Name: 建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学习建立胃癌患者衍生异种移植模型和原代细胞系的方法，使用NSG免疫缺陷小鼠进行肿瘤移植实验。该技术可保留肿瘤组织学特征和异质性，为抗癌药物开发和个性化医疗研究提供可靠的临床前评估平台。

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本工作得到国家自然科学基金（81572392）；国家重点研发计划（2016YFC1201704）；广东省特支计划杰出青年科技人才项目（2016TQ03R614）的资助。
我们特别感谢广州赛基生物技术有限公司在图示制备过程中提供的帮助。

本项人体研究已获得中国广州中山大学肿瘤防治中心（SYSUCC）机构伦理审查委员会的批准。动物研究已获得中山大学机构动物护理和使用委员会的批准。&#160;注：所有实验均遵循相关法律法规及机构指南，包括《职业性接触血源性病原体防护指南》。
1. 样品制备
<ol>
	<li>直接从手术中获取胃癌组织（P0 = 第0代），肿瘤标本体积应大于0.5 cm3。</li>
	<li>准备3–4 mL培养基储备液：例如，添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基（1×）。</li>
	<li>将新鲜肿瘤标本置于储备液中，4 °C保存，时间不超过4小时。</li>
</ol>
2. 建立PDX模型（图1）
<ol>
	<li>为确保手术区域无菌，将所有材料用紫外线照射消毒超过 30 分钟，然后转移至动物实验室。 
	注意：在使用二氯异氰尿酸钠消毒剂清洁台面之前，需先用紫外线对操作室照射消毒&#160;30 分钟。随后使用聚维酮碘对皮肤进行消毒。</li>
	<li>在无菌条件下，使用镊子和剪刀小心分离肿瘤组织，并将其修剪成若干小块（约 1 mm3 的立方体）。</li>
	<li>使用麻醉机，通过暴露于 1–1.5% 异氟烷对 5 至 7 周龄的雌性 NOD-SCID-IL2rg（NSG）小鼠进行麻醉。
	<ol>
		<li>将小鼠麻醉至不再挣扎但仍保持均匀呼吸的状态。 
		注意：50 mL 离心管是一种简易装置，功能类似于麻醉机。由于手术时间较短，无需使用兽用眼膏防止角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌剪刀在小鼠两侧背部外侧做 1 cm 切口，并将一块肿瘤组织植入每侧背部。
	<ol>
		<li>为防止肿瘤组织滑出，使用无菌镊子破坏皮下组织。然后夹取一块肿瘤组织，将其置于较深的位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用外科缝合针进行皮下缝合以关闭植入部位，并用标记好的耳标对小鼠耳朵进行标记。</li>
	<li>用碘对伤口进行消毒。</li>
	<li>术后将小鼠轻轻放置于空笼中，保持胸卧位。密切观察小鼠状态；它们通常在约 3–4 分钟后苏醒并开始行走。将接受手术的小鼠放入另一个新笼子中，与未接受手术的小鼠分开饲养。</li>
	<li>通过触诊移植部位评估肿瘤大小，每周使用游标卡尺测量肿瘤两次。</li>
	<li>当肿瘤直径达到 10 mm，或动物状况恶化，或肿瘤发生溃疡时，采用经 IRB 批准的方法处死小鼠。将收获的新鲜肿瘤组织碎片重新植入 2 只新的小鼠中进行传代，或将标本暂时保存在冰上的 PBS 中，用于原代细胞系的分离。</li>
</ol>
3. 组织冷冻保存
注意：本部分主要参考活体组织冷冻试剂盒的操作方法。主要试剂盒和设备列于材料表中。
<ol>
	<li>当肿瘤直径超过10 mm时，采用经伦理审查委员会（IRB）批准的方法对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>使用无菌镊子和剪刀，缓慢从小鼠体内分离肿瘤组织。</li>
