛋白质3（图2）。该方法既可用于无标记8,46分析，也可结合氨基酸标记的定量质谱技术47，从复杂的生物样品中鉴定IP或PI结合蛋白。因此，该方法为目前可用于研究IP或PI与细胞蛋白相互作用的少数方法之一，将有助于阐明这些代谢物在锥虫乃至其他真核生物中的调控功能。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>酮类</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td>溶剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>无机盐</td></tr><tr><td>Avanti J6-MI 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J6-MI</td><td>用于大体积样品（例如 1 L）的离心机</td></tr><tr><td>离心瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1408</td><td>用于 1 L 培养液离心的瓶子</td></tr><tr><td>对照珠</td><td>Echelon</td><td>P-B000-1ml</td><td>亲和层析试剂 - 对照</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>糖类，在 PBS 中添加以维持细胞活性</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>还原剂</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65305</td><td>用于结合生物素配体的链霉亲和素磁珠</td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>电泳运行缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 锥形离心管</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430052</td><td>用于离心 10 mL 培养液</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106526</td><td>酸类</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>氨基酸</td></tr><tr><td>HMI-9 细胞培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ME110145P1</td><td>用于 &lt;em&gt;T. brucei&lt;/em&gt; 血液形态的细胞培养基</td></tr><tr><td>Imperial 蛋白染色液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24615</td><td>用于 SDS/PAGE 中蛋白质检测的考马斯亮蓝染色</td></tr><tr><td>Ins(1,4,5)P3 磁珠</td><td>Echelon</td><td>Q-B0145-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Instant&amp;nbsp;脱脂&amp;nbsp;干&amp;nbsp;奶粉</td><td>Thomas Scientific</td><td>C837M64</td><td>Western 印迹封闭试剂</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>用于半胱氨酸蛋白或肽的烷基化试剂</td></tr><tr><td>Lab&amp;nbsp;旋转混合仪</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159Z92</td><td>用于结合实验</td></tr><tr><td>LoBind 微量离心管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td>低蛋白吸附管，适用于质谱分析</td></tr><tr><td>Nonidet&amp;nbsp;P-40（Igepal CA-630）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-3277</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010031</td><td>生理缓冲液</td></tr><tr><td>化学发光用过氧化物酶底物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>用于 Western 印迹蛋白质检测的底物</td></tr><tr><td>PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>磷酸酶抑制剂</td></tr><tr><td>PI(3)P PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B003a-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4)P2 PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B034a-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-3908-1mg</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B345a-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,5)P2 PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B035a-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4)P PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B004a-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-4508-1mg</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B045a-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PI(5)P PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B005a-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ponceau S 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>蛋白质染色（0.1% [w/v] 溶于 5% 乙酸）</td></tr><tr><td>铁氰化钾(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td>钾盐&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PtdIns PIP 磁珠</td><td>Echelon</td><td>P-B001-1ml</td><td>亲和层析试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>用于 Western 印迹&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td>用于小体积样品（例如 1.5 mL）的微量离心机</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72049</td><td>化学试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SPD120-115</td><td>样品浓缩（例如用于质谱分析）</td></tr><tr><td>细胞培养用 T175 培养瓶&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>159910</td><td>用于培养 50 mL &lt;em&gt;T. brucei&lt;/em&gt; 培养物</td></tr><tr><td>胰蛋白酶，质谱级</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>用于蛋白质消化的胰蛋白酶</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>变性试剂</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-418</td><td>用于混合反应体系</td></tr><tr><td>Western 印迹转膜缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610734</td><td>25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，pH 8.3，含 20% 甲醇</td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3 mm 滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030861</td><td>用于 Western 转膜的滤纸</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（14.2 M）</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>还原剂</td></tr><tr><td>2x Laemmli 上样缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>蛋白质上样缓冲液</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN&amp;nbsp;TGX 预制蛋白凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4561094</td><td>用于蛋白质电泳的凝胶</td></tr><tr><td>4x Laemmli 上样缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>蛋白质上样缓冲液</td></tr></tbody></table>

