Name: 调整降解以实现特定和高效的蛋白质消耗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 学习使用β-雌二醇和生长素在酿酒酵母中快速特异性地消耗目标蛋白质的方法。该方案可在不影响细胞活性的前提下研究必需蛋白质的功能，为细胞生物学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Jane Reid 发起本项目，Barbara Terlouw 对项目的推进，Vahid Aslanzadeh 提供“ura looper”载体构建，以及 Susana de Lucas 的诸多有益讨论。本研究得到了墨西哥国家科学技术理事会（CONACYT）和爱丁堡大学生物科学学院为 GIMO 提供的奖学金、IEM 获得的惠康基金会博士生奖学金 [105256]，以及 JD Beggs 获得的惠康基金会资助 [104648] 的支持。惠康细胞生物学中心的工作由惠康基金会核心资助 [092076] 支持。

注意：图形摘要请参见图2。
1. 菌株制备
<ol>
	<li>使用一个&#160;ura3-菌株中引入β-雌二醇AID系统（即编码β-雌二醇响应型转录因子（ATF）和osTIR的基因），并对目标蛋白进行AID*标记（参见 图3 以及表1以获取该操作流程的概要。
	<ol>
		<li>转化15 pZTRK（G418抗性标记）或pZTRLLEU2&#160;标记物）质粒（可从酵母基因资源中心获取）转入 ura3- 酵母菌株，或使用该质粒作为模板扩增PCR产物用于基因组整合。</li>
		<li>使用高保真DNA聚合酶，从质粒pZTRK或pZTRL中扩增ATF（质粒图谱中标记为Z4EVATF）和osTIR。引物设计需包含50至60个碱基的3’端延伸序列，该延伸序列应与基因组靶区域具有同源性，以介导同源重组实现定点整合16. 若要将这两个组分单独或共同整合到基因组中，请参见 表1 引物和反应条件。 
		注意： 菌株 pZ4EV-NTR1 的组分已整合至基因组中（可从日本酵母遗传资源中心获取）。</li>
		<li>确保使用Longtine方法对目标蛋白进行AID*标记17 （参见 图3b 和 表1).</li>
		<li>在无β-雌二醇和IAA存在的条件下，对该菌株进行生长分析，以确定AID*标签是否影响其生长，并预测生长速率，用于步骤1.5。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 耗竭的一般操作步骤
<ol>
	<li>计算所有样品采集所需的培养物体积；例如，对于单个样品，OD600 为 0.8 的 10 mL 培养液足以用于蛋白质、RNA 和 DNA 的提取，因此对于 6 个样品，至少需要 60 mL 培养液。</li>
	<li>从过夜培养物中，以 OD600 0.1 至 0.2 接种足够量的新鲜培养液，并在 30 °C 下继续培养。推荐使用 YPDA 等丰富培养基，但也可使用其他生长条件：
	<table>
		<tbody>
			<tr>
				<td>酵母提取物</td>
				<td>10 g</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>蛋白胨</td>
				<td>20 g</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>葡萄糖</td>
				<td>20 g</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>硫酸腺嘌呤</td>
				<td>40 mg</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>H2O 定容至</td>
				<td>1 L</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 
	注意：需进行高压灭菌或过滤除菌；推荐使用过滤除菌，因为高压灭菌产生的肽-糖复合物会在样品收集所用的甲醇中发生沉淀。</li>
	<li>准备接收样品。
	<ol>
		<li>将预期样品体积 30% 至 50% 的甲醇加入离心管中。例如，若采集 10 mL 样品，则在 15 mL 离心管中加入 5 mL 甲醇，并拧紧管盖。密封后标记管子，并置于干冰或 -80 °C 环境中预冷。 
		注意：应在通风橱中分装甲醇。</li>
		<li>标记用于样品长期保存的 1.5 mL 离心管，并置于冰上预冷。</li>
		<li>将足量 H2O（每份样品至少 1 mL）置于冰上预冷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预测培养物的生长情况。采集样品的目标 OD 值约为 0.7 至 0.8，但预孵育步骤（即加入 β-雌二醇以诱导 osTIR 系统）需提前开始，以确保在采集样品时培养物达到合适的 OD 值。 
	注意：建议在实验所用条件下进行生长曲线测定，以便估算该起始 OD 值。</li>
	<li>当培养物达到预孵育起始目标 OD 值时，取一份样品（通常为 10 mL），加入预先准备好的含冷甲醇的离心管中。短暂颠倒混匀后，立即放回干冰中。 
	注意：若操作方便，约 5 分钟后可将样品转移至冰水混合物中。</li>
	<li>立即向培养液中加入 β-雌二醇，终浓度为 1 µL/mL（最终浓度为 10 µM）；建议预先量取所需 β-雌二醇并用移液器准备好，以缩短样品采集与添加 β-雌二醇之间的时间间隔。通过剧烈涡旋迅速混匀。</li>
	<li>继续按步骤 2.2 的条件培养，加入 β-雌二醇孵育（即“预孵育”步骤），孵育时间应为最佳时长（最佳预孵育时间的确定参见 图 1）。</li>
	<li>准备添加 IAA（生长素）。量取步骤 2.10 所需的 IAA 体积（即每 mL 培养液加 0.5 µL IAA），以便加快步骤 2.20 的操作。</li>
	<li>按照步骤 2.5 的方法采集一份样品。</li>
	<li>立即按步骤 2.8 的准备，向培养液中加入 IAA 至终浓度 0.5 µL/mL（最终浓度为 750 µM）。通过剧烈涡旋迅速混匀。</li>
	<li>根据实验设计，按照步骤 2.5 的方法采集样品。可采集单个样品（在预期目标蛋白已稳定耗尽的时间点），或进行时间梯度采样以观察蛋白耗尽过程。例如，每隔 5 分钟采样一次便于计时，并可获得一系列蛋白水平变化数据。图 1 所示的优化策略可提示合适的时间点。</li>
	<li>处理样品。
	<ol>
		<li>若尚未进行，将样品置于冰上。确保样品未冻结；若已冻结，用手轻轻温热并持续颠倒，防止局部温度升高。 
		注意：建议用手操作，以便感知样品温度，应始终感觉冰凉。随后放回冰上。此步骤不可暂停——一旦所有样品恢复液态，应立即进行下一步。</li>
		<li>所有样品采集完毕且完全解冻后，在 4 °C 条件下以 3,500 x g 离心 2 分钟。</li>
		<li>倾去甲醇/培养基混合液，将管子放回冰上；不必完全去除所有液体。</li>
		<li>用 1 mL 冰冷 H2O（来自步骤 2.3.3）重悬细胞沉淀，并转移至已标记的 1.5 mL 离心管（步骤 2.3.2 中准备）中，置于冰上。</li>
		<li>短暂离心（例如总时间 10 秒）于 &#62;15,000 x g 以重新沉淀细胞，放回冰上后弃去上清液。</li>
		<li>用抽吸法去除 H2O。细胞沉淀可在 -20 °C 或 -80 °C 长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 Western blot 分析检测目标蛋白的耗尽程度18。 
	注意：通常从单个细胞沉淀中可提取足够量的蛋白质19 和/或核酸用于大多数实验目的，但若检测稀有 RNA 物种，可能需要更大的样品量。</li>
</ol>

