Name: 通过电生理场记录研究跨体海马CA1的长期突触可塑性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: 学习利用电生理场记录技术研究跨体海马CA1区域的长期突触可塑性。本方法结合纵向脑片制备与在体记录，帮助研究者深入理解学习与记忆的神经机制。

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本工作由仁川国立大学（国际协作）研究基金资助。我们感谢Gona Choi女士在部分数据收集工作中提供的协助。

所有动物均按照美国国立卫生研究院动物护理和使用实验室的指南和规定进行处理。本文所述所有方法均已获得香港城市大学和仁川国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 体内现场记录
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>腹腔注射乌拉坦（每25 g体重注射0.06 g）以麻醉小鼠，同时肌肉注射阿托品（0.05 mg/kg）作为补充。将小鼠置于黑暗安静处，直至完全麻醉生效。 
		警告：乌拉坦具有潜在致癌性。操作时需谨慎，穿戴防护服以避免皮肤暴露接触。 
		注：也可使用异氟烷作为麻醉剂。</li>
		<li>间歇检查麻醉深度，直至达到完全外科麻醉平面。通过脚趾夹捏、耳夹、尾夹及角膜触碰测试，观察小鼠对物理刺激的反应以评估麻醉深度。 
		注：当小鼠处于完全外科麻醉状态时，不应观察到反射性或自主性运动。</li>
		<li>进行脚趾夹捏测试时，伸展小鼠的后肢或前肢，用钝头镊子或手指用力夹捏。若小鼠出现肢体回缩、身体抖动、呼吸频率明显增加或发出声音，则表明尚未达到完全麻醉状态。</li>
		<li>进行耳夹测试时，用钝头镊子或手指用力夹捏耳廓末端。若小鼠出现胡须前伸、头部晃动、发声或呼吸频率明显增加，则表明尚未达到完全麻醉状态。</li>
		<li>进行尾夹测试时，轻柔固定小鼠尾巴，并用钝头镊子或手指用力夹捏。在完全麻醉状态下进行手术操作时，不应观察到尾巴移动、发声或呼吸频率明显增加。</li>
		<li>进行角膜触碰测试时，用棉签轻轻触碰小鼠角膜。在完全麻醉状态下进行手术时，不应观察到眼睑运动、胡须运动或呼吸频率明显增加。</li>
		<li>剃除小鼠颈部和颅骨上的毛发。</li>
		<li>将完全麻醉的小鼠置于设定为37 °C的加热垫上，并将直肠温度探头插入直肠。这可使加热垫产生的热量根据小鼠体温变化进行调节。</li>
		<li>涂抹眼用凝胶以保持小鼠眼睛湿润。</li>
		<li>用镊子轻柔地将舌头拉至唇侧，并将两颗门齿固定于立体定位仪的第二或第三齿孔中。使用眼夹牢固固定小鼠颅骨。 
		注：也可使用立体定位耳夹。</li>
		<li>在显微镜下观察，用手术刀分离小鼠顶间骨与枕骨末端的皮下组织和肌肉，暴露延髓池。用棉签将硬脑膜擦干。</li>
		<li>用尖锐的手术刀片在延髓池处做浅切口，轻柔穿刺以引流脑脊液（CSF）。附着棉签持续引流脑脊液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开颅手术
	<ol>
		<li>用镊子夹住头皮皮肤，使用手术剪剪开并移除皮肤。剪除足够面积的皮肤以暴露颅骨上的前囟（bregma）和后囟（lambda）标记。保持暴露区域干燥。</li>
		<li>调整已固定的颅骨位置，使前囟和后囟点处于相同高度的水平线上。避免头部在前后方向或中侧方向发生倾斜。</li>
		<li>借助游标卡尺标记海马区对应的位置。参考小鼠脑立体定位坐标图谱，确定精确坐标。 
		注：标记海马切口位置时，以bregma为参考点，沿中线方向前后（AP）定位为1 mm × 3 mm，垂直于中线方向（ML）定位为3 mm × 3 mm。立体定位坐标表示为（AP: 1,3 和 ML: 3,3）。</li>
