Name: 洗涤剂辅助重组重组果蝇阿拉他素到脂质混合测定脂质体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习洗涤剂辅助重组技术，将重组果蝇atlastin蛋白重构至磷脂酰胆碱脂质体中，并利用FRET脂质混合测定法检测融合活性。该方法为研究内质网融合蛋白功能提供了高效可靠的实验方案。

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感谢 Michael Stern 博士及其实验室团队对与 atlastin 相关项目提供的见解和反馈。本研究由美国国立普通医学科学研究所 [R01GM101377] 和美国国立神经疾病与卒中研究所 [R01NS102676] 提供资助。

1. GST-DAtl-His8 的纯化
<ol>
	<li>蛋白表达与裂解液制备
	<ol>
		<li>转化BL21 (DE3) E. coli pGEX4-T3 载体中的 GST-DAtl-His8 构建体2 并在氨苄青霉素平板上进行筛选。</li>
		<li>挑选单个转化子，接种于5 mL LB + 氨苄青霉素（ampicillin）中5 µL 含100 mg/mL氨苄青霉素的14 mL培养管中，于 25 °C 以200 rpm振荡培养6-8小时。 
		注意： 由于存在泄漏表达，不建议在较高温度下培养。生长于 25 °C 减少蛋白质在此生长期的聚集。</li>
		<li>接种1 mL的5 mL培养物到200 mL LB + 氨苄青霉素培养基中，于~15–18 h内过夜培养 25 °C.</li>
		<li>次日早晨，通过离心（2,000 x g 孵育10分钟后，重悬于5 mL LB培养基中。</li>
		<li>接种4 L LB培养基（含氨苄青霉素）并测定OD值600 (0.05–0.15)。于 25 °C 振荡条件下。 
		注意： 预留部分培养基作为OD测定的空白对照600 添加细菌前的测量。</li>
		<li>测定 OD600 每小时检测一次，直至 OD 达到 0.4–0.5。此时，将温度降低至 16 °C.</li>
		<li>用 0.2 mM IPTG 诱导（800 µL 1 M 储液)，培养箱达到设定温度后 10 分钟 16 °C. 在约15–18 h内过夜孵育 16 °C. 
		注意： 较低的温度通过减少atlastin的聚集，提高了功能性蛋白的产量。</li>
		<li>次日早晨，通过以 7,500 x g 在 4 °C.</li>
		<li>将细胞重悬于200 mL A200溶液（25 mM HEPES（pH 7.4）和200 mM KCl）中。</li>
		<li>以 11,000 x g 离心细胞 g 5 分钟 4 °C.</li>
		<li>将沉淀重悬于40 mL破碎缓冲液（A200加10%甘油、2 mM 2-巯基乙醇、4% Triton X-100（TX100）、40 mM咪唑和一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合片）中。 
		注意： 重悬后加入TX-100以避免产生气泡和泡沫。</li>
		<li>通过18号针头，并在约10,000 psi压力下使用细胞破碎仪破碎细胞三次。</li>
		<li>在 125,000 x g 条件下离心提取物 g 1 小时。 
		注意： 可选地将沉淀物按1:2（w:v）比例溶于8 M尿素中，室温下旋转振荡过夜。尿素作为一种变性剂，可缓慢溶解任何不溶性沉淀蛋白，用于SDS-PAGE分析。保存 1 μL 用于SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。</li>
		<li>通过滤器过滤提取物 0.45 µm 用于去除细菌和大型细菌碎片的无菌硝酸纤维素膜滤器。 
		注：可选择性保存 1 μL 用于 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲和层析法蛋白质纯化
	<ol>
		<li>将过滤后的裂解液上样至经 Ni 活化的固定化金属离子亲和层析（IMAC）树脂柱2+，用低咪唑缓冲液（A100 加 10% 甘油、2 mM 2-巯基乙醇、1% TX-100、40 mM 咪唑）预平衡，流速为 1 mL/min，于 4 °C.</li>