<ol><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anchor-Away+Technique%3A+Rapid%2C+Conditional+Establishment+of+Yeast+Mutant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Anchor-Away Technique: Rapid, Conditional Establishment of Yeast Mutant Phenotypes.</a> Molecular Cell. 31, 925-932 (2008).</li>
<li>Bellí, G., Garí, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activator%2Frepressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic Acids Research. 26, 942-947 (1998).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+Domain+E3+Ubiquitin+Ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RING Domain E3 Ubiquitin Ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li>
<li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+auxin+perception+by+the+TIR1+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase.</a> Nature. 446, 640-645 (2007).</li>
<li>Teale, W. D., Paponov, I. A., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+in+action%3A+signalling%2C+transport+and+the+control+of+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 847-859 (2006).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nature Methods. 6, 917-922 (2009).</li>
<li>Morawska, M., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+tool+kit+for+the+auxin-inducible+degron+system+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">An expanded tool kit for the auxin-inducible degron system in budding yeast.</a> Yeast. 30, 341-351 (2013).</li>
<li>Kubota, T., Nishimura, K., Kanemaki, M. T., Donaldson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Elg1+Replication+Factor+C-like+Complex+Functions+in+PCNA+Unloading+during+DNA+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Elg1 Replication Factor C-like Complex Functions in PCNA Unloading during DNA Replication.</a> Molecular Cell. 50, 273-280 (2013).</li>
<li>Brosh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+molecular+analogue+tuner+for+dissecting+protein+function+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A dual molecular analogue tuner for dissecting protein function in mammalian cells.</a> Nature Communications. 7, 11742(2016).</li>
<li>DeRisi, J. L., Iyer, V. R., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+metabolic+and+genetic+control+of+gene+expression+on+a+genomic+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.</a> Science. 278, 680-686 (1997).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding.</a> Yeast. , (2018).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 41, e57(2013).</li>
<li>Prusty, R., Grisafi, P., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+hormone+indoleacetic+acid+induces+invasive+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The plant hormone indoleacetic acid induces invasive growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> PNAS. 101, 4153-4157 (2004).</li>
<li>Geitz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiest, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Research. 20, 1425(1992).</li>
<li>Widlund, P. O., Davis, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+method+to+replace+essential+genes+with+mutant+alleles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency method to replace essential genes with mutant alleles in yeast.</a> Yeast. 22, 769-774 (2005).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14, 953-961 (1998).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , e52099(2014).</li>
<li>Volland, C., Urban-Grimal, D., Géraud, G., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+degradation+of+the+yeast+uracil+permease+under+adverse+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and degradation of the yeast uracil permease under adverse conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 9833-9841 (1994).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