	<li>在10 cm培养皿中用DPBS清洗肿瘤组织，使用镊子和剪刀剥离坏死区域、脂肪组织、血凝块及结缔组织。</li>
	<li>使用模具将肿瘤组织切成最大厚度为1 mm的薄片。</li>
	<li>在10 cm培养皿中用DPBS清洗组织切片。 
	注意：玻璃化冷冻过程在步骤3.6–3.8中涉及标记为V1/V2/V3的试管，其主要成分为DMSO和蔗糖。</li>
	<li>用镊子将切片转移至V1管中，在4 °C孵育4分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置4分钟。</li>
	<li>将V1溶液和切片倒入10 cm培养皿中，用镊子将切片转移至V2管中，在4 °C孵育4分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置4分钟。</li>
	<li>将V2溶液和切片倒入10 cm培养皿中，用镊子将切片转移至V3管中，在4 °C孵育5分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置至少5分钟。确保所有切片均沉入管底。
	<ol>
		<li>若仍有数个切片漂浮，可再次短暂滚动并倒置试管，重新置于4 °C直至所有切片完全下沉；必要时可弃去漂浮的切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将V3溶液和切片倒入10 cm培养皿中。</li>
	<li>将组织载体剪裁至适当长度，放置于无菌纱布上；将切片转移至载体上，用纱布包裹载体，用镊子夹取后放入液氮中，随后孵育5分钟。</li>
	<li>在冻存管上标注组织相关信息。</li>
	<li>将带有组织切片的载体转移至冻存管中，并储存在液氮中。</li>
</ol>
4. 原代细胞的分离（图2）
<ol>
	<li>使用高压蒸汽在 121 °C 下对镊子和剪刀灭菌 30 分钟。</li>
	<li>从切除的标本或收获的 PDX 组织中切除胃癌样本。将组织置于冰上，然后转移至一个 10 cm 的无菌培养皿中。</li>
	<li>用镊子和剪刀解剖并去除坏死区域、脂肪组织、血凝块和结缔组织。</li>
	<li>在 10 cm 培养皿中，用含有 100 U/mL 青霉素和 0.1 mg/mL 链霉素的 DPBS 清洗肿瘤组织一次。</li>
	<li>在培养皿盖上将肿瘤组织切成 1 mm3 的小块；每块的最大厚度应为 1 mm。</li>
	<li>将组织转移至一个 50 mL 离心管中，加入约 7 mL 的 I 型胶原酶和胰蛋白酶（1:14）溶液。短暂涡旋混合。</li>
	<li>将离心管置于 37 °C 水浴中孵育 30–40 分钟，每 5 分钟涡旋一次。</li>
	<li>向管中加入等体积的含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基（1x），充分涡旋混合。</li>
	<li>通过 40 μm 滤膜缓慢过滤，将混合物转移至新的 50 mL 离心管中。 
	注意：使用 40 μm 滤膜可确保更高的癌细胞比例。如有需要，可使用 100 μm 滤膜以保留更多类型的细胞，例如免疫细胞。</li>
	<li>在室温下以 113–163 × g 离心 5–7 分钟，小心去除上清液。</li>
	<li>用 5 mL PBS 重悬沉淀，小心去除上清液。</li>
	<li>如果沉淀呈红色，说明含有大量红细胞。用 500 μL 红细胞裂解缓冲液轻轻重悬沉淀，孵育 5 分钟后加入 5 mL PBS，再小心去除上清液。</li>
	<li>用培养基重悬沉淀，并将混合物转移至无菌的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>每 2–3 天更换一次含血清的培养基。</li>
	<li>当原代细胞达到 50% 汇合度时，使用胰蛋白酶/EDTA 进行传代。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

