Name: 从人类唾液腺中分离唾液表皮细胞,作为脂质层或单层体进行体外生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解从人类唾液腺中分离原代上皮细胞并培养为唾液球或单层的方法。该技术为研究病毒复制机制提供了更接近体内环境的细胞模型，适用于多种患者样本。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢 James P. Bridges 在原代细胞培养相关方法上提供的宝贵指导。Matthew J. Beucler 获美国国立卫生研究院培训项目 T32-ES007250 资助。本研究还获得了授予 William E. Miller 的美国国立卫生研究院项目 R01-AI121028 和 R21-DE026267 的资助。

这些方案和研究已通过辛辛那提大学机构审查委员会的审查和批准（全机构范围保证编号 #00003152，IRB 方案编号 2016-4183）。唾液腺组织在许多头颈部外科手术中常被切除，通常未受恶性病变累及。通常，在从患者体内切除后 2–4 小时内使用新鲜切除的唾液腺组织（图 1A）。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）
	<ol>
		<li>加入制造商提供的试剂盒中的组分（见材料表）。</li>
		<li>用基础培养基冲洗每根试管一次，以确保组分完全转移。然后加入炭吸附处理的胎牛血清，使血清终浓度为4%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>红细胞（RBC）裂解缓冲液
	<ol>
		<li>配制10x储存液：称取40.15 g NH4Cl、5.0 g NaHCO3和0.186 g乙二胺四乙酸（EDTA），用dH2O定容至200 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。</li>
		<li>使用前用无菌dH2O稀释至1x工作浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解离溶液
	<ol>
		<li>向100 mL Dispase溶液瓶（见材料表）中加入0.15 g III型胶原酶。待胶原酶完全溶解后，过滤除菌，分装，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织消化
<ol>
	<li>使用100 mm细胞培养皿，用经高压灭菌的解剖剪刀和外科镊子将组织机械剪切成约1–2 mm大小的细小碎片（图1B，C）。应剪断组织碎片之间的结缔组织，以确保充分分离，并便于后续操作。</li>
	<li>向剪碎的组织中加入6 mL dispase/collagenase溶液，然后在37 °C孵育约30分钟至1小时。</li>
	<li>用5 mL血清移液管反复吹打组织15–20次，以进一步分散组织。</li>
	<li>再次于37 °C孵育30分钟至1小时。</li>
	<li>重复步骤2.3和2.4两到三次，或直至组织呈糊状并能轻松通过移液管开口（图1D）。 
	注意：组织样本的初始大小以及剪切的精细程度将决定步骤2.3和2.4需要重复的次数。通常情况下，我们收到的组织样本大小约为1 cm × 1 cm。此外，可使用标准倒置细胞培养显微镜监测组织解离过程，以追踪细胞从组织中分离的进展。少量细胞簇有利于唾液腺细胞以唾液球（salispheres）形式进行初始生长。</li>
</ol>
3. 用基底膜基质包被孔板
注意：基底膜基质（BMM）应在使用前一天于 4 °C 条件下过夜解冻。解冻后，BMM 必须始终置于冰上或 4 °C 环境中，因为在较高温度下其会迅速凝固（即形成凝胶）。此外，若样品在接种到 BMM 之前曾于冰上冷却，则需格外小心，因为低温样品会&#34;融化&#34;BMM，从而使细胞直接暴露于塑料培养皿表面。
<ol>
	<li>将BMM（参见材料表）缓慢移液至每个待包被的孔中。均匀且缓慢地将BMM分布在孔内。 
	&#8203;注意：通常我们每孔使用500 µL的BMM，但可根据需要调整体积，用于其他规格的培养板（如12孔板或24孔板），或制备更厚或更薄的水凝胶。</li>
	<li>包被后的培养板在使用前于37 °C孵育至少15分钟，以使BMM充分凝固。</li>
</ol>
4. 未消化组织的过滤、红细胞裂解和细胞铺板
<ol>
	<li>将步骤 2.5 中的组织匀浆转移至 15 mL 圆锥形离心管中。用 6 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤培养板一次，以转移残留的细胞。</li>
	<li>通过 70 µm 尼龙网细胞筛将匀浆过滤至 50 mL 圆锥形离心管中，以去除未消化的组织。将滤过的细胞在 500 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用无菌 dH2O 将 10 倍浓度的红细胞裂解缓冲液稀释成 1 倍工作液。</li>