经过良好优化的实验方案可实现目标蛋白的快速高效去除。确定与β-雌二醇预孵育的合适时间非常重要，因为这有助于提高蛋白去除的可重复性，但预孵育时间的微小差异通常可以耐受。另一方面，在添加生长素后的操作时间必须严格控制，因为蛋白水平会迅速下降。
该方法的一个优势在于，通过调整β-雌二醇预孵育时间和IAA孵育时间的组合，可实现精确调控的蛋白耗竭。例如，若需要，可通过缩短预孵育时间来更缓慢地耗竭目标蛋白。
与组成型表达OsTIR的系统相比，β-est AID系统具有一些优势。例如，如果目标蛋白对细胞存活至关重要，则通过调控osTIR的表达可避免目标蛋白的过早耗竭。此外，osTIR的表达水平可依据目标蛋白的丰度及其对降解的敏感性进行调节，从而实现快速或缓慢的蛋白耗竭。两种小分子效应物β-雌二醇和生长素在本实验所用条件下不会干扰酵母的代谢，而锚定移除系统中使用的雷帕霉素则会产生干扰1。
需要注意的是，对某些蛋白质进行标记会破坏其功能，这是所有靶向降解系统都可能面临的问题。在这种情况下，N端标记可能有效，而C端标记则可能无效。此外，并非所有蛋白质都能被高效降解；例如，目标蛋白上的AID标签可能无法被osTIR蛋白接触。因此，在完成AID标记后，应对每个目标蛋白进行检测，评估标记对其生长是否产生影响，并确认降解是否有效，然后再优化β-雌二醇预孵育和生长素处理的时间条件。
该AID*系统非常简单，且与任何不涉及进一步生长的后续实验步骤兼容，例如蛋白质、DNA或RNA分析或显微镜检测。此外，该系统与硫醇标记结合用于纯化新生RNA时效果良好20。
该系统提供了一种快速、特异且可重复的蛋白质耗竭方法，且不会影响酵母细胞的其他代谢过程。