		<li>用 A100 缓冲液（含 10% 甘油、2 mM 2-巯基乙醇、0.1% Anapoe X-100、40 mM 咪唑）以 1 mL/min 的流速洗涤层析柱，总体积为 25 mL， 4°C用30 mL咪唑线性梯度（40 mM至500 mM）洗脱蛋白，最后用5 mL 500 mM咪唑溶液冲洗。</li>
		<li>合并洗脱峰组分，于4 °C孵育1 h 4 °C 使用预先在水中溶胀并用含10%甘油、2 mM 2-巯基乙醇、0.1% Anapoe X-100 和 1 mM EDTA 的 A100 缓冲液平衡的 GSH-Agarose 胶珠。 
		注意： GSH-琼脂糖凝珠可在前一天于50 mL水中溶胀，并在4°C下过夜孵育 4 °C，或在室温下孵育1小时。为去除水和平衡缓冲液，将样品在水平转子中以500 × g离心 g 1 分钟，不刹车。用 26 G 针头吸去上清液。</li>
		<li>通过在摆动桶转子中以500 x g离心沉淀GSH-琼脂糖珠 g 不使用制动，用26 G针头抽吸去除裂解液上清。</li>
		<li>将珠子转移至一个10 mL的Polyprep层析柱中，用5 mL平衡缓冲液（A100含10%甘油、2 mM 2-巯基乙醇、0.1% Anapoe X-100和1 mM EDTA）洗涤5次，每次以500 x g离心 g.</li>
		<li>用含有10 mM还原型谷胱甘肽的平衡缓冲液1–1.5 mL洗脱蛋白。将洗脱的蛋白分装后在液氮中速冻。蛋白可保存于-80°C80 °C 无限期地 
		注意： 将洗脱缓冲液的 pH 调至 7.4。</li>
		<li>通过氨基黑蛋白测定法定量蛋白质浓度9 并通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估纯度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将重组 Atlastin 重构至脂质体中
<ol>
	<li>通过挤出法制备脂质体10
	<ol>
		<li>以氯仿配制脂质混合储备液（总脂浓度10 mM）。所需脂质包括：1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（NBD-DPPE）和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(罗丹明B磺酰)（Rh-DPPE）。受体脂质体成分为POPC:DOPS（摩尔比85:15），供体脂质体成分为POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE（摩尔比83:15:1.5:1.5）。 
		注意： 尽管POPC:DOPS脂质混合物传统上被用于体外脂质混合实验，但可根据不同的实验目的调整使用其他脂质组成。POPC:DOPS脂质体非常稳定且难以融合，因此是一种对融合条件要求极为严格的实验体系。</li>
		<li>添加 1 μCi/mL 将L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱（胆碱甲基-3H）加入脂质混合物中，以便后续通过液体闪烁计数测定脂质浓度。至少保留 8 μL 该储备液的</li>
		<li>将所需量的脂质混合物转移至燧石玻璃管中。</li>
		<li>在温和的氮气流下干燥脂质混合物2 气体吹扫约10分钟，直至无可见氯仿。</li>
		<li>在真空干燥器中进一步干燥脂质膜，抽真空30分钟。</li>
		<li>加入足量含10%甘油、2 mM 2-巯基乙醇和1 mM EDTA的A100水溶液至脂质膜中，使脂质浓度恢复至10 mM。在室温下轻轻涡旋振荡15分钟，使脂质膜重新悬浮。建议使用可容纳燧石玻璃管的涡旋振荡器。</li>
		<li>在液氮中对水合脂质进行十次冻融循环。每次在液氮中冷冻后，将溶液置于室温下解冻30秒，随后转移至水中以加快解冻速度。此冻融循环过程可最大限度减少多层囊泡的形成。 
		注意： 若试管内液体体积超过0.5 mL，且将其直接从液氮转移至水中，则可能导致试管破裂。</li>
		<li>使用微型挤出器，将脂质通过孔径为100 nm的聚碳酸酯滤膜挤出19次。</li>
		<li>通过闪烁计数法测定脂质体的总脂质浓度 
		注意： 部分脂质可能会残留在玻璃管和微型挤出器中。
		<ol>
			<li>添加 4 μL 3 mL 液体闪烁液中的脂质储备液和脂质体。</li>