	<li>吸除上清液，然后将细胞沉淀重悬于 10 mL 1x 红细胞裂解缓冲液中，在 37 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入 20–25 mL DPBS 以中和红细胞裂解缓冲液，并尽量减少唾液细胞的裂解。在 500 x g 条件下离心 5 分钟。 
	注意：经红细胞裂解缓冲液处理后，细胞沉淀应呈白色。若沉淀呈红色，表明红细胞尚未完全裂解。如有需要，可重复步骤 4.4&#160;至 4.5&#160;，直至红细胞完全裂解。</li>
	<li>吸除上清液，然后按每孔加入 1–2 mL 支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）重悬细胞沉淀，并将重悬的细胞接种至 BMM 包被的孔中。在 37 °C 下孵育。</li>
	<li>细胞接种至 BMM 后，将在 2–3 天内形成球形结构，即&#34;唾液球&#34;。在 BMM 开始降解前，细胞可作为唾液球维持约 5–7 天；BMM 降解后，细胞得以接触并黏附于塑料表面，进而以单层形式生长。</li>
</ol>
5. salisphere 的传代培养及在 BMM 上的维持
<ol>
	<li>吸弃孔板中的培养基，然后每孔加入 1 mL dispase/collagenase 溶液，在 37 °C 下孵育约 15 分钟，或直至基底膜基质（BMM）大部分溶解。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 圆底离心管中，并用 DPBS 洗涤孔板一次以收集残留细胞。在 500 ×g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液。将沉淀重悬于 2 mL 胰蛋白酶溶液中，然后在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>使用含 10% 血清的完全培养基中和胰蛋白酶。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液。将细胞重悬于 DPBS 中以去除残留的培养基、胰蛋白酶和血清。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液。将细胞重悬于 BEGM 中，并将重悬的细胞接种至已固化的 BMM 包被的培养皿中。重悬的细胞也可直接接种于经细胞培养处理的培养皿中，以单层形式进行增殖。有关唾液腺细胞以单层形式培养的更多信息，请参见第 6 节。在 BMM 或塑料表面培养的细胞应每隔 2–3 天更换一次新鲜的 BEGM。</li>
	<li>将细胞置于湿度控制的培养箱中，在 37 °C 和 5% CO2 条件下进行培养。</li>
</ol>
6. 在经处理的塑料培养皿上继代培养唾液球
注意：若在塑料培养皿上以单层形式培养细胞，请从此步骤开始。以下方案适用于在100 mm培养皿中生长的细胞。
<ol>
	<li>吸去培养基，用 DPBS 洗涤一次，以去除残留的培养基。</li>
	<li>加入 2 mL 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 15 分钟，或直至细胞完全脱落。</li>
	<li>使用 4 mL 含 10% 血清的完全培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>用约 5 mL DPBS 洗涤培养板一次，以收集残留细胞，于 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸去上清液，将细胞重悬于 6–10 mL DPBS 中，以去除残留培养基。</li>
	<li>于 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸去上清液，将细胞重悬于 BEGM 中，接种至经处理的塑料组织培养皿中，每 2–3 天更换新鲜 BEGM。</li>
	<li>将细胞培养于湿度控制的培养箱中，维持 37 °C 及 5% CO2 条件。</li>
</ol>
7. 细胞的冷冻保存
注意：细胞的冷冻保存可从源自唾液球或单层培养细胞的单细胞悬液中完成。
<ol>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，以计算存在的细胞总数。</li>
	<li>在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液。将沉淀用含有 10% 二甲基亚砜（DMSO）的支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）重悬。细胞浓度应为 2 × 106 个细胞/mL 至 10 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞分装至无菌冻存管中。将冻存管放入隔热泡沫架内，于 -80 °C 过夜孵育，以实现细胞的缓慢冷冻。</li>
	<li>次日，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。 
	注意：细胞应在 37 °C 快速解冻。解冻后，于 500 × g 离心使细胞沉淀，并在接种前去除含 DMSO 的培养基。</li>
</ol>