条件性突变（如温度敏感型突变体）是研究必需蛋白的有力工具，可在允许条件下支持细胞生长，而在非允许条件下导致蛋白功能丧失。然而，诱导缺陷所需的培养条件改变可能严重干扰细胞代谢，并可能产生脱靶效应。目前已开发出多种方法，通过添加小分子来条件性地隔离目标蛋白1，或调控其表达2,3。本实验方案利用生长素及其诱导型降解决定子（auxin-inducible degron, AID）系统，高效耗竭目标蛋白。
AID 系统起源于植物，在植物中，生长素（本实验方案中使用的是吲哚-3-乙酸（IAA））可促进 Aux/IAA 蛋白与 TIR1（SCF U3 泛素连接酶复合物的一个组分）之间的相互作用4。SCF 复合物的相互作用导致 Aux/IAA 家族蛋白发生多聚泛素化，从而使其被蛋白酶体降解5,6。
该系统先前已针对酵母Saccharomyces cerevisiae7,8进行了改造，通过在酵母细胞中表达来自Oriza sativa的TIR1蛋白（osTIR），使其能够与内源性酵母SCF复合物相互作用。目的蛋白被标记上来自Aux/IAA蛋白IAA17的一个基序，以靶向其降解。随后开发出IAA17的功能性截短版本，例如AID*8,9,10，其中包含来自Arabidopsis thaliana IAA17的43个氨基酸组成的生长素敏感基序，并带有一个表位标签以便检测。
最初为芽殖酵母改造的系统7,8利用酵母GAL启动子表达osTIR1蛋白。该表达需要将细胞转移至以半乳糖为唯一碳源的培养基中，但不幸的是，这会引起双相生长现象，导致细胞代谢发生广泛变化11。另一方面，已有报道指出，若TIR1组成型表达水平较高，则即使在缺乏生长素/IAA的情况下也可能导致目标蛋白降解12；而TIR1表达水平过低又会导致目标蛋白耗竭效率低下。为此，研究人员开发了一种改进的AID系统，称为β-est AID，其中osTIR受一个可诱导且可调节的启动子控制，可根据目标蛋白的特性进行优化，同时对细胞代谢的影响最小。为实现这一目标，构建了一种人工转录因子（ATF），其将病毒转录激活因子VP16与雌激素受体以及四联锌指DNA结合结构域（DBD）融合在一起。当存在β-雌二醇（一种雌激素）时，该ATF可进入细胞核，并通过结合其启动子（Z4EVpr）来诱导osTIR的转录13,12。
加入β-雌二醇后约20分钟通常可检测到osTIR的表达12。然而，为实现用生长素高效耗竭标记蛋白，同时避免在添加生长素前发生耗竭，osTIR表达的最佳持续时间需针对每种目标蛋白通过实验确定。该预孵育时间的大致范围可根据《酿酒酵母基因组数据库》（SGD https://www.yeastgenome.org/）中的丰度数据进行估算。如图1所示，丰度较高的蛋白Dcp1（每细胞2880至4189个分子）需要40分钟的β-雌二醇预孵育，且未观察到无生长素依赖性的耗竭。而丰度低得多的蛋白Prp2（每细胞172至211个分子）在仅20分钟预孵育后即出现显著耗竭。建议在初始估计时间前后再测试两个额外的预孵育时间点，即比估计时间提前或延后10至20分钟（推荐最短预孵育时间为20分钟）。最佳预孵育时间应满足：在添加生长素前目标蛋白未发生耗竭，而在添加生长素后耗竭程度可接受，或蛋白水平接近可能的最低值。因此，从图1b可见，Prp22在30分钟预孵育后，添加生长素10分钟时蛋白水平尚未明显下降；相比之下，40分钟预孵育并加入IAA 15分钟后未见进一步明显耗竭，说明延长生长素处理时间超过10分钟或预孵育时间超过30分钟并无益处，尤其在40分钟时已有非生长素依赖性耗竭的迹象。对于Dcp1，在40分钟预孵育（此为添加生长素前蛋白水平仍近似为100%的最后一个时间点）条件下，用生长素耗竭15至20分钟是可接受的。建议尽可能缩短耗竭时间，以减少对细胞代谢的继发性影响14。
本文演示了如何通过优化β-雌二醇孵育时间以实现osTIR表达，从而在添加IAA后快速耗竭目标蛋白，同时在添加生长素之前不引起目标蛋白的耗竭，进而使用β-雌二醇诱导的AID系统。