胃癌是一种侵袭性强且治疗选择有限的疾病，因此胃癌模型已成为支持功能研究并直接向临床转化的关键资源4,8,17。本文中，我们描述了建立胃癌患者来源的异种移植（PDX）模型和原代细胞系的方法与实验方案。重要的是，胃癌标本的形态学和生物学特性在PDX模型中基本得以保留。
在建立PDX模型的实验方案中，有一些关键点需要特别强调，以提高移植成功率。推荐使用NSG（NOD-SCID-IL2rg）小鼠作为免疫缺陷小鼠模型，因为这类小鼠的免疫抑制程度更为严重，缺乏T细胞、B细胞和NK细胞18,19,20,21。此外，由于小鼠免疫缺陷严重，所有实验操作必须保持无...

胃癌是全球第五大常见癌症，也是癌症死亡的第三大原因。2018年，全球确诊胃癌新病例超过100万例，估计有78.3万人死于该疾病1。胃癌的发病率和死亡率在东亚东北部国家仍然很高2,3。尽管癌症治疗领域已取得显著进展，但晚期胃癌患者的预后仍然较差，五年生存率约为25%4,5,6,7,。因此，迫切需要开发新的胃癌治疗策略
胃癌的治疗具有挑战性，因其具有高度异质性8,9。&#160;因此，如何应对肿瘤异质性带来的挑战以实现精准医疗，是癌症研究的核心问题。体外和体内模型在阐明胃癌的异质性机制和生物学特性方面发挥着关键作用。然而，尽管目前已有多种胃癌细胞系以及大量用于临床前研究的传统转基因小鼠模型，但这些模型的缺点限制了其应用10。由于这些模型在培养过程中特性已发生变化，无法再反映肿瘤异质性，其对药物的反应也无法预测人体内的真实响应11。这些问题严重限制了识别可能对靶向药物产生反应的癌症患者亚群的可能性。原发肿瘤的短期培养为研究抗肿瘤药理特性提供了一种相对较快且个性化的途径，这很可能成为个体化癌症治疗的标志性方法。
患者来源的异种移植模型（PDX）是药物反应谱分析的优选临床前替代模型12。此外，PDX模型为研究癌症的发生和进展提供了有力工具13,14。PDX模型能够保持癌细胞的组织学特征，保留肿瘤内的异质性，并更真实地反映肿瘤微环境中相关的人源组分15,16。然而，目前广泛使用的PDX模型存在建立和连续传代人源实体瘤成功率较低的局限性。本研究描述了较为成功的小鼠PDX模型及原代细胞系的建立方法。

<table><tbody><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Biologix, 山东, 中国</td><td>15-1040</td><td></td></tr><tr><td>生物显微镜</td><td>OLYMPUS, 东京, 日本</td><td>OLYMPUS CKX41</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf, 米特尔萨克森, 德国</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国</td><td>HERACELL 150i</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Basalmedia Technology, 上海, 中国</td><td>L40601</td><td></td></tr><tr><td>电热恒温水浴箱</td><td>一恒, 上海, 中国</td><td>DK-8AXX</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Wisent Biotechnology, 温哥华, 加拿大</td><td>86150040</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter, 中国</td><td>CN2L9100</td><td></td></tr><tr><td>活体组织冷冻试剂盒</td><td>Celliver Biotechnology, 上海, 中国</td><td>LT2601</td><td></td></tr><tr><td>活体组织解冻试剂盒</td><td>Celliver Biotechnology, 上海, 中国</td><td>LT2602</td><td></td></tr><tr><td>NSG 小鼠</td><td>百奥赛图, 北京, 中国</td><td>B-CM-002-4-5W</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液</td><td>Solarbio, 北京, 中国</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国</td><td>8118367</td><td></td></tr><tr><td>带线外科缝合针</td><td>灵桥, 宁波, 中国</td><td>3/8 弧形 4&amp;times;10</td><td></td></tr><tr><td>组织处理模具及辅助刀片</td><td>Celliver Biotechnology, 上海, 中国</td><td>LT2603</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国</td><td>2003779</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国</td><td>17100017</td><td></td></tr></tbody></table>

建立胃癌患者来源的异种移植模型和原代细胞系

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

利用临床前模型来加深对肿瘤生物学的理解并研究治疗药物的疗效，是癌症研究的关键。尽管目前已建立多种胃癌细胞系以及多种传统的转基因小鼠模型用于临床前研究，但这些体外和体内模型的缺点限制了其应用。由于这些模型在培养过程中特性已发生变化，无法再模拟肿瘤异质性，其对药物的反应也无法准确预测人体内的反应。因此，研究人员正在开发能够更好地体现肿瘤异质性的替代模型。源自患者的异种移植（PDX）模型可保留癌细胞的组织学形态，维持肿瘤内部的异质性，并更真实地反映肿瘤微环境中相关的人源成分。然而，构建一个PDX模型通常需要4至8个月，这超过了多数胃癌患者的预期生存期。鉴于此，建立原代癌细胞系可能是药物反应研究的一种有效补充方法。本实验方案描述了从手术切除的胃癌样本中建立PDX模型和原代癌细胞系的技术方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有力工具。