			<li>测量储备液和脂质体的平均每分钟计数（CPMA），并使用以下公式计算脂质体浓度： <img alt="脂质体浓度计算公式，CPMA 比值；科学计算方法，化学方程式。" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>将脂质体储存于 4 °C 最长可保存一周。不建议更长时间储存，因为脂质体可能随时间发生聚集，降低再水合效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过去垢剂辅助掺入预制脂质体进行重组
	<ol>
		<li>计算需混合的缓冲液、蛋白质、脂质体和额外去垢剂的用量：
		<ol>
			<li>确定所需的总体积。该体积由含10%甘油、2 mM 2-巯基乙醇和1 mM EDTA的缓冲液A100组成。体积小于 250 μL 在0.5 mL微量离心管中不易充分混匀。</li>
			<li>计算所需脂质体体积，以获得约 1 mM 的终浓度脂质。从缓冲液体积中减去该体积。</li>
			<li>计算获得目标蛋白与脂质摩尔比（通常为1:400）所需的蛋白体积，并相应减少缓冲液体积。</li>
			<li>确定需要添加多少额外去垢剂才能使脂质体达到饱和，以实现有效的去垢剂与脂质比例（Reff)在0.64–0.8之间。注意考虑随蛋白质加入的去垢剂。(Reff）由以下公式确定 <img alt="有效折射率公式，\(R_{\text{eff}} = \frac{{D_{\text{total}} - D_{\text{water}}}}{[\text{lipid}]}\)。" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> D总计 是总去垢剂浓度，D水 是单体去污剂浓度（在存在去污剂的情况下，TX-100 和 Anapoe X-100 为 0.18 mM）4,11.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将缓冲液、去污剂、蛋白质和脂质体按以下顺序加入0.5 mL离心管中混合。迅速加入脂质体后立即涡旋振荡5秒，以充分混匀混合物。</li>
		<li>在摇床上孵育反应液，1 小时，温度为 4 °C.</li>
		<li>将0.2 g/mL非极性聚苯乙烯吸附珠悬浮于水中制成“浆液”。 
		注意： 在步骤2.2.3的前1小时孵育期间，制备聚苯乙烯吸附珠的“浆液”。</li>
		<li>称取0.2 g聚苯乙烯吸附珠，转移至微量离心管中。</li>
		<li>通过向离心管中加入1 mL甲醇并混匀1分钟来脱气珠粒。脱气后的珠粒会沉降。</li>
		<li>吸去甲醇，向珠粒中加入水。让珠粒与水混合5分钟，然后吸去水。重复此步骤四次，最后用水将聚苯乙烯吸附剂珠粒悬浮液调至1 mL体积，浓度为0.2 g/mL。 
		注意： 珠子应仍会沉降至管底。若未沉降，需再次进行脱气。使用21 G或更高规格的针头从珠子中吸除甲醇和水。 </li>
		<li>计算每个样品中吸附所有去垢剂所需的聚苯乙烯吸附珠的量。1 g 聚苯乙烯吸附珠可吸附 70 mg TX-100。为计算每项反应所需的聚苯乙烯吸附珠悬液的体积，将反应体系中去垢剂的总量（步骤 2.2.1.4）除以 70 mg，再除以珠悬液的浓度（0.2 g/mL，步骤 2.2.7）。</li>
		<li>将计算量的聚苯乙烯吸附珠悬液转移至0.5 mL离心管中，吸除水分。 
		注意： 剪切20–200 µL 用移液 tip 转移磁珠前，先将管涡旋振荡，以重悬已沉降的磁珠。</li>
		<li>将样品加入含有聚苯乙烯吸附珠的0.5 mL离心管中，于37 °C下旋转孵育1 h 4 °C.</li>
		<li>重复两次，留下旧的磁珠，将样品转移至新的磁珠中。</li>
		<li>将样品加入含有新鲜磁珠的第四根管中，于4°C下孵育过夜（约15–18小时） 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清晨，将样品从聚苯乙烯吸附珠中取出，通过在 16,000 x g 条件下离心 10 分钟，沉淀不溶性蛋白聚集体。 g 在 4 °C.</li>
	<li>回收上清液，并通过液体闪烁计数法测定最终脂质浓度（参见步骤 2.1.9.2）。可选地，可通过氨基黑蛋白测定法测定蛋白质浓度9. 
