通过亲和层析联合蛋白质印迹或质谱法鉴定肌醇磷酸或磷脂酰肌醇相互作用蛋白

肌醇磷酸盐和磷脂酰肌醇是具有多种调控功能的真核生物代谢物，包括调控基因表达、蛋白质转运、信号转导以及细胞发育。它们通过与蛋白质结合来发挥这些调控功能，从而改变蛋白质的构象、催化活性或蛋白质间的相互作用。鉴定与肌醇磷酸盐或磷脂酰肌醇结合的蛋白质，对于理解这些代谢物如何执行其调控功能至关重要。

本方案流程简单，具有高灵敏度、非放射性、不含脂质体，且所用试剂均为商业化产品。该方法采用生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇进行层析，分离与其相互作用的蛋白质，随后通过蛋白质印迹或质谱法进行鉴定。对于血液形态的细胞，将布氏锥虫（T.brucei）细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）的HMI-9培养基中，于37°C、5%二氧化碳条件下培养至对数中期。

保持细胞密度在每毫升80万至160万个细胞之间。准备就绪后，在室温下以1600 × g离心10分钟。弃去上清液，并用10毫升预热至37°C的PBS-G缓冲液轻轻重悬沉淀，以洗涤细胞。

以1600 × g离心力在室温下离心5分钟，以完成洗涤。重复此洗涤步骤两次。然后将沉淀重悬于1毫升PBS-G中。

将此悬浮液转移至一个1.5毫升离心管中，然后在1600 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于0.5毫升裂解缓冲液中，缓冲液中需添加1.5 × 蛋白酶抑制剂混合物和1 × 磷酸酶抑制剂混合物，且已预先在冰上预冷，以裂解细胞。将裂解液在4°C、1400 × g条件下离心10分钟。

随后，将含有提取的寄生虫蛋白的上清液收集到一个新的1.5毫升离心管中，用于结合实验。保留总裂解液的5%用于蛋白质印迹分析。收集50微升与琼脂糖珠偶联的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇，加入500毫升结合缓冲液中。

在1000 × g条件下离心1分钟。弃去上清液，加入50 µL结合缓冲液重悬，以平衡磁珠。使用未偶联的磁珠作为对照，并使用具有不同磷酸化构型（包括非磷酸化形式）的磁珠，以排除非特异性相互作用。

接下来，向细胞裂解液或纯化的蛋白质中加入 50 微升的 IP 或 PI 磁珠。磁珠体积应控制在总裂解液体积的 10% 以内。如有需要，可使用结合缓冲液调整结合反应的总体积。

将反应液在4°C、50 rpm条件下旋转孵育一小时或过夜。随后，在4°C下以1000 × g离心一分钟。弃去上清液，保留沉淀，并确保保留5%的上清液用于Western印迹分析。

然后加入一毫升洗涤缓冲液，轻轻敲击或涡旋离心管以重悬树脂。在4°C条件下，以1000 × g离心反应物一分钟，弃去上清液。重复此步骤，共洗涤五次。

此后，向珠子中加入 50 微升含有 710 毫摩尔 2-巯基乙醇的 2× Laemmli 缓冲液。轻轻敲击或涡旋混匀，并稀释蛋白质。接着在 95 摄氏度加热 5 分钟，然后在 10,000 ×g 离心 1 分钟。

收集上清液，立即将洗脱液在-80摄氏度冷冻，或直接进行蛋白质印迹分析。本文所述方法用于分析PIs与来自T.brucei裂解液的阻遏-激活蛋白1，或重组的T.brucei阻遏-激活蛋白1蛋白的结合情况。由于RAP1缺乏典型的PI结合结构域，因此结合实验采用非磷酸化的PIs，或在肌醇环不同位置磷酸化的PIs，并使用非偶联的琼脂糖珠进行。

Western 分析显示，RAP1 优先结合 PI(3,4,5)P3 琼脂糖微珠，但也在较弱程度上结合 PI(4,5)P2 琼脂糖微珠。然而，它不结合其他任何磷脂酰肌醇（PIs）或琼脂糖微珠。为了检测 RAP1 是否直接结合磷脂酰肌醇（PIs），我们从大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化了C端带有6XHis标签的重组 RAP1 蛋白，获得均一产物。

Western blot 结果显示，增加 PI(3, 4, 5)P3 的浓度会抑制重组 RAP1 与 PI(3, 4, 5)P3 琼脂糖微珠的结合，而 PI(4, 5)P2 浓度的增加则无此效应。在反应体系中加入经纯化的布氏锥虫 PIP5Pase 酶后，重组 RAP1 与 PI(3, 4, 5)P3 的结合能力得以恢复。这是由于 PIP5Pase 对游离的 PI(3, 4, 5)P3 进行了去磷酸化修饰，表明该代谢物的磷酸化模式对我们研究的 RAP1 结合至关重要。

通过亲和层析结合质谱分析，鉴定出可结合 Ins(1,4,5)P3 的 T.brucei 蛋白。SDS-PAGE 分析显示，与对照琼脂糖微珠洗脱的蛋白相比，Ins(1,4,5)P3 微珠洗脱的蛋白得到显著富集。对洗脱蛋白进行质谱分析，共鉴定出 250 多种蛋白，其中 84 种在 Ins(1,4,5)P3 微珠中相较于对照微珠显著富集。

与对照珠相比，结合Ins(1, 4, 5)P3的蛋白质富集程度与SDS-PAGE检测到的蛋白质信号相关。本方案中的关键步骤是使用适当的对照，以区分特异性与非特异性相互作用。我们建议使用未偶联的琼脂糖珠，以及偶联了肌醇磷酸或磷脂酰肌醇磷酸（具有不同磷酸化构型，包括非磷酸化形式）的珠子作为对照。

该方法可应用于其他单细胞原生动物寄生虫，例如克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）、利什曼原虫（leishmania）或疟原虫（plasmodium）。也可轻松适用于其他生物体，包括酵母或哺乳动物细胞。该方法可与定量质谱技术（如SILAC）联用，以鉴定蛋白质与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇之间的动态相互作用。

该方法还可与亚细胞组分分离技术联用，以鉴定与这些代谢物结合的细胞器特异性蛋白质。这一策略已成功用于鉴定与肌醇磷酸和磷脂酰肌醇结合的蛋白质，相关研究涵盖布氏锥虫、哺乳动物细胞及酵母。该方法还有助于发现新的可与磷脂酰肌醇结合的蛋白质结构域。

这为理解这些代谢物的调控功能及其在真核生物基因表达、细胞发育和信号转导中的作用奠定了基础。本实验方案中的一些试剂具有毒性或易燃性。请使用个人防护装备，并在必要时于通风橱中操作。