在此，手术获取的肿瘤组织被保存在储存液中，直至进行下一步操作。4小时内，将肿瘤组织切成小块，并植入已用异氟烷浸润的棉球麻醉的NSG小鼠背部侧 flank 区域。体积大于1 cm3 的肿瘤可被切除，用于移植至新的小鼠（图1），或小心切片后按照方案保存于液氮中。本研究中，第一代肿瘤的生长速度较慢，需3周或更长时间才能达到适宜大小。第一代皮下肿瘤成瘤的成功率超过80%。我们通过显微镜下苏木精-伊红（H&amp;E）染色确认了PDX模型中癌细胞的身份（图3C）。最终，由冻存肿瘤组织进行移植后肿瘤形成的成功率约为95%。
原代癌细胞的分离是研究个体肿瘤的另一种方法。这些细胞来源于手术标本或PDX模型。肿瘤组织用DPBS洗涤后切成小块。组织碎片经Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶（1:14）充分消化后进行过滤。去除红细胞后，细胞以与其他癌细胞相同的方式进行培养。存活的间充质细胞在后续传代中会死亡（图2）。根据...

本方案描述了从手术获取的胃癌样本中建立患者来源的异种移植（PDX）模型和原代癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。

利用临床前模型加深对肿瘤生物学的理解并研究治疗药物的疗效，是癌症研究的关键。

源自患者的异种移植模型和原代细胞系正成为药物开发以及肿瘤生物学研究启动与进展的重要组成部分。源自患者的异种移植模型可保留癌细胞的组织学形态，维持肿瘤内异质性，并更真实地反映肿瘤微环境中相关的人源成分。相较于传统的癌细胞系，这些模型能更准确地代表人类癌症，有望提升新型抗癌疗法的临床前评估效果。此外，这些模型可用于比较不同癌症患者亚组之间的分子特征或肿瘤标志物。推荐使用NSG小鼠作为免疫缺陷型小鼠模型。由于该小鼠具有严重的免疫缺陷，所有实验过程中必须保持无菌条件。在无菌条件下，使用镊子和剪刀仔细解剖肿瘤组织，并将其切成若干小块。麻醉小鼠后，用无菌剪刀在其背部两侧各做一个一厘米长的切口。使用无菌镊子分离皮下组织。然后，剪取一块肿瘤组织，将其植入深部位置。使用手术缝合针进行皮下缝合，闭合植入区域。用碘伏对伤口进行消毒。此后，将小鼠轻轻放入一个空笼子中，保持其胸卧位。需密切观察小鼠，通常在三到四分钟后，小鼠将苏醒并开始行走。将接受手术的小鼠放入新笼子中，与未接受手术的小鼠分开放置。通过触诊移植部位评估肿瘤大小，并使用游标卡尺每周测量两次。处死小鼠后，使用无菌镊子和剪刀缓慢分离小鼠体内的肿瘤。将肿瘤组织置于10厘米培养皿中，用DPBS洗涤。使用镊子和剪刀解剖并去除坏死区域、脂肪组织、血块和结缔组织。接下来，使用模具将肿瘤组织切成最大厚度为一毫米的薄片。用10厘米培养皿中的DPBS清洗肿瘤切片。开始玻璃化冷冻过程时，用镊子将切片转移至V1管中，在4摄氏度下孵育4分钟。轻轻滚动并倒置试管数秒，随后继续在4摄氏度下孵育4分钟。接着，将V1溶液和切片倒入一个10厘米的培养皿中，用镊子将切片转移至V2管中，在4摄氏度下孵育4分钟。轻轻滚动并短暂倒置离心管，于4°C孵育另外4分钟。随后，将V2溶液和脑片倒入10厘米培养皿中。将脑片转移至V3管中，于4°C孵育5分钟。轻轻滚动并短暂倒置离心管，于4°C孵育另外5分钟。确保所有脑片均沉至管底。若仍有数片漂浮，再次轻轻滚动并短暂倒置离心管，于4°C继续孵育，直至所有脑片完全下沉。然后，将 V3 溶液和脑片倒入一个 10 厘米的培养皿中。将组织支撑架剪成适当长度，并置于无菌纱布上。将脑片转移至支撑架上。用纱布包裹支架。使用镊子将支架放入液氮中，孵育五分钟。之后，用组织信息标记冻存管。将带有组织切片的保存装置转移至储存于液氮中的小瓶中。首先，从切除的标本或收获的PDX组织中分离胃癌样本。将组织置于冰上，并转移至10厘米的无菌培养皿中。使用镊子和剪刀去除坏死区域、脂肪组织、血凝块和结缔组织。将肿瘤组织在含有青霉素和链霉素的10厘米培养皿中的DPBS中洗涤一次。接下来，在培养皿的盖子上将肿瘤切成小块。每块组织的最大厚度应为一毫米。将组织块转移至含有七毫升 I 型胶原酶和胰蛋白酶溶液的 50 毫升离心管中。短暂涡旋混匀混合物。在37摄氏度水浴中孵育