通过亲和层析联合蛋白质印迹或质谱法鉴定肌醇磷酸或磷脂酰肌醇相互作用蛋白

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

肌醇磷酸盐和磷脂酰肌醇在真核生物中调控多种细胞过程，包括基因表达、囊泡运输、信号转导、代谢以及发育。这些代谢物通过与蛋白质结合，改变蛋白质的构象、催化活性和/或相互作用，从而发挥其调控功能。本文所述方法结合亲和层析与质谱或蛋白质印迹技术，用于鉴定与肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇相互作用的蛋白质。将肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇通过化学方法标记上生物素，随后利用与琼脂糖或磁珠偶联的链霉亲和素进行捕获。蛋白质因其对代谢物的结合亲和力而被分离，再经洗脱后通过质谱或蛋白质印迹进行鉴定。该方法流程简单，具有高灵敏度、非放射性、无需脂质体且可定制化，能够精确分析蛋白质与代谢物之间的相互作用。该策略可用于无标记或氨基酸标记的定量质谱方法中，以鉴定复杂生物样品或纯化蛋白质中的蛋白质-代谢物相互作用。本实验方案已针对Trypanosoma brucei的蛋白质分析进行了优化，但也可适用于相关原生动物寄生虫、酵母或哺乳动物细胞。

通过亲和层析和蛋白质印迹分析 RAP1 与 PI(3,4,5)P3 的相互作用 
本示例说明了该方法在分析 T. brucei 裂解物或重组 T. brucei RAP1 蛋白与磷脂酰肌醇（PIs）结合中的应用。结合实验使用了表达血凝素（HA）标签 RAP1 的 T. brucei 血液形态裂解物。RAP1 是一种参与变异表面糖蛋白（VSG）基因转录调控的蛋白质3,48，VSG 基因编码的表面蛋白通过抗原变异机制介导寄生虫的免疫逃逸49。RAP1 在端粒蛋白复合物中与磷脂酰肌醇 5-磷酸酶（PIP5Pase）相互作用3，该酶也参与 VSG 基因转录的调控1,3。RAP1 含有一个位于 N 末端的乳腺癌 1 羧基末端（B...

本方案重点在于鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。该方法采用亲和层析技术，将生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇通过链霉亲和素固定于琼脂糖或磁珠上。通过蛋白质印迹（Western blotting）或质谱分析来鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。