<ol><li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands%2C+Part+1%3A+Anatomy%2C+Infectious%2C+and+Inflammatory+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Imaging+Science%22%5BJournal%5D)">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47(2018).</li>
<li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolmberg%2C+KV+%22Monographs+in+Oral+Science%22">Monographs in Oral Science</a>. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).</li>
<li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).</li>
<li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21(2018).</li>
<li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%3A+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Rheumatology.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li>
<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li>
<li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li>
<li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus%3A+epidemiology+and+infection+control%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li>
<li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li>
<li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+human+and+mouse+salivary+glands%3A+A+practice+guide+for+salivary+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li>
<li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells%3A+A+STR+analysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li>
<li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li>
<li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands%3A+Hyposalivation+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li>
<li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%3A+Differentiation+of+Salivary+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li>
<li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

唾液腺功能障碍会影响舍格伦综合征患者以及接受邻近唾液腺肿瘤放射治疗患者的生存质量3,4,5,16。一种针对这些患者的潜在治疗方法是在体外培养具有功能的唾液腺干细胞或类器官，随后将其植入受损的唾液腺中以替代病变组织9。此外，唾液腺常常是人类病原体持续存在和传播的部位。例如，已知人类疱疹病毒（如人巨细胞病毒，HCMV）可感染唾液腺，并利用唾液腺和唾液将病毒传播给新的宿主7,8,17。然而，病毒在唾液腺中持续存在的分子机制及其进入唾液的过程仍不清楚。体外唾液腺细胞系统的建立将为探索这些机制提供重要的模型系统。
<p class="jove_conte...

在哺乳动物中，唾液腺分为三对主要唾液腺：腮腺、下颌下腺和舌下腺。此外，在舌部还分布有一系列小唾液腺，散在于整个口腔内1。主要唾液腺负责产生大部分唾液量2。唾液不仅通过分泌因子提供抗菌保护，还在食物咀嚼以及经食管运输过程中起到润滑作用2。因此，唾液腺功能障碍是一种医学问题，患者因无法分泌足够的唾液，更容易发生龋齿或口腔念珠菌病等疾病3。此外，唾液减少会导致进食和消化食物更加困难，显著影响生活质量。
唾液腺功能障碍主要见于患有干燥综合征（一种自身免疫性疾病）的患者，或接受过头颈部放疗的癌症患者3,4,5,6。由于自身免疫或放射治疗导致腺体内分泌腺泡受损，且无法自我更新，从而造成患者遭受不可逆的损伤6。唾液腺的研究也引起了关注病毒致病机制的研究人员的兴趣。某些病原体（如人巨细胞病毒，HCMV）可在唾液腺内持续复制，并通过唾液将新生病毒传播给新的宿主7,8。因此，迫切需要建立稳健且可重复的唾液腺组织体外模型，以应对和深入理解多种多样的医学问题。
已有多种小鼠唾液腺系统模型被用作研究起点，以理解并表征构成唾液腺的不同上皮细胞9,10。人类与小鼠唾液腺之间存在明显且重要的差异11。最显著的区别在于，人类腮腺相对于下颌下腺更大，而小鼠的下颌下腺与腮腺在大小上则更为相近1,2,11。尽管目前已存在永生化的人类下颌下腺细胞系，但人们普遍担忧这些永生化细胞无法准确维持原代组织的表型，同时也有疑虑认为这些细胞并非真正来源于唾液腺上皮组织本身12。基于这些原因，研究人源原代唾液腺组织具有重要意义且十分必要。
本文介绍一种从人唾液腺组织中分离原代上皮细胞并进行体外培养的实验方案。本方案基于 Pringle 等人和 Tran 等人的研究工作，并对其步骤进行了若干修改，以普遍简化操作流程13,14。首先，Tran 等人的方案要求使用酶消化唾液腺组织长达五小时，而我们的改良方案仅需一小时孵育即可成功，与 Pringle 等人的方案类似。其次，我们采用不同的酶组合进行组织消化，特别是未使用原始 Tran 等人方案中的胰蛋白酶（trypsin），而是使用分散酶（dispase）和胶原酶（collagenase）的混合物。我们倾向于在初始消化步骤中避免使用胰蛋白酶，因为最近一项研究表明，胰蛋白酶对唾液腺组织的初始消化可能导致细胞活力下降，可能是由于丢失了一类稀有的干细胞群体15。最后，我们将唾液球（salispheres）培养在基底膜基质（BMM）表面，并使用一种 commercially available 培养基，该培养基最初是为支气管上皮细胞扩增而设计的。本方案适用于从腮腺、下颌下腺和舌下腺中分离唾液腺细胞。这些细胞表达唾液淀粉酶及其他唾液特异性基因，表明其维持了类似于唾液腺腺泡上皮细胞的表型7。我们已利用该方法成功建立了来自 &#62;50 例原代人组织样本的唾液腺细胞培养。此外，这些原代唾液腺细胞可方便地进行冷冻保存，以供后续使用。

