从人类唾液腺中分离唾液表皮细胞,作为脂质层或单层体进行体外生长

生成主要细胞模型或器官状结构是回答生物学中许多当代问题的关键。例如，我们相当长一段时间一直对人类病毒用于促进唾液腺复制的机制感兴趣，因为它是水平传播的重要站点。本协议中描述的基于盐球的系统的发展是我们寻求回答这类问题的关键进展。

这种技术使我们能够从各种不同的患者样本中生成原发细胞。细胞模型更让人想起体内类型的情况，因为细胞不像许多通常用于体外实验的细胞类型那样进行建模或转化。我们已经使用这个协议从小鼠原发性亚人类腺体生成类似的细胞，该协议可能对于具有类似细胞结构的其他器官有用。

从患者那里切除了后两到四个小时内，在培养盘上，使用自动消毒的解剖剪刀和手术钳将唾液腺组织切碎成一到两毫米大小的细片。在切碎的组织中加入六毫升的 Dispase/胶原酶溶液。然后在37摄氏度下孵育约30分钟至1小时。

用5毫升血清移液器移液15至20次，使组织中断。在37摄氏度下孵育30分钟到1小时。再重复移液和孵育步骤两到三次，或直到组织类似于泥浆，并很容易通过移液器开口。

要用 BMM 覆盖油井，请缓慢移液 500 微升的隔夜解冻 BMM 到六孔板的每个孔中。缓慢旋转板，将 BMM 均匀分布到井上。然后在37摄氏度下孵育涂层板，在使用前至少15分钟，让BMM凝固。

首先，将含有均质组织的 Dispase/胶原酶溶液转移到 15 毫升锥形管中。用六毫升 DPBS 清洗板壁一次，将剩余的细胞转移到锥形管中。然后通过70微米尼龙网状细胞过滤器，将均质过滤成新的50毫升锥形管，以去除未消化的组织。

在500倍g下将细胞离心5分钟。吸上一道。然后将细胞颗粒重新在 10 毫升 1X RBC 解解缓冲液中。

在37摄氏度下孵育5分钟。然后加入20至25毫升的DPBS，以中和RBC解液缓冲液，并最大限度地减少唾液细胞的解解。在500倍g下离心5分钟。

白细胞颗粒表示所有RBC的完整解解。如果颗粒有红色，使用RBC解液缓冲液重复处理。吸升液，将颗粒重新在 BEGM 的一到两毫升中，然后将重新令人沮丧的细胞转移到 BMM 涂层孔上。

在37摄氏度下孵育。一旦镀在BMM上，细胞将在两到三天的时间内形成球形结构或盐球。细胞可以保持为盐球约五到七天之前，BMM开始降解，允许细胞访问和粘附在塑料和成长为单层。

首先，从油井中吸出介质，并在每口井中加入一毫升的 Dispase/科拉特纳塞溶液。在37摄氏度下孵育约15分钟，或直到BMM大部分溶解。然后将细胞转移到15毫升锥形管中，用1至3毫升的DPBS洗一次井，以获得剩余的细胞。

在500倍g下离心5分钟。吸升液，将颗粒重新在两毫升的 Trypsin 中。在37摄氏度下再次孵育15分钟。

接下来，加入管中任何含有10%血清的完整介质，以中和三辛。在500倍g下离心5分钟。吸上液去除残留介质、三辛和血清，然后在DPBS中重新喷洒细胞。

在500倍g下离心5分钟。吸上一液，并在 BEGM 中重新暂停颗粒。为了保持颗粒作为球体，将重新暂停的细胞板到凝固的 BMM 涂层培养皿上。

培养加湿培养箱中所有细胞在下培养前5至7天保持37摄氏度，二氧化碳含量为5%。每两到三天用新鲜的 BEGM 喂养。要将细胞作为单层扩散到塑料培养皿上，请从培养皿中吸出 BEGM 介质，用 DBPS 洗一次，以去除残留介质。

加入两毫升的三辛，在37摄氏度下孵育15分钟，或直到细胞完全分离。使用含有10%血清的任何完整介质的四毫升中和 Trypsin。然后轻轻倾斜盘子，将细胞转移到15毫升锥形管。

用大约五毫升的 DPBS 洗一次盘子，以收集剩余的细胞。在500倍g下离心5分钟。吸上一道。

要去除残留介质，请重新在 DPBS 的 6 到 10 毫升中重新发送细胞。在500倍g下离心5分钟。吸上一道，在 BEGM 中重新暂停。

然后将细胞板到经过处理的塑料组织培养皿上。培养加湿培养箱中的细胞在下培养前5至7天保持37摄氏度，二氧化碳含量为5%。每两到三天用新鲜的 BEGM 喂养。

在该协议中，将消化的组织细胞电镀到BMM两到三天后，细胞很容易形成小簇，每个组的大小继续扩大，高达15至20个细胞。盐球细胞被镀在细胞培养处理后塑料上，并生长成单层，它们表现出与上皮起源细胞一致的形态。需要适当的无菌技术和护理，以避免细菌或真菌污染。

任何抗生素或抗神秘药都无法拯救大量微生物的培养。我们正在回答有关病毒发病机制和传播的问题。但对于其他人，这提供了一种方法来研究人类唾液细胞为任何数量的应用，如组织再生疗法。

对于研究人类巨细胞病毒的我们来说，这项技术使我们能够开始探索病毒利用的分子机制来感染并最终传染给新的宿主。本协议中使用的任何方法本质上都是危险的，但在处理人体组织和任何类型的化学试剂时应始终小心谨慎。