<table><tbody><tr><td>硫酸腺嘌呤</td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Beta;-雌二醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2758-1G</td><td>溶于乙醇的10 mM溶液。于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Alfa Aesar</td><td>42780</td><td>DMSO在4 &amp;deg;C下应呈固态</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>IAA 1H-吲哚-3-乙酸</td><td>Across Orgainics</td><td>122150100</td><td>生长素类似物。溶于DMSO的1.5 M溶液。溶液呈红褐色，并随时间推移逐渐变深；若变为深红色则应弃用，并配制新溶液。于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>注意：有毒且易燃</td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;高保真DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Formedium</td><td>PEP03</td><td></td></tr><tr><td>SCSM单缺组分培养基 &amp;ndash;ura</td><td>Formedium</td><td>DSCS101</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td></td></tr><tr><td>不含氨基酸但含硫酸铵的酵母氮源基础培养基</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr></tbody></table>

调节降解以实现特异且高效的蛋白质耗竭

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

植物生长素结合受体 TIR1 在生长素存在的情况下可识别含有特定生长素诱导降解子（AID）基序的蛋白质，并使其靶向降解。该系统已被广泛应用于多种非植物真核生物中，使得带有 AID 标签的目标蛋白在添加生长素后被降解。TIR1 的表达水平至关重要：过量表达会导致即使在无生长素的情况下，AID 标签蛋白也被降解，而表达量过低则导致目标蛋白清除速度缓慢。为此，研究人员构建了由 β-雌二醇诱导的 AID 系统，其中 TIR1 的表达受 β-雌二醇诱导型启动子调控。通过在添加生长素前改变与 β-雌二醇共孵育的时间，可调节 TIR1 的表达水平。本实验方案描述了如何利用 AID 系统快速耗竭目标蛋白。合适的 β-雌二醇孵育时间取决于目标蛋白的丰度。因此，高效的蛋白耗竭依赖于最佳的时间控制，同时最大限度地减少无生长素依赖性的降解。