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系

本视频介绍了将经GFP慢病毒标记的PDX来源的结直肠癌类器官移植至免疫缺陷小鼠脾脏以生成转移瘤的实验方案。通过荧光显微镜检测GFP表达，可观察到定植于其他器官的癌症微转移灶。...

建立实验性转移小鼠模型：在PDX模型中植入表达GFP的结直肠癌类器官细胞以检测微转移灶

我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内...

用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

本文介绍了一种建立和培养人源及小鼠源三维（3D）胃类器官的方案，以及将三维类器官转化为二维单层细胞的实验方法。同时描述了利用胃上皮单层细胞作为新型划痕损伤模型进行再生研究的方法。...

用于研究再生的鼠源和人源原代胃上皮单层培养

本方案描述了通过将高级别尿路上皮细胞癌细胞经膀胱内灌注，或将结直肠癌细胞经直肠内注射至非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，建立患者来源的原位异种移植模型，以在淋巴结基质细胞影响下实现原发肿瘤生长及自发性转移，从而模拟人类转移性疾病的进展过程。...

源自患者的膀胱上皮细胞癌和结直肠癌原位异种移植模型用于肿瘤生长及自发性转移研究

本文描述了一种利用患者来源的异种移植瘤（PDX）建立类器官的方法，用于体外筛选，从而获得匹配的体内/体外模型对。将PDX肿瘤通过机械或酶消化方法处理成小块，随后采用Clevers方法培养肿瘤类器官，并对这些类器官进行传代、冻存，以及与原始PDX进行比对表征。...

创建匹配的PDX与PDX来源类器官体内/体外患者来源模型对用于癌症药理学研究

中枢神经系统转移瘤PDX模型能够代表人类转移瘤的表型和分子特征，是进行临床前研究的优秀模型。本文介绍了如何建立PDX模型以及适用于临床前研究的最佳接种途径。...

中枢神经系统转移患者来源异种移植模型的建立与应用

本方案建立并表征了间变性甲状腺癌（ATC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的患者来源异种移植（PDX）模型，因为PDX模型正迅速成为转化肿瘤学领域的标准模型。...

建立并表征间变性甲状腺癌和头颈部鳞状细胞癌的患者来源异种移植模型

本方案描述了将患者来源的癌细胞原位植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的操作。该模型可重现晚期结直肠癌的转移性疾病，能够在具有临床相关性的肺转移和肝转移场景中评估新型治疗药物。...

原位移植患者来源的癌细胞可模拟晚期结直肠癌

胃源性患者类器官在研究中的应用日益广泛，但目前尚缺乏从单细胞消化物出发、以标准化接种密度培养人胃类器官的正式方案。本方案提供了一种详细方法，可从上消化道内镜活检组织中稳定地构建胃类器官。...

建立和表征源自良性胃体与胃窦上皮活检组织的患者来源胃类器官

以下实验方案重点介绍建立患者来源的软组织肉瘤（STS）原代培养的方法。该模型有助于我们更深入地理解这些罕见恶性肿瘤的分子基础和药物反应特征，并可为后续改善STS治疗策略的研究提供起点。...

建立患者来源软组织肉瘤的原代培养

学习建立胃癌患者衍生异种移植模型和原代细胞系的方法，使用NSG免疫缺陷小鼠进行肿瘤移植实验。该技术可保留肿瘤组织学特征和异质性，为抗癌药物开发和个性化医疗研究提供可靠的临床前评估平台。

建立胃癌患者来源的异种移植模型和原代细胞系

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