	注意： 对于 atlastin 蛋白脂质体，酶学测定应使用新鲜制备的脂质体进行。长期储存于 4 °C 或冷冻会导致 atlastin 活性显著降低。</li>
</ol>
3. 脂质混合实验
<ol>
	<li>将供体和受体蛋白脂质体分别用含10%甘油、2 mM β-巯基乙醇、1 mM EDTA 和 5 mM MgCl2 的 A100 缓冲液调整至浓度均为 0.15 mM。每种反应体系（50 μL）加入至适合荧光检测的平底白色96孔板的孔中。至少准备4个反应，包括三份平行样以及一个无GTP的阴性对照。</li>
	<li>将96孔板置于预热至37 °C的酶标仪中，每分钟检测一次NBD荧光（激发波长460 nm，发射波长535 nm），持续5分钟。</li>
	<li>加入5 mM GTP（5 μL 的 50 mM GTP）以诱导膜融合。</li>
	<li>继续每分钟检测一次NBD荧光，持续1小时。</li>
	<li>加入5 μL 2.5% w/v 的正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（n-Dodecyl β-D-maltoside）以溶解蛋白脂质体，测定最大NBD荧光强度，随后每分钟读取一次荧光信号，持续15分钟。</li>
</ol>
4. 脂质体在碘海醇不连续梯度中的漂浮12
<ol>
	<li>（可选）通过漂浮实验分析重组效率13。</li>
	<li>用 A100 配制含 10% 甘油、2 mM 2-巯基乙醇和 1 mM EDTA 的 80% 和 30%（w/v）碘海醇溶液。碘海醇不易溶解，因此需在 4 °C 下旋转孵育过夜，提前一天配制。</li>
	<li>将 150 μL 80% 碘海醇储备液与 150 μL 蛋白脂质体样品充分混合，使其达到 40% 碘海醇浓度。将混合液加入 5 x 41 mm2 超清管中，避免产生气泡。</li>
	<li>在样品上方缓慢加入 250 μL 30% 碘海醇储备液，形成中间层，注意避免产生气泡或扰动底层。在中间层上方，再缓慢加入 50 μL 含 2 mM 2-巯基乙醇和 1 mM EDTA 的 A100 溶液。</li>
	<li>将梯度样品在 4 °C 下以 220,000 × g 离心 4 小时，使用水平转子，设置慢加速且不刹车。</li>
	<li>收集梯度各层，通过 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色进行分析，可采用密度测定法进行定量。重组蛋白应上浮至顶层，而蛋白和脂质聚集体则会沉降至底层或滞留在中间层。</li>
</ol>
5. 通过凝血酶蛋白水解分析重组蛋白的取向
注意： 本文报道的 atlastin 融合蛋白在 N 端 GST 标签末端与 atlastin 起始端之间含有一个凝血酶切割位点。正确取向的 atlastin 可使该切割位点暴露于蛋白酶，而错误取向的蛋白则因被脂双层保护而无法被切割。
<ol>
	<li>为检测 atlastin 蛋白脂质体的方向性，需保留至少 8 μL 新近重构的蛋白脂质体。</li>
	<li>加入 8 μL 蛋白脂质体和 1 μL 浓度为 1 U/μL 的凝血酶。在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>加入 1 μL 浓度为 5 mg/mL 的无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物以终止蛋白酶反应，并在 37 °C 下继续孵育 30 分钟。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 及考马斯亮蓝染色分析样品。可通过密度测定法确定被切割与未被切割蛋白的比例。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法提供了一种高效纯化、重建并测定重组atlastin融合活性的方案。为确保获得高产量的功能性atlastin，必须注意若干关键步骤。atlastin的表达需在低温（16 °C）下进行，以避免蛋白聚集，且最终蛋白浓度应控制在0.4–1.5 mg/mL之间。若蛋白浓度过低，则在1:400的蛋白与脂质比例下无法实现最佳重建效果。重建效率可选择性地通过本文所述的浮力梯度离心法进行分析（图2）。脂质体浮力梯度离心法的优势之一在于，该方法可拓展用于分析与脂双层结合的可溶性蛋白13。此外，也可通过蛋白酶消化法分析重建后蛋白的取向14，但该方法可能无法区分错误折叠或聚集的重建蛋白与方向错误的重建蛋白（图3）。本方法制备的蛋白脂质体可用于膜融合活性检测，或用于在模型脂双层体系中研究atlastin的功能。尽管重建过程相对简单，但去垢剂和脂质浓度若稍偏离最优值，均可能导致重建效率下降。例如，过量的去垢剂可能引起脂质体溶解。