<table><tbody><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>支气管上皮细胞生长培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3171</td><td>根据制造商说明添加弹头试剂盒。补充 20 mL 去除活性炭的胎牛血清。</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 尼龙网细胞筛</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>去除活性炭的胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>12676-029</td><td></td></tr><tr><td>III 型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>LS004182</td><td>在 4 &amp;deg;C 下保存。</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Fisher</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶</td><td>Cell Applications</td><td>07923</td><td>将胶原酶溶解配制成 0.15% (w/v) 储存液。过滤除菌后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>55-031-PC</td><td></td></tr><tr><td>常规化学品</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PathClear 基底膜提取物</td><td>Cultrex</td><td>3432-005-01</td><td>使用前至少在 4 &amp;deg;C 下解冻 24 小时。操作时始终置于冰上。</td></tr><tr><td>六孔培养板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>手术镊</td><td>Fisher</td><td>22-079-742</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

从人唾液腺中分离唾液腺上皮细胞用于体外培养形成唾液球或单层细胞

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

唾液腺是研究人类多种疾病相关问题的重要部位。研究人员的一个目标是恢复因放疗损伤或与干燥综合征相关的病理状况而受损的腺体功能。另一个目标是阐明病毒在腺体组织内复制的机制，从而进入唾液，实现水平传播。这些研究目标凸显了建立一种稳定且易于获取的体外唾液腺模型的重要性，以便上述及相关研究领域的科研人员使用。本文介绍一种简单的方法，用于从人唾液腺中分离上皮细胞并在体外进行扩增。本方案可根据具体研究需求进一步优化。简言之，通过机械和酶消化方法将唾液腺组织解离，获得单个细胞或小细胞团。通过将细胞接种于基底膜基质上，并在促进上皮细胞生长的优化培养基中培养，实现上皮细胞的筛选。所获得的细胞培养物可维持为三维细胞团（称为“唾液球”），也可在经处理的塑料培养皿上以单层形式生长。该方法可获得主要为上皮细胞的异质性细胞群体，可在发生细胞衰老前连续传代5–8次（完成15–20次群体倍增）。