		<li>在显微镜下观察，使用手术刀或高速钻头沿标记点在海马背侧区域颅骨上做切口。 
		注：切口后应形成一个2 mm × 3 mm的矩形开口。保持暴露区域清洁，避免损伤脑组织。</li>
		<li>用镊子小心取出松动的颅骨碎片以暴露硬脑膜，并用注射器或滴管轻轻滴加生理盐水以保持表面湿润。</li>
		<li>用针头或尖头镊子小心去除硬脑膜。 
		注：开颅过程中需注意避免损伤脑组织，否则可能导致脑肿胀并影响实验结果。</li>
		<li>使用滴管或注射器滴加生理盐水或惰性油，保持暴露的脑组织湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在体记录
	<ol>
		<li>将刺激电极和记录电极牢固固定并定位在立体定位仪夹持器中。根据刺激电极和记录电极在背侧CA1海马区上方对应的前后（AP）和中侧（ML）坐标，调整立体定位仪位置。 
		注：参考小鼠脑立体定位坐标图谱，确定背侧纵向CA1海马区的坐标。例如，记录电极的立体定位坐标为（AP 1.5, ML 1.0），刺激电极为（AP 1.7, ML 1.5）。</li>
		<li>将刺激电极置于记录电极的外侧，沿纵向排列。 
		注：确保使用前刺激电极和记录电极均清洁，以防止记录时引入噪声。</li>
		<li>进行记录时使用多通道电极。首先使用第一通道定位CA1海马区的立体定位坐标，然后调整其余电极位置，使刺激电极与记录电极相对于bregma点的中线夹角保持在30°至60°之间。 
		注：该角度对应于CA1海马区的纵向取向。</li>
		<li>作为对照，将记录电极置于CA1区上方，刺激电极置于背侧海马CA3区上方。例如，参考小鼠脑立体定位坐标图谱，CA1-CA3海马区的立体定位坐标为记录电极（AP 1.8, ML 1.0），刺激电极（AP 1.5, ML 1.5）。 
		注：此步骤为替代性对照，应在单独实验中进行。</li>
		<li>将参考电极置于暴露脑区的远端部位或小鼠皮下。</li>
		<li>打开记录系统。</li>
		<li>启动记录与数据采集软件。 
		注：不同实验室可能使用各自偏好的记录与数据采集软件。</li>
		<li>在显微镜下观察，使用显微操作器缓慢降低记录电极和刺激电极，直至刚好接触脑表面。将该点标记为零点，用于计算到达海马区的准确深度。 
		注：可使用显微操作器实时监测电极插入深度。当电极接触脑表面时，应观察到阻抗的明显上升。</li>
		<li>缓慢将电极降至与所选CA1海马区立体定位坐标相对应的近似深度。 
		注：参考小鼠脑立体定位坐标图谱，确定与所选坐标对应的近似深度。</li>
		<li>给予刺激（持续时间100 μs，每30&#8201;s重复一次），并以50 μm或更小步长调整电极深度，直至观察到稳定的诱发电场兴奋性突触后电位（fEPSP）。 
		注：通常20 μA的刺激强度足以诱发可观察的反应。</li>
		<li>通过改变刺激强度确认已诱发出稳定的fEPSP。随着刺激强度增加，fEPSP的斜率或幅度应显著上升，此关系称为输入-输出曲线。绘制输入-输出（I-O）曲线，以确定诱发电fEPSP斜率不再增加时的最大刺激强度（图6）。 
		注：若实验过程中纤维放电波消失，应舍弃数据并更换电极位置。</li>
		<li>利用输入-输出曲线将基线刺激强度设定为最大强度的40–50%，并使用相应刺激强度进行基线记录。</li>
		<li>记录20–30分钟的局部场电位作为基线。</li>
		<li>使用相同的输入-输出曲线，将诱发高频刺激（HFS）或强直刺激的刺激强度设定为最大强度的75%。或者，在诱导长时程抑制（LTD）时，诱发低频刺激（LFS）时保持与基线记录相同的刺激强度。</li>
		<li>施加4次100 Hz脉冲，每次间隔10 s，以诱导长时程增强（LTP）。 
		注：仅在进行长时程增强实验时使用此方案。</li>