蛋白耗尽的代表性示例如图1所示。本图中展示的三个实验分别为Prp2、Prp22和Dcp1蛋白耗尽条件的优化实验。低丰度的剪接体蛋白Prp2和Prp22在与β-雌二醇预孵育40分钟后，再加入auxin处理15分钟，其蛋白水平均降低至不足20%。更长的预孵育时间可加快耗尽速度，但也会导致在加入auxin前出现不期望的蛋白耗尽。相比之下，丰度较高的Dcp1蛋白在相同处理条件下仅耗尽至约30%；但若预孵育60分钟，则在相同的auxin处理下可耗尽至13%，代价是在加入auxin前已发生一定程度的蛋白耗尽。因此，采用β-雌二醇预孵育50分钟并辅以15分钟auxin处理，可能在更短的时间内达到类似效果，因而更为优化。
<img alt="蛋白质降解分析；Prp22-AID*-6FLAG、Prp2-AID*-6FLAG、Dcp1-AID*-6HA；凝胶条带、图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：通过调节β-雌二醇预孵育时间可调控目标蛋白的降解速率。目标蛋白的蛋白质印迹分析18结果：(a 和 b) Prp22-AID*-6FLAG，(c 和 d) Prp2-AID*-6FLAG，以及(e 和 f) Dcp1-AID*-6HA，样品来自在添加生长素前分别用β-雌二醇（β-est）预孵育20、30、40或60分钟的培养物12。每条泳道上样的总蛋白量相等。Pgk1作为上样对照进行检测，但在图e中，Pgk1与Dcp1迁移位置重叠。图a、c和e中蛋白条带的定量结果分别显示于图b、d和f。为衡量降解速率，计算了各曲线线性阶段（从初始值100%降至30%）的斜率（m）。最佳预孵育时间是指在此时蛋白水平仍接近未诱导状态（100%），且后续降解速率较快的时间点。对于Dcp1（f），60分钟预孵育过长，因蛋白在未加生长素时已开始降解；而20分钟则过短，因在此时间段内蛋白未发生明显降解。经40分钟预孵育后，加入生长素15分钟即可使蛋白降解约70%，尽管延长至20分钟可导致进一步降解，但也可能引发继发性效应。误差棒表示两次生物学重复实验的标准差。每个实验仅展示一张代表性印迹图。本图改编自先前发表的研究9。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质表达与纯化示意图；β-雌二醇，IAA 诱导；样品制备；-80°C 保存。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：图示摘要。 在适宜温度下，向处于丰富培养基中生长至适当密度的培养物中加入 β-雌二醇，以启动预孵育。在加入 IAA（生长素）启动蛋白耗尽前，继续培养所需的预孵育时间。预孵育和耗尽时间取决于目标蛋白，但预孵育通常为 20–60 分钟，耗尽时间通常为 10 至 20 分钟。应在预孵育开始和结束时以及耗尽过程中采集 10 mL 样品。这些样品需迅速用冷甲醇固定，离心后保存。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig02v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达分析和蛋白质靶向的质粒图谱与遗传构建示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：B-est 系统的菌株构建。（a）为构建含有 AID* 系统的酵母菌株，可将 pZTRL（LEU2）或 pZTRK（卡那霉素（G418）抗性）质粒导入菌株中；或者，也可通过 PCR 扩增生成的 DNA 片段，利用同源重组将 ATF 和 osTIR 插入基因组（见 图 3b 和 Table 1）。 （b）目标蛋白的C端标签化通过PCR扩增质粒pURA3-AID*-6FLAG的相应区域实现（pURA3_AID*-6HA仅在标签上不同，操作方法完全相同），使用Longtine引物S3-F和S2-R，其3’端延伸序列与目标蛋白3’端同源。正向引物的延伸部分应包含最后一个氨基酸密码子，并与AID*标签的起始端保持阅读框一致，但不得包含终止密码子；反向引物的延伸部分应位于编码区下游的区域。一旦插入基因组后，可通过在含5-FOA的培养基中培养，筛选出因两端同源区域发生同源重组而丢失URA3标记的细胞，从而实现对URA3阳性细胞的反向筛选。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="8">a. 引物序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶标</td>
			<td>位置</td>
			<td>引物</td>
			<td>名称</td>
			<td colspan="3">序列</td>
			<td>Tm (°C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">pZTRL</td>
			<td>516</td>
			<td>F</td>
			<td>pZTRL_F</td>
			<td colspan="3">&lt;-同源区域-&gt;GCGACAGCATCACCGACTTCG</td>
			<td>61.23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7897</td>
			<td>R</td>
			<td>pZTR_R</td>
			<td colspan="3">CGCCGCCTCTACCTTGCAGA&lt;-同源区域 (RC)-&gt;</td>
			<td>61.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">pZTRK</td>
			<td>9154</td>
			<td>F</td>
			<td>pZTRK_F</td>
			<td colspan="3">&lt;-同源区域-&gt;ACGTTGAGCCATTAGTATCAATTTGCTTACC</td>
			<td>59.40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5897</td>
			<td>R</td>
			<td>pZTR_R</td>
			<td colspan="3">CGCCGCCTCTACCTTGCAGA&lt;-同源区域 (RC)-&gt;</td>
			<td>61.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="2">pURA3-AID*-6FLAG 或 pURA3_AID*-6HA</td>
			<td>F</td>
			<td>S3-F</td>
			<td colspan="3">&lt;-同源区域-&gt;CGTACGCTGCAGGTCGAC</td>
			<td>59.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>S2-R</td>
			<td colspan="3">ATCGATGAATTCGAGCTCG&lt;-同源区域 (RC)-&gt;</td>
			<td>52.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">pZRTL/K 用于扩增 β-雌二醇诱导型 AID 系统</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">pURA3-AID*-6FLAG/6HA 用于扩增 AID* 和表位标签，以标记目标蛋白（Lontine 方法）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&lt;-同源区域-&gt;</td>
			<td colspan="5">与系统插入位点侧翼区域同源的序列。该区域越长，修饰成功的可能性越高；建议长度为 50–100 个碱基。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">&lt;-同源区域 (RC)-&gt;</td>
			<td colspan="5">与系统插入位点侧翼区域同源的序列，需使用其反向互补序列。同上，该区域越长效果越好。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Tm (°C)</td>
			<td colspan="5">采用 %GC 法计算 Tm，假设 NaCl 浓度为 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">b. PCR 反应体系</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">组分</td>
			<td colspan="4">体积 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">模板</td>
			<td colspan="4">&lt;10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NEB Phusion HF Buffer (5x)*</td>
			<td colspan="4">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">正向引物 100 µM</td>
			<td colspan="4">2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">反向引物 100 µM</td>
			<td colspan="4">2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">dNTPs 各 10 mM</td>
			<td colspan="4">10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">H2O</td>
			<td colspan="4">补足至 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">* 也可使用 NEB Phusion GC Buffer (5x)，但不推荐</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">配制上述混合液，分装为 10 个 50 µL 的反应体系，并按照表 1 c 所示条件进行 PCR 扩增</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">将所有成功的扩增产物合并至一个离心管中，并进行乙醇沉淀</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">将 PCR 扩增所得全部产物转化至酵母中</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">c. PCR 反应条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">步骤</td>
			<td>温度 (°C)</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">初始变性</td>
			<td>98</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" rowspan="3">25–35 个循环</td>
			<td colspan="3">变性</td>
			<td>98</td>
			<td>10 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">退火</td>
			<td>45–60</td>
			<td>20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">延伸</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s/kb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">最终延伸</td>
			<td>72</td>
			<td>10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">保存</td>
			<td>8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">Lontine 引物组（S3-F 和 S2-R）退火温度为 45 °C，pZTRL/K 引物退火温度为 60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">Lontine PCR 延伸时间为 3 分钟，pZTRL/K PCR 延伸时间也为 3 分钟</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：引物序列、PCR反应体系及PCR反应条件。