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膜融合是许多生物反应中的关键过程。在生物条件下，膜融合并非自发进行，需要特定的融合蛋白来催化此类反应1。在动物中，内质网同型膜融合由动力相关GTP酶atlastin介导2。atlastin在同型融合中的作用对于外周内质网中三向连接的形成至关重要，这些三向连接构成了贯穿整个细胞的广泛互联的管状网络。atlastin具有保守的结构域形态，包括一个较大的GTP酶结构域、一个由三段α螺旋组成的中间结构域、一个疏水性跨膜锚定区以及一个短的胞质C端尾部3。利用重组果蝇atlastin进行的体外研究表明，当将其重建至脂质体中时，其仍保持促融合活性。然而，其他atlastin蛋白（包括人源同源蛋白）尚未能在体外重现融合活性。本文描述了一种纯化带有GST和多聚组氨酸标签的重组果蝇atlastin、将其重建至脂质体并检测其融合活性的方法学。
在体外研究膜融合具有挑战性，因为促融合蛋白通常具有膜锚定结构。为了对其进行研究，必须将其重组到模型脂双层中。大单层囊泡（LUV）是研究脂质-蛋白质相互作用的有用工具。本文介绍一种制备不同脂质组成LUV的系统，用于蛋白质重组和融合检测。将整合膜蛋白重组到LUV中可通过多种方法实现，包括有机溶剂介导的重组、机械机制或去垢剂辅助重组4。本文介绍一种通过去除去垢剂将果蝇atlastin蛋白重组到预先形成的脂质体中的方法。该重组方法的优点包括较高的重组效率以及atlastin在脂双层中正确的取向。此外，该方法避免了蛋白质经历干燥或接触有机溶剂的过程，从而保持其结构与功能。其缺点在于，去垢剂的存在可能并非对所有蛋白质都理想，且最终的蛋白脂质体可能在脂双层中残留部分去垢剂。可通过进一步透析以去除更多去垢剂，但透析过程耗时较长，可能导致蛋白质活性丧失。
可通过脂质混合实验评估atlastin的融合活性，方法如前所述2。本文详细阐述了一种利用N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)（NBD）/丽丝胺罗丹明-B磺酰基（罗丹明）标记脂质来检测atlastin介导融合的方法。该实验需要供体（标记）蛋白脂质体与受体（未标记）蛋白脂质体之间的融合。在膜融合过程中，随着脂质混合，供体-受体对从“标记”脂质体稀释&#160;到“未标记”脂质体，可检测到荧光共振能量转移（FRET）信号的释放（图1）5。尽管该实验可作为膜融合的间接指标，但在区分完全膜融合与半融合（仅外小叶混合的状态）方面存在局限性。为解决此问题，可采用连二亚硫酸盐对外小叶的NBD进行淬灭。在沿用NBD/罗丹明脂质混合实验相同方法的基础上，当外小叶被淬灭后，任何由融合引起的NBD FRET信号释放均源于内小叶的混合8。
通过检测内水相内容物混合的替代性融合实验仅能反映完全融合过程5。此类实验的实例包括铽（Tb）/二吡啶甲酸（DPA）检测法以及8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（ANTS）/对二乙烯基联吡啶溴化物（DPX）检测法。在Tb/DPA检测中，将包裹有Tb的一组脂质体与包裹有DPA的另一组脂质体混合并促使其融合；融合后，在[Tb(DPA)3]3-螯合复合物内部，DPA向Tb发生能量转移，从而增强荧光信号6。相比之下，在ANTS/DPX检测中，ANTS的荧光会被DPX淬灭7。尽管这些方法可用于检测内腔内容物的混合，但需要更复杂的脂质体制备步骤，以去除未包封的试剂，并避免荧光探针之间发生非特异性相互作用。

<table><tbody><tr><td>10 mL 聚合层析柱</td><td>Biored</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 75 mm 茄形玻璃管</td><td>VWR</td><td>608225-402</td><td></td></tr><tr><td>47 mm 直径，0.45 &amp;mu;m 孔径 Whatman 无菌膜滤器</td><td>Whatman</td><td>7141 104</td><td></td></tr><tr><td>96 孔白色板</td><td>NUNC</td><td>437796</td><td></td></tr><tr><td>Anapoe X-100</td><td>Anatrace</td><td>9002-931-1</td><td></td></tr><tr><td>细胞破碎仪</td><td>Avestin</td><td>Avestin Emulsiflex C3</td><td></td></tr><tr><td>DOPS（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐））</td><td>Avanti</td><td>840035P-10mg</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Research organics inc.