将消化组织后的细胞接种到BMM上2-3天后，细胞会迅速形成小的细胞簇，每个细胞簇的规模可继续扩大至15-20个细胞（图2A）。通常可见细胞碎片和脱落的死细胞，应通过吸除并更换新鲜培养基予以清除。细胞将以唾液球（salisphere）形式持续增殖约3-10天，或直至BMM层保持完整为止。偶尔由于BMM部分降解，细胞会贴附于底部塑料表面，并开始以单层形式增殖。在BMM上生长的唾液球在大小和结构复杂性方面会表现出一定变异性。可通过按本方案所述方法将唾液球传代至新制备的BMM上来维持其生长。在传代至新鲜BMM后的2-3天内，细胞将重新形成球状结构。唾液球细胞也可接种于经细胞培养处理的塑料表面，以单层形式生长，此时其形态学特征与上皮来源细胞一致，如图2B所示。尽管在BMM上以唾液球形式生长的细胞更可能维持唾液组织特有的表型，但以单层形式生长的细胞在某些实验方案中可能更具优势。需要进行更深入的表征分析，以确定单层培养的细胞与唾液球培养的细胞相比，在多大程度上保留了唾...

我们介绍一种分离和培养原代人唾液腺来源上皮细胞的方法。这些细胞表现出与唾液腺上皮来源一致的基因表达模式，可在来源于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的基底膜基质上以唾液球（salispheres）形式培养，也可在经处理的培养皿上以单层形式生长。

唾液腺是研究人类多种疾病相关问题的研究人员高度关注的部位。研究人员的一个目标是……

建立原代细胞模型或类器官样结构对于解答现代生物学中的许多问题至关重要。例如，我们长期以来一直关注人类病毒利用何种机制在唾液腺中促进复制，因为唾液腺是病毒水平传播的重要部位。本方案中所述的类唾液腺球体（salisphere-based）系统的建立，是我们致力于解答此类问题过程中的关键进展。该技术使我们能够从多种不同的患者样本中分离出原代细胞。由于这些细胞未经建模或转化，与常用于体外实验的许多细胞类型不同，因此所获得的细胞模型更接近体内真实情况。我们已利用本方案从小鼠原代下颌下腺中成功生成了类似的细胞，该方案也可能适用于其他具有相似细胞结构的器官。从患者体内取出后两至四小时内，在培养皿中使用经高压灭菌的解剖剪和外科镊子将唾液腺组织剪切成大小为一至二毫米的细小碎片。向剪碎的组织中加入六毫升 Dispase/Collagenase 溶液，随后在 37 摄氏度下孵育约 30 分钟至一小时。使用5毫升血清移液管吹打组织15至20次，使组织分散。在37°C下再孵育30分钟至1小时。重复吹打和孵育步骤两到三次，或直至组织呈糊状并能轻松通过移液管开口。为了用BMM包被孔板，将500微升经前夜解冻的BMM缓慢移液至6孔板的每个孔中。缓慢摇晃孔板，使BMM均匀分布于各孔。随后将包被好的孔板在37摄氏度孵育至少15分钟，以使BMM凝固，方可使用。首先，将含有匀浆组织的 Dispase/Collagenase 溶液转移至一个 15 毫升的锥形管中。用 6 毫升 DPBS 冲洗培养皿壁一次，以将残留的细胞转移至该锥形管中。随后，通过一个 70 微米的尼龙网细胞滤筛，将匀浆液过滤至一个新的 50 毫升锥形管中，以去除未消化的组织。将过滤后的细胞在500 × g离心5分钟。吸除上清液。然后将细胞沉淀重悬于10毫升1×红细胞裂解缓冲液中。在37摄氏度下孵育5分钟。然后加入20至25毫升DPBS以中和红细胞裂解缓冲液，并尽量减少唾液细胞的裂解。在500 × g下离心5分钟。白色细胞沉淀表明所有红细胞已完全裂解。如果沉淀呈红色，则需用红细胞裂解缓冲液再次处理。吸除上清液，并将沉淀重悬于1至2毫升的BEGM中，然后将重悬的细胞转移至BMM包被的孔板中。在37摄氏度下孵育。接种到BMM上后，细胞将在两到三天内形成球形结构或唾液腺球。细胞可作为唾液腺球维持约五到七天，之后BMM开始降解，使细胞能够接触并黏附于塑料表面，以单层形式生长。首先，吸出孔板中的培养基，向每孔加入1毫升Dispase/Collagenase溶液。在37摄氏度孵育约15分钟，或直至BMM大部分溶解。然后将细胞转移至15毫升锥形管中，并用1至3毫升DPBS洗涤孔板一次，以收集剩余的细胞。在500 × g下离心五分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于两毫升胰蛋白酶溶液中。再次于37°C孵育15分钟。接下来，向离心管中加入含有10%血清的完全