本文介绍了一种利用β-雌二醇诱导的AID系统，在酵母Saccharomyces cerevisiae中高效且特异性地降解目标蛋白的实验方案。

植物生长素结合受体 TIR1 在生长素存在的情况下识别含有特定生长素诱导降解决定子（AID）基序的蛋白质，从而靶向……

确定蛋白质功能的常用技术是将其删除，然后观察会发生什么。但对于必需蛋白，这种方法行不通。因为它是必需的，一旦缺失，细胞就会死亡。因此，你需要一种方法来去除该蛋白质，并观察细胞死亡发生前的瞬间变化。蛋白质的去除应当迅速，以避免产生次要效应；同时还应具有特异性，确保只有目标蛋白质被去除，并且仅在你需要的时候才被清除。并且除了去除该蛋白外，不应以任何其他方式影响细胞。菌株构建完成后，利用过夜培养物确定所需的稀释倍数。根据此信息，接种足够量的新培养物，使初始OD600在0.1至0.2之间，并在30摄氏度下培养。在通风橱中，向一个15毫升离心管中加入相当于目标样品体积30%至50%的甲醇。将离心管盖紧，做好标记，并置于干冰上冷却。接着，标记用于样品长期保存的1.5毫升离心管，并将其放在冰上预冷。每个样品至少准备一毫升冰上预冷的水。当达到预孵育起始目标光密度时，将样品转移至预先准备好的含有冷甲醇的离心管中。轻轻颠倒混匀管后，立即将其放回干冰中。这是未诱导的对照样品。立即加入β-雌二醇，使其终浓度为10 µM。剧烈振荡混匀。继续按照之前的方法培养细胞，在文本方案中所述的最佳时间内用β-雌二醇孵育。β-雌二醇孵育时间是最关键的步骤，必须针对每种蛋白质进行优化。孵育时间过短会导致耗竭不完全且速度缓慢。时间过长，蛋白质水平甚至在添加生长素之前就会下降。每毫升培养物中加入0.5微升IAA，稍后添加。按照之前所述方法，从未耗尽的培养物中收集样品。立即加入IAA至终浓度为750微摩尔，并剧烈涡旋混匀。混匀后尽快启动计时器。根据实验设计采集样品。然后将样品置于冰上。确保所有样品均未冻结。若有样品发生冻结，需将其在手中轻轻温热，同时持续倒置。所有样品收集完毕后，立即在 3,500 × g、4 °C 条件下离心 2 分钟，切勿冷冻。弃去甲醇与培养基混合液，将样品重新置于冰上。随后，用 1 mL 水重悬细胞沉淀，并将此悬液转移至冰上预冷的标记试管中。以超过15,000 ×g的转速短暂离心，重新沉淀细胞。随后将离心管放回冰上，并吸除上清液。在本研究中，通过调节降解过程，实现对目标蛋白的特异性高效去除，同时不干扰酵母细胞的正常代谢。低丰度的剪接体蛋白 Prp2 和 Prp22 在与 β-雌二醇预孵育 20 分钟后，再加入生长素处理 15 分钟，其含量均减少至不足 20%。更长的预孵育时间虽可加快蛋白耗竭速度，但也会导致在加入生长素前出现不期望的蛋白减少。相比之下，丰度较高的 Dcp1 在相同处理条件下仅减少至约 30%。然而，相同的生长素处理下，60分钟的预孵育时间会导致目标蛋白在添加生长素前即耗竭至初始水平的13%。请优化预孵育时间，并准确记录各时间点之间的间隔。后续操作取决于您的具体研究问题。我们发现，10 mils的培养物样本已足够用于蛋白质、DNA或RNA分析。该取样步骤也易于适用于染色质免疫沉淀（ChIP）。目前已有快速且特异性的方法用于耗竭蛋白质。因此，即使是必需蛋白的功能也能被发现。该方案相对安全，甲醇是唯一的危险化学品。分装时需小心操作，应在通风橱中进行，并佩戴两副手套，因为甲醇可穿透大多数丁腈手套。