</td><td>6381-92-6</td><td>乙二胺四乙酸</td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Complete 蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>挤出器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z373400&amp;nbsp;</td><td>Liposofast Basic 挤出器</td></tr><tr><td>GE Akta Prime 液相色谱系统</td><td>GE Pharmacia</td><td>8149-30-0006</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽琼脂糖珠</td><td>Sigma aldrich</td><td>G4510-50ml</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>EMD</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>36051-31-7</td><td>鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物</td></tr><tr><td>HEPES，无酸型</td><td>Omnipur</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>fluka</td><td>5670</td><td></td></tr><tr><td>固定化金属亲和层析（IMAC）树脂柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17040801</td><td>1 mL HiTrap Chelating HP 固定化金属亲和层析柱</td></tr><tr><td>碘海醇</td><td>Accurate chemical and scientific corporation</td><td>AN 7050 BLK</td><td>Accudenz/Nycodenz</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Research products international corp.</td><td>I56000-100.0</td><td>IPTG，无二噁烷</td></tr><tr><td>还原型 L-谷胱甘肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5g</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Omnisolv</td><td>MX0488-1</td><td></td></tr><tr><td>NBD-DPPE（1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐））</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>NBD-DPPE</td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷</td><td>Chem-Impex International</td><td>21950</td><td></td></tr><tr><td>非极性聚苯乙烯吸附珠</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td>SM2 Biobeads</td></tr><tr><td>Nuclepore 蚀刻聚碳酸酯膜，19 mm，0.1 &amp;mu;m 孔径</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Optima LE80K 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷脂酰胆碱，L-&amp;alpha;-二棕榈酰基 [甲基-3H-胆碱]</td><td>ARC</td><td>ART0284</td><td>放射性标记脂质</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>TECAN</td><td>TECAN infinite M200 酶标仪</td><td></td></tr><tr><td>POPC（1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷脂酰胆碱）</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td>POPC</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>MP</td><td>151944</td><td></td></tr><tr><td>Rh-DPPE（1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(罗丹明B磺酰基)（铵盐））</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>Rh-DPPE</td></tr><tr><td>闪烁液</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-272</td><td>适用于水相或非水相样品的 