肌醇磷酸盐和磷脂酰肌醇在真核生物中调控多种细胞过程，包括基因表达、囊泡运输、信号转导等。

肌醇磷酸盐和磷脂酰肌醇是具有多种调控功能的真核生物代谢物，包括调控基因表达、蛋白质转运、信号转导以及细胞发育。它们通过与蛋白质结合来发挥这些调控功能，从而改变蛋白质的构象、催化活性或蛋白质间的相互作用。鉴定与肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇结合的蛋白质，对于理解这些代谢物如何执行其调控功能至关重要。本方案流程简单，具有高灵敏度、非放射性、不含脂质体，且所用试剂均为商业化产品。该方法采用生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇进行层析，分离与其相互作用的蛋白质，随后通过蛋白质印迹或质谱法进行鉴定。对于血液形态的细胞，将布氏锥虫（T.brucei）细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）的HMI-9培养基中，于37°C、5%二氧化碳条件下培养至对数中期。保持细胞密度在每毫升80万至160万个细胞之间。准备就绪后，在室温下以1600 × g离心10分钟。弃去上清液，并用10毫升预热至37°C的PBS-G缓冲液轻轻重悬沉淀，以洗涤细胞。以1600 × g离心力在室温下离心5分钟，以完成洗涤。重复此洗涤步骤两次。然后将沉淀重悬于1毫升PBS-G中。将此悬浮液转移至一个1.5毫升离心管中，然后在1600 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于0.5毫升裂解缓冲液中，缓冲液中需添加1.5 × 蛋白酶抑制剂混合物和1 × 磷酸酶抑制剂混合物，且已预先在冰上预冷，以裂解细胞。将裂解液在4°C、1400 × g条件下离心10分钟。随后，将含有提取的寄生虫蛋白的上清液收集到一个新的1.5毫升离心管中，用于结合实验。保留总裂解液的5%用于蛋白质印迹分析。收集50微升与琼脂糖珠偶联的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇，加入500毫升结合缓冲液中。在1000 × g条件下离心1分钟。弃去上清液，加入50 µL结合缓冲液重悬，以平衡磁珠。使用未偶联的磁珠作为对照，并使用具有不同磷酸化构型（包括非磷酸化形式）的磁珠，以排除非特异性相互作用。接下来，向细胞裂解液或纯化的蛋白质中加入 50 微升的 IP 或 PI 磁珠。磁珠体积应控制在总裂解液体积的 10% 以内。如有需要，可使用结合缓冲液调整结合反应的总体积。将反应液在4°C、50 rpm条件下旋转孵育一小时或过夜。随后，在4°C下以1000 × g离心一分钟。弃去上清液，保留沉淀，并确保保留5%的上清液用于Western印迹分析。然后加入一毫升洗涤缓冲液，轻轻敲击或涡旋离心管以重悬树脂。在4°C条件下，以1000 × g离心反应物一分钟，弃去上清液。重复此步骤，共洗涤五次。此后，向珠子中加入 50 微升含有 710 毫摩尔 2-巯基乙醇的 2× Laemmli 缓冲液。轻轻敲击或涡旋混匀，并稀释蛋白质。接着在 95 摄氏度加热 5 分钟，然后在 10,000 ×g 离心 1 分钟。收集上清液，立即将洗脱液在-80摄氏度冷冻，或直接进行蛋白质印迹分析。本文所述方法用于分析PIs与来自T.brucei裂解液的阻遏-激活蛋白1，或重组的T.brucei阻遏-激活蛋白1蛋白的结合情况。由于RAP1缺乏典型的PI结合结构域，因此结合实验采用非磷酸化的PIs，或在肌醇环不同位置磷酸化的PIs，并使用非偶联的琼脂糖珠进行。Western 分析显示，RAP1 优先结合 PI(3,4,5)P3 琼脂糖微珠，但也在较弱程度上结合 PI(4,5)P2 琼脂糖微珠。然而，它不结合其他任何磷脂酰肌醇（PIs）或琼脂糖微珠。为了检测 RAP1 是否直接结合磷脂酰肌醇（PIs），我们从大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化了C端带有6XHis标签的重组 RAP1 蛋白，获得均一产物。Western blot 结果显示，增加 PI(3, 4, 5)P3 的浓度会抑制重组 RAP1 与 PI(3, 4, 5)P3 琼脂糖微珠的结合，而 PI(4, 5)P2 浓度的增加则无此效应。在反应体系中加入经纯化的布氏锥虫 PIP5Pase 酶后，重组 RAP1 与 PI(3, 4, 5)P3 的结合能力得以恢复。这是由于 PIP5Pase 对游离的 PI(3, 4, 5)P3 进行了去磷酸化修饰，表明该代谢物的磷酸化模式对我们研究的 RAP1 结合至关重要。通过亲和层析结合质谱分析，鉴定出可结合 Ins(1,4,5)P3 的 T.brucei 蛋白。SDS-PAGE 分析显示，与对照琼脂糖微珠洗脱的蛋白相比，Ins(1,4,5)P3 微珠洗脱的蛋白得到显著富集。对洗脱蛋白进行质谱分析，共鉴定出 250 多种蛋白，其中 84 种在 Ins(1,4,5)P3 微珠中相较于对照微珠显著富集。与对照珠相比，结合Ins(1, 4, 5)P3的蛋白质富集程度与SDS-PAGE检测到的蛋白质信号相关。本方案中的关键步骤是使用适当的对照，以区分特异性与非特异性相互作用。我们建议使用未偶联的琼脂糖珠，以及偶联了肌醇磷酸或磷脂酰肌醇磷酸（具有不同磷酸化构型，包括非磷酸化形式）的珠子作为对照。该方法可应用于其他单细胞原生动物寄生虫，例如克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）、利什曼原虫（leishmania）或疟原虫（plasmodium）。也可轻松适用于其他生物体，包括酵母或哺乳动物细胞。该方法可与定量质谱技术（如SILAC）联用，以鉴定蛋白质与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇之间的动态相互作用。该方法还可与亚细胞组分分离技术联用，以鉴定与这些代谢物结合的细胞器特异性蛋白质。这一策略已成功用于鉴定与肌醇磷酸和磷脂酰肌醇结合的蛋白质，相关研究涵盖布氏锥虫、哺乳动物细胞及酵母。该方法还有助于发现新的可与磷脂酰肌醇结合的蛋白质结构域。这为理解这些代谢物的调控功能及其在真核生物基因表达、细胞发育和信号转导中的作用奠定了基础。本实验方案中的一些试剂具有毒性或易燃性。请使用个人防护装备，并在必要时于通风橱中操作。

identification-inositol-phosphate-or-phosphoinositide-interacting

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

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