		<li>根据已建立的方案，施加5&#8201;Hz低频刺激（3&#8201;分钟内900次刺激）、1&#8201;Hz LFS（15&#8201;分钟内900次刺激）或1 Hz配对脉冲（配对脉冲间隔50&#8201;ms，15&#8201;分钟内900对刺激），以诱导长时程抑制（LTD）。 
		注：仅在进行长时程抑制实验时使用这些方案。</li>
		<li>在HFS或LFS后交替记录1小时的局部场电位。</li>
		<li>导出数据并使用软件进行分析。</li>
		<li>通过给予10 μA电流持续30 s的刺激以损毁记录区域，从而验证记录电极和刺激电极的位置。经心脏灌注4%多聚甲醛，取出脑组织进行切片，并按常规进行焦油紫（Cresyl Violet）染色。</li>
		<li>实验结束后，通过颈椎脱位或注射致死剂量麻醉剂处死小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外场电位记录
<ol>
	<li>制备含氧切片液和人工脑脊液（ACSF）
	<ol>
		<li>对于2 L切片液，先在容量瓶中加入约1 L双蒸水，并在搅拌板上剧烈搅拌。</li>
		<li>加入以下切片液成分（单位为 mM）：87.0 NaCl、2.5 KCl、1.3 NaH2PO4、25.0 NaHCO3、25.0 葡萄糖、75.0 蔗糖、7.0 MgCl2∙6H2O 和 0.5 CaCl2∙2H2O（表1）。 
		注意：也可在此阶段不加入MgCl2∙6H2O和CaCl2∙2H2O，待后续使用前再加入所需体积。</li>
		<li>在持续剧烈搅拌下，用双蒸水定容至2 L。</li>
		<li>对于2 L ACSF，先在容量瓶中加入约1 L双蒸水，并在搅拌板上剧烈搅拌。</li>
		<li>加入以下ACSF成分（单位为 mM）：125.0 NaCl、2.5 KCl、1.3 NaH2PO4、25.0 NaHCO3、25 葡萄糖、1.0 MgCl2∙6H2O 和 2.0 CaCl2∙2H2O（表1）。 
		注意：也可在此阶段不加入MgCl2∙6H2O和CaCl2∙2H2O，待后续使用前再加入所需体积。</li>
		<li>在持续剧烈搅拌下，用双蒸水定容至2 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>装置准备与脑组织切片
	<ol>
		<li>将400 mL已配制好的切片液倒入另一烧瓶中，并通入混合气体（95% O2/5% CO2）约20分钟进行氧合。</li>
		<li>将剩余的1.6 L溶液储存于4 °C冰箱中。溶液最多可保存一周，若未使用则必须丢弃，以防真菌生长。</li>
		<li>取200 mL已氧合的切片液倒入烧瓶中，用Parafilm封口后置于-80 °C冰箱中约20分钟，制成冰浆状（slush）。</li>
		<li>将剩余200 mL切片液倒入脑片保存室中，并置于32 °C水浴中持续通气。</li>
		<li>准备切片工作台。在台面上铺上纸巾，并将手术器械有序摆放，按使用顺序排列以提高操作效率（图7）。</li>
		<li>从冰箱中取出冷冻的切片液，向烧杯中倒入约50 mL。另取约10 mL加入含有滤纸的培养皿中以润湿滤纸。将烧杯和培养皿置于冰上，靠近解剖区域放置。</li>
		<li>将剩余的冰浆状切片液倒入切片室中，并将其固定在振动切片机上。</li>
		<li>使用异氟烷对小鼠进行麻醉，操作需遵循美国国立卫生研究院（National Institute of Health）关于实验动物护理与使用的指南和规定，以及香港城市大学和仁川国立大学机构动物使用与护理委员会（Institutional Animal Use and Care Committee）批准的方法。</li>