Ecoscint XR 闪烁液</td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>Beckman</td><td>592928</td><td>快旋盖 Mini Poly-Q 瓶</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T1063-1kU</td><td>人血浆来源凝血酶</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管 5 mm x 41 mm</td><td>Beckman</td><td>344090</td><td></td></tr><tr><td>9 至 13 mm 试管涡旋适配器</td><td>VWR</td><td>58816-138</td><td>用于涡旋茄形玻璃管的插入件</td></tr><tr><td>涡旋管架固定器</td><td>VWR</td><td>58816-132</td><td>涡旋管架所需固定件</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>2.235074</td><td>Vortex Genie 2 型号 G560</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇，分子生物学级</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

去垢剂辅助的重组膜蛋白重构 果蝇 用于脂质混合实验的atlastin蛋白脂质体重组

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

膜融合是真核细胞中的关键过程，需要特定蛋白质来催化该过程。Atlastin 是定位于内质网（ER）的蛋白质，参与内质网的同型融合。本文详细描述了一种通过两轮亲和层析纯化带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多聚组氨酸标签的黑腹果蝇（Drosophila）atlastin的方法。体外研究融合反应需要将纯化的融合蛋白插入脂双层中。脂质体是理想的模型膜系统，因其脂质组成和大小均可调节。为此，我们介绍了一种通过去垢剂透析法将黑腹果蝇 atlastin 重组到预先形成的脂质体中的方法。尽管存在多种重组方法，但去垢剂去除法具有若干优势，使其特别适用于 atlastin 及其他类似蛋白。该方法的优势包括较高的重组效率以及重组蛋白的正确取向。此方法可推广至其他膜蛋白，以及需要蛋白脂质体的其他应用。此外，我们还描述了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的脂质混合检测法，用于检测蛋白脂质体的膜融合程度。

atlastin 重构效率如图2所示。将重构后的蛋白脂质体在碘克沙醇不连续梯度中上浮。未整合的蛋白质沉降至底层（B）或中层（M），而重构后的蛋白质则上浮至顶层（T）。收集梯度各层样品，并通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行分析。通过密度测定法对凝胶进行定量，结果显示重构效率极高，损失可忽略不计：总蛋白中有96%以蛋白脂质体形式上浮至顶层（T）；少于1%的蛋白未重构并存在于中层（M），仅有3%的蛋白未重构或发生聚集并沉降至底层（B）。
除了描述重构程度外，还通过凝血酶切割实验对atlastin重构后的取向进行了定量分析14。重构后的蛋白质可能处于错误的取向，即朝向脂质体的腔内空间。处于错误取向的蛋白质应受到脂双层的保护而免于蛋白水解。在N端GST标签的末端与atlastin的起始端之间编码有一个凝血酶切割位点。漂浮的蛋白脂质体在37 °C下与凝血酶孵育1小时，随后加入不含EDTA的蛋白酶抑制剂孵育30分钟以终止反应。样品通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色进行分析，并采...

生物膜融合由特化的融合蛋白催化。通过脂质混合实验可测定蛋白质的促融合特性。本文介绍了一种方法，用于纯化重组果蝇atlastin蛋白（一种介导内质网同型融合的蛋白），将其重组到预先形成的脂质体中，并检测其融合能力。

去垢剂辅助的重组膜蛋白重构 果蝇 用于脂质混合实验的Atlastin蛋白脂质体重组

膜融合是真核细胞中的关键过程。该过程需要特定蛋白质来催化融合反应。Atlastins 是内质网……