tuning-degradation-to-achieve-specific-and-efficient-protein-depletion

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

调整降解以实现特定和高效的蛋白质消耗

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。...

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

本文介绍了一种用于定量泛素-蛋白酶体系统中蛋白水解相对速率的可靠生物学检测方法。该检测的读出指标为酵母在液体培养中的生长速率，其依赖于报告蛋白的细胞内水平，该报告蛋白由一个降解信号与必需的代谢标记物融合而成。...

基于报告基因的生长分析法用于系统性研究蛋白质降解

蛋白质丰度反映了蛋白质合成与蛋白质降解的速率。本文介绍了在模式单细胞真核生物酿酒酵母（Saccharomyces...

蛋白质降解的放线菌酮追踪分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文描述了一种针对微生物培养基进行定制化设计的通用方法。该方法通过结合基于克里金法（Kriging）的实验设计与微生物反应器技术，实现足够的培养通量，并借助实验室自动化机器人技术提高液体处理和培养基制备的可靠性与速度，从而实现迭代式工作流程。...

利用自动化微型生物反应器技术优化异源蛋白生产的通用方案

针对目标蛋白的多种内源性翻译后修饰进行研究可能极具挑战性。本文所述技术采用优化的裂解缓冲液和滤膜系统，并结合特异性靶向特定翻译后修饰的亲和基质，利用单一、简化的系统即可检测目标蛋白的乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化修饰。...

利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。...

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

本方案描述了利用CRISPR/Cas9技术改造的活细胞中目标蛋白降解动力学的定量发光检测方法，这些细胞表达经基因编辑后融合于目标蛋白的无抗体依赖性内源蛋白检测标签。文中包含计算和获取定量降解参数的详细步骤，包括降解速率、Dmax、DC50 和...

利用HiBiT CRISPR细胞系进行靶向蛋白降解化合物的高通量细胞谱型分析

多列柱适配器可将层析柱与多孔收集板连接，用于并行亲和或离子交换纯化，提供一种经济高效的高通量蛋白质纯化方法。该方法可在重力或真空条件下使用，通过价格适中的仪器即可获得毫克级蛋白质。...

一种使用多柱板适配器的经济且通用的高通量蛋白质纯化系统

本方案描述了如何利用表达突变型L274G-甲硫氨酰tRNA合成酶（MetRS*）的小鼠品系，通过叠氮诺亮氨酸（ANL）对特定细胞类型的蛋白质进行标记，并详细说明了分离标记蛋白质所需的步骤。我们概述了在活体小鼠中使用ANL的两种给药途径：（1）饮水给药和（2）腹腔注射。...

利用突变型甲硫氨酸tRNA合成酶小鼠品系从复杂组织中进行细胞类型特异性蛋白质纯化与鉴定

利什曼原虫翻译提取物（LTE）是一种源自单细胞寄生虫Leishmania...

LTE的制备与优化 Leishmania tarentolae 衍生的无细胞蛋白表达系统用于重组蛋白生产

学习使用β-雌二醇和生长素在酿酒酵母中快速特异性地消耗目标蛋白质的方法。该方案可在不影响细胞活性的前提下研究必需蛋白质的功能，为细胞生物学研究提供可靠工具。

调节降解以实现特异且高效的蛋白质耗竭

探索更多视频