		<li>用剪刀将麻醉后的小鼠断头，将头部置于纸巾上。剪开覆盖颅骨的皮肤，并用剪刀剪开皮下肌肉。使用手术剪沿中线剪开颅骨至枕骨。</li>
		<li>用钝头镊子打开颅骨以暴露脑组织。用解剖铲轻轻取出脑组织，放入盛有冷切片液的烧杯中。静置约30秒。</li>
		<li>用勺子取出脑组织，小心地将其放置于先前润湿的培养皿中的滤纸上。</li>
		<li>使用刀片沿中线分离两个脑半球。用解剖铲轻轻将海马体从皮层剥离，并小心放置于湿润的滤纸上。使用刀片切除分离出的海马体的隔端和颞端。</li>
		<li>使用钝头解剖铲和刷子拾取分离出的海马体。轻轻在纸巾上轻拍解剖铲以去除多余水分。</li>
		<li>在振动切片机的切片板上涂抹少量胶水。</li>
		<li>对于纵向CA1海马切片，将海马体的CA3区域粘附于切片板上，迅速但小心地将其放入振动切片机的切片室中，切片室内应含有冷的、已氧合的切片液。</li>
		<li>对于作为对照的横向切片，将海马体的腹侧端粘附于振动切片机的切片板上。迅速但小心地将其放入含有冷的、已氧合的切片液的切片室中。 
		注意：此步骤为上述步骤的替代方案，应单独进行。</li>
		<li>将刀片角度设置为90°。设定振动切片机参数：切片速度为0.05 mm/s，振幅为1.20 mm，切片厚度为400 µm。</li>
		<li>使用振动切片机对固定的海马体进行切片。 
		注意：良好的纵向CA1海马脑切片应包含一层CA1区和两层齿状回。最多可获得2个优质海马切片。作为替代，横向海马脑切片应保持齿状回、CA3区和CA1区结构完整。</li>
		<li>使用移液器将纵向海马脑切片从振动切片机中转移至水浴中的脑片保存室。</li>
		<li>将切片在32 °C水浴中孵育20分钟，随后移至室温恢复30分钟。 
		注意：也可将脑切片从水浴中取出后，直接轻轻放入灌流含氧ACSF（温度为32 °C）的记录室中，恢复30分钟。</li>
		<li>在孵育期间，将400 mL ACSF溶液倒入另一烧瓶中，并通入混合气体（95% O2/5% CO2）约20–30分钟，待脑切片转移至记录室前完成氧合。以2 mL/min的速度持续向记录室灌流ACSF。</li>
		<li>打开温控装置，将流动的ACSF加热至32 °C。</li>
		<li>将剩余的1.6 L溶液储存于4 °C冰箱中。溶液最多可保存一周，若未使用则必须丢弃，以防真菌生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外记录
	<ol>
		<li>开启所有必要的硬件设备，搭建记录系统。</li>
		<li>将脑切片从保存室转移至记录室。使用钝头镊子调整脑切片位置，并用网格固定器（harp）固定。让ACSF持续灌流至少20分钟，以确保脑切片在记录前达到稳定状态。</li>
		<li>用ACSF填充记录电极，作为内液。</li>
		<li>使用指定软件检测记录电极的电阻，其阻值应在3–5 MΩ范围内。</li>
		<li>启动数据采集软件。该软件应具备与前述在体记录相似的数据采集功能。</li>
		<li>将记录电极和刺激电极牢固固定于立体定位仪支架上。将参考电极置于记录室中的ACSF内。</li>
		<li>对于纵向切片，将刺激电极和记录电极置于oriens层（S.O.）。电极间距应保持在约300至500 µm之间。将刺激电极置于脑切片的隔侧或颞侧，并在同一层进行记录（图8）。</li>
		<li>或者，将刺激电极和记录电极置于radiatum层（S.R.）。将刺激电极置于脑切片的隔侧或颞侧。</li>
		<li>对于作为对照的横向切片，将刺激电极置于CA3区（Schaffer侧支通路），记录电极置于CA1区（图9）。 
		注意：此为替代性对照步骤，应在独立实验中进行。</li>
		<li>开启隔离式刺激发生器，施加刺激（持续时间100 μs，每30&#8201;s重复一次）。调整记录电极的深度和/或位置，直至观察到稳定的诱发电兴奋性突触后场电位。</li>