isolation-salivary-epithelial-cells-from-human-salivary-glands-for

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从人类唾液腺中分离唾液表皮细胞,作为脂质层或单层体进行体外生长

本文介绍了一种从小鼠唾液腺中分离干细胞的优化方案。该方法结合酶消化与机械消化，可分离获得含有具有干细胞特征细胞的唾液腺球状体（salispheres）。...

小鼠唾液腺干细胞的分离

介绍了一种从人皮肤中快速、高效分离活体成年上皮干细胞的方法。该方法利用酶消化皮肤胶原基质，随后拔取毛囊，并分离单细胞悬液或组织碎片用于细胞培养。...

从成人皮肤中分离和培养表皮干细胞

本文描述了一种分析组织成纤维细胞对相关上皮细胞影响的简单方法。该方法与三维组织培养相结合，可促进从三维结构中分离后细胞的分析。该技术适用于具有不同恶性潜能的细胞，有助于系统研究肿瘤相关间质对肿瘤细胞的影响。...

从三维混合细胞球体共培养物中分离乳腺上皮细胞

本视频介绍了唾液腺来源的三维球状体——唾液腺球（salispheres）的培养方案。这些唾液腺球可进一步用于评估头颈部癌症对患者唾液腺唾液分泌功能的影响。...

从唾液腺组织培养唾液球：一种由人唾液腺来源的上皮细胞生成唾液球的方法

本文介绍了一种利用病毒基因转移技术，在整体ex...

唾液腺类器官培养的遗传修饰与重组

利用三维类器官培养技术观察唾液腺的形态和功能标志物，可能为揭示辐射后组织损伤的机制提供新的见解。本文介绍了一种实验方案，用于在暴露于电离辐射前后，对50–90...

下颌下腺和腮腺类器官培养物的辐射处理模型关键再现了体内特征

泪腺（LG）含有两种表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的细胞类型：肌上皮细胞（MECs）和周细胞。MECs起源于外胚层，存在于多种腺体组织中，而周细胞是起源于内胚层的血管平滑肌细胞。本方案从鼠类LG中分离MECs和周细胞。...

从小鼠成年泪腺和下颌下腺中分离肌上皮细胞

本文介绍了一种改良的人牙龈上皮细胞分离与培养方法，即在传统方法的基础上添加了ROCK抑制剂Y-27632。该方法操作更简便、耗时更短，可增强干细胞特性，并能获得更多具有高增殖潜能的上皮细胞，适用于实验室研究及临床应用。...

使用 Y-27632 分离与培养原代人牙龈上皮细胞

牙囊包含上皮细胞群和间充质细胞。通过使用特定的培养基，从异质的牙囊细胞群中筛选出上皮细胞群。上皮细胞在无血清培养基中存活并形成克隆集落。...

从人牙囊中分离上皮细胞

本研究报道了一种更简便、省时且经济的方案，可从少量乳腺组织中高效分离和培养原代人乳腺上皮细胞（HMECs）。该方案适用于快速制备原代HMECs，可用于实验室和临床应用。...

原代人乳腺上皮细胞的分离与培养

了解从人类唾液腺中分离原代上皮细胞并培养为唾液球或单层的方法。该技术为研究病毒复制机制提供了更接近体内环境的细胞模型，适用于多种患者样本。

从人唾液腺中分离唾液腺上皮细胞用于体外培养形成唾液球或单层细胞

探索更多视频