本文详述的重组与融合方案是一种在模型脂双层中研究膜结合蛋白以及融合蛋白介导的脂质混合的高效方法。本文中，我们描述了一种利用去垢剂辅助的方法，将重组的果蝇atlastin（一种内质网融合蛋白）重组到预先形成的磷脂酰胆碱脂质体中。随后通过基于荧光共振能量转移（FRET）的脂质混合实验，检测atlastin蛋白脂质体的融合情况。去垢剂辅助重组的一个关键优势在于，蛋白质在去垢剂中不会暴露于干燥或溶剂环境。我们在此还表明，atlastin 的重组取向效率非常高。基于 FRET 的脂质混合实验的另一个优点是，脂质体无需负载任何染料，也无需进行额外的透析步骤。开始此实验步骤时，按照文本方案中所述，用氯仿配制脂质混合储备液。向脂质混合液中加入每毫升含一微居里的DPPC，并确保至少保留八微升该储备液。将所需量的脂质混合液转移至燧石玻璃试管中。然后在温和的氮气流下将脂质混合物干燥约10分钟，直至看不到氯仿。再将所得的脂质膜置于真空干燥器中进一步干燥30分钟。此后，向脂质膜中加入足量含10%甘油、2毫摩尔2-巯基乙醇和1毫摩尔EDTA的A100溶液，使脂质浓度恢复至10毫摩尔。在室温下轻轻涡旋振荡15分钟，使脂质膜重新悬浮。用液氮冷冻水合脂质。为解冻脂质体，先将溶液在室温下静置30秒，然后转移至水中以加快解冻速度。重复此冻融循环共10次。之后，使用微型挤出器将脂质通过孔径为100纳米的聚碳酸酯滤膜挤出19次。为测定脂质体的总脂质浓度，取4微升脂质储备液和溶酶体加入到3毫升闪烁液中。按照文本方案中的说明，测量储备液和脂质体的平均每分钟计数，并计算脂质体浓度。将脂质体在4°C下保存，最多可保存一周。首先，按照文本方案中的说明，在0.5毫升离心管中混合适量的缓冲液、额外去垢剂和蛋白质。迅速加入脂质体，并立即涡旋混匀5秒。将反应液置于4摄氏度的旋转混合仪中孵育1小时。在孵育期间，称取0.2克聚苯乙烯吸附珠，转移至微量离心管中。向管中加入1毫升甲醇，混匀1分钟以去除珠子中的气泡。然后使用21号或更细的针头抽吸除去甲醇。开始洗涤珠子时，向珠子中加入水。将珠子与水混合5分钟，然后吸去水分。重复此水洗过程四次。之后，加入水使聚苯乙烯吸附珠悬液的体积达到1毫升，最终浓度为0.2克/毫升。根据文本方案中所述，计算每个样品中吸附所有去垢剂所需的聚苯乙烯吸附珠的用量。剪切移液器吸头以收集珠悬液。将计算好的珠悬液量转移至0.5毫升离心管中，并吸除上清液。将样品加入含有磁珠的离心管中，在4°C条件下于旋转混合仪上孵育1小时。将样品转移至含有新磁珠的新离心管中，注意留下旧磁珠。在相同条件下再次孵育。重复此转移和孵育珠子的过程两次。之后，将样品转移至含有新鲜珠子的新离心管中，并在4°C下轻轻摇动孵育过夜。第二天，从珠子中取出样品，在4°C、16,000 × g条件下离心10分钟，以沉淀不溶性蛋白聚集体。回收上清液，并按照文本方案中所述，通过液体闪烁计数测定最终脂质浓度。首先，将供体和受体蛋白脂质体分别用含甘油、β-巯基乙醇、EDTA 和氯化镁的 A100 缓冲液调整至 0.15 毫摩尔浓度。将每个反应体系转移至适合荧光检测的平底 96 孔板中的一个孔内，确保至少设置四个反应，包括三份重复实验和一个无 GTP 的阴性对照。将培养板放入预热至 37 °C 的酶标仪中。每分钟测量一次 NBD 荧光，持续五分钟。然后加入 5 mM GTP 以诱导融合。使用与之前相同的激发光和发射光，每分钟测量一次 NBD 荧光，持续一小时。之后，向各孔中加入 5 µL 2.5% n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷以溶解蛋白脂质体，并在接下来的 15 分钟内每分钟测量一次最大 NBD 荧光，激发光和发射光条件保持不变。在本研究中，重组的黑腹果蝇 atlastin 蛋白被纯化并重组到预先形成的脂质体中。通过将重建的蛋白脂质体在碘海醇不连续梯度中上浮，测定atlastin蛋白重建的效率。收集梯度顶部、中部和底部的样品，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行分析。利用密度测定法对凝胶进行定量，结果显示重建效率非常高，损失可忽略不计，总蛋白中有96%以浮至顶部梯度层的蛋白脂质体形式存在。仅有不到1%的蛋白未被重建并存在于中间层，仅有3%的蛋白未被重建或发生聚集并沉降到下层。重建后atlastin的取向通过凝血酶切割实验进行定量分析。样品通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行分析，并采用密度测定法进行定量。大部分重组蛋白被切割，仅有7%受到蛋白酶保护。通过脂质混合实验分析atlastin介导的蛋白脂质体融合的动力学和融合程度。在零时间点用GTP诱导融合之前，先进行5分钟的孵育。一小时后，加入正十二烷基-β-D-麦芽糖苷以溶解蛋白脂质体，并获得最大荧光共振能量转移释放。该实验中的融合最大值为最大荧光强度的11%。脂质溶于氯仿中。配制脂质混合物时，务必在冰上、于化学通风橱中快速操作，以避免任何蒸发。可通过显微镜分析atlastin蛋白脂质体，以观察膜锚定对脂质体形态和大小的影响。该方法已拓展用于研究其他膜锚定蛋白及其在模拟脂双层中的行为。本方案使用已知浓度的脂质来定量脂质混合物。操作放射性物质时，务必采取必要的防护措施。

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Biochemistry

生物化学

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