		<li>通过改变刺激强度，确认是否诱发出稳定的fEPSP。每次改变刺激强度时，fEPSP的斜率应有明显变化，此关系称为输入-输出曲线。绘制输入-输出（I-O）曲线，以确定fEPSP斜率不再随刺激强度增加而上升时的最大刺激强度（图6）。 
		注意：若实验过程中纤维放电（fiber volley）消失，应舍弃数据并调整电极位置。</li>
		<li>利用输入-输出曲线，将基础记录和高频刺激（HFS）或强直刺激的刺激强度设定为最大诱发电位fEPSP的30–40%。</li>
		<li>或者，在研究长时程抑制（LTD）的实验中，利用输入-输出曲线将基础记录和低频刺激（LFS）的刺激强度设定为最大诱发电位fEPSP的70%。</li>
		<li>记录20–30分钟的局部场电位作为基线。</li>
		<li>施加两次100 Hz的高频刺激，间隔30秒，以诱导长时程增强（LTP）。</li>
		<li>或者，在LTD实验中，根据已建立的方案，施加以下任一种低频刺激以诱导LTD：5&#8201;Hz（3&#8201;分钟内900次刺激）、1&#8201;Hz LFS（15&#8201;分钟内900次刺激），或1 Hz配对脉冲刺激（配对脉冲间隔50&#8201;ms，15&#8201;分钟内900对刺激）。</li>
		<li>HFS或LFS后，继续记录1小时的局部场电位。</li>
		<li>导出数据并进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Levy, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequence+predicting+CA3+is+a+flexible+associator+that+learns+and+uses+context+to+solve+hippocampal-like+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">A sequence predicting CA3 is a flexible associator that learns and uses context to solve hippocampal-like tasks.</a> Hippocampus. 6 (6), 579-590 (1996).</li>
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<li>Sun, D. -g, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+potentiation%2C+but+not+depression%2C+in+interlamellar+hippocampus+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long term potentiation, but not depression, in interlamellar hippocampus CA1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5187(2018).</li>
<li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro%3A+network+dynamics%2C+filter+properties%2C+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160(2015).</li>
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</ol>

我们没有需要披露的内容。

本方案展示了在体内以及在体外海马CA1-CA1纵轴脑切片中诱导长时程突触可塑性的方法。所述步骤提供了充分的细节，使实验人员能够研究海马CA1-CA1纵向连接中的长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）。成功记录场兴奋性突触电位需要经过实践以熟练掌握相关技术。
除了需要练习外，还有一些关键步骤对于获得良好的实验结果至关重要。首先，先前的研究表明，脑切片的角度可能截断或保留海马体CA1-CA1区域锥体神经元的纵向投射16。纵向排列的锥体神经元与横向神经元之间的投射角度接近垂直。由于CA1神经元在海马体内以多种角度传播，它们之间的纵向连接沿袭海马体的背腹轴分布。因此，在进行体外记录时，实验人员必须考虑到这一点，通过沿背腹轴方向切割分离的海马体组织，以准确地靶向位于纵轴上的CA1-CA1海马神经元。此外，在进行体内记录时，刺激电极和记录电极的放置角度决定了所获得的结果是否真正代表纵向轴，还是横轴与纵轴信号的混合。为进一步验证诱发反应是否仅来源于CA1区域，可利用CRISPR-Cas9技术开展深入研究，因为该反应可能是来自CA1和CA3两个区...

海马体已被广泛应用于认知研究1,2,3。海马体在横断轴上的板层网络构成了三突触回路，该回路由齿状回、CA3 和 CA1 区域组成。该板层网络被认为是一个平行且独立的功能单元4,5。这一板层观点影响了在体和离体电生理研究中对海马体横断方向及横切片的使用。随着新研究的出现，板层假说正在被重新评估6，同时研究也开始关注海马体的板间网络。关于海马体板间网络，CA3 区域长期以来已被广泛研究7,8,9,10，而直到最近，CA1 区域沿纵轴方向的研究才逐渐受到关注。关于 CA1 板间网络，已有研究表明大鼠海马体 CA1 区背腹向纵轴上的短期突触特性存在差异11。此外，在大鼠执行短期记忆任务时，对相位和位置有响应的海马神经元集群被发现沿海马纵轴呈系统性排列12。同时，癫痫发作活动也被发现沿整个海马体的纵轴同步发生13。
然而，大多数关于海马CA1纵向区域的研究都利用了CA3区域向CA1区域的输入11,14,15。通过采用一种独特的制备纵向脑切片的方案，我们先前的研究证明了CA1锥体神经元沿纵向轴的联合性连接，并揭示了其有效处理神经信号的能力16。然而，仍需确定在缺乏横向输入的情况下，沿纵向轴分布的CA1锥体神经元是否能够支持长时程突触可塑性。这一发现将为与海马相关的神经科学问题研究提供新的视角。
神经元调节信息传递效率的能力被称为突触可塑性。突触可塑性被认为是学习和记忆等认知过程的基础机制17,18,19,20。长时程突触可塑性表现为长时程增强（LTP），代表神经元反应的增强，或长时程抑制（LTD），代表神经元反应的减弱。长时程突触可塑性已在海马体的横轴上得到研究。然而，本研究是首次在CA1锥体神经元的海马纵轴上展示长时程突触可塑性。
基于 Yang 等人所使用的实验方案16，我们设计了本实验流程，用于在海马 CA1 锥体神经元的长轴上展示长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）。体外实验采用 5 至 9 周龄的 C57BL6 雄性小鼠，体内实验则采用 6 至 12 周龄的小鼠。本文详细描述了如何获取小鼠海马长轴脑切片以进行体外记录，以及如何在长轴方向上进行体内记录。在体外记录中，我们通过靶向海马的 septal 端和 temporal 端，研究了 CA1 区长轴突触可塑性的方向特异性；同时，通过记录海马 stratum oriens 和 stratum radiatum 层的信号，研究了其层特异性。在体内记录中，我们探究了最能对应海马长轴方向的角度。
通过体内和体外的细胞外场电位记录，我们观察到纵向连接的CA1锥体神经元表现出长时程增强（LTP），而非长时程抑制（LTD）。然而，涉及CA3和CA1神经元的横向通路则既能支持LTP，也能支持LTD。海马体中横向与纵向通路在突触功能上的差异，可能提示其功能连接存在不同，但这仍属推测。未来需要进一步的实验来解析两者突触功能特性的差异。

<table><tbody><tr><td>硫酸阿托品一水合物，&amp;ge;97%（薄层色谱法），结晶状</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5908-99-6</td><td>存放于干燥器中</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Clampex 10.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖 &amp;ge; 99.5%（气相色谱法）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>眼用凝胶（Eyegel）</td><td>Dechra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD Life Sciences</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁，BioXtra，&amp;ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>矩阵电极，钨丝</td><td>FHC</td><td>18305</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 放大器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾，BioXtra，&amp;ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钾 &amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>存放于干燥器中</td></tr><tr><td>泵</td><td>Longer precision pump Co., Ltd</td><td>T-S113&amp;amp;JY10-14</td><td></td></tr><tr><td>硅油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63148-62-9</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠，BioXtra，99.5-100.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，BioXtra，&amp;ge;99.5%（AT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠，粉末状</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖，&amp;ge; 99.5%（气相色谱法）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>钨丝微电极</td><td>FHC</td><td>20843</td><td></td></tr><tr><td>氨基甲酸乙酯，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51-79-6</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT-1200S</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Grant Instruments</td><td>SAP12</td><td></td></tr></tbody></table>

通过电生理场电位记录研究海马ca1区跨层间的长期突触可塑性

Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording

对海马体突触可塑性的研究主要集中在CA3-CA1层状网络的使用上。相比之下，纵向的层间CA1-CA1网络受到的关注较少。然而最近的研究已证实CA1-CA1锥体神经元之间存在一种联合性连接。因此，有必要探究海马体的纵向层间CA1-CA1网络是否支持突触可塑性。
我们设计了一项实验方案，利用电生理场电位记录技术来检测跨层海马CA1网络中是否存在长时程突触可塑性 两者 体内和体外实验中，进行细胞外场电位记录。在体内实验中，记录电极和刺激电极沿背侧海马体的隔颞轴以纵向角度放置，以诱发出场兴奋性突触后电位。在体外实验中，海马体纵向切片沿隔颞平面平行切割。记录电极和刺激电极沿海马体纵向轴分别置于海马的锥体细胞层（S.O）和辐射层（S.R）。这使我们能够研究诱发出的兴奋性突触后电位的方向特异性和分层特异性。我们采用已建立的实验方案，在体内和体外分别诱导长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）。实验结果表明，纵向跨层CA1网络支持N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体依赖的长时程增强（LTP），且无方向性或分层特异性。然而，与横向层状网络不同，跨层网络未表现出显著的长时程抑制（LTD）。

我们利用体内和体外的细胞外场电位记录，研究了海马区CA1锥体神经元沿纵轴的长时程突触可塑性。长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）是长时程突触可塑性的两种表现形式，在海马横轴上已被证明具有单向性。
我们在此证明，利用沿海马体长轴制备的纵向脑切片，可在海马CA1区的长轴方向上观察到长时程增强（LTP）。我们沿隔颞轴制备了海马体的纵向切片，该方向与横切片垂直（图1）。通过对海马CA1区的记录，我们证实了LTP的存在，且该增强效应无方向特异性。在纵向海马脑切片的隔部或颞部（图2）所获得的记录之间未发现具有统计学意义的差异。我们还证实了LTP不具有层次特异性；因此，从辐射层（stratum radiatum）和始层（stratum oriens）（图2）均成功记录到LTP的诱导。我们使用NMDAR拮抗剂D-AP5证明了所诱导的LTP依赖于NMDA受体（图3</stro...

我们在海马脑片中使用记录和刺激电极，并在活体背侧海马中纵向放置记录和刺激电极，以诱发细胞外突触后电位，并证明沿纵向跨层CA1区的长时程突触可塑性。

通过电生理场电位记录研究海马CA1区跨层间的长期突触可塑性

对海马体突触可塑性的研究主要集中于CA3-CA1层状网络的使用，而对……的关注较少。

长期以来，突触可塑性，特别是长时程增强和长时程抑制，已在海马体的横向方向上得到了广泛研究。同时，也已在纵向方向上进行了相关研究。然而，就纵向方向而言，关于海马体纵向CA1轴在突触可塑性方面的研究却极少受到关注。我们实验室先前的一项研究已表明，海马体 CA1 锥体神经元可形成支持突触可塑性的联合性连接。为进一步理解本实验方案，建议您参考下方所列的先前发表文献。注射乌拉坦以麻醉小鼠。将完全麻醉的小鼠置于设置为 37 摄氏度的加热垫上。涂抹眼用凝胶以保持眼睛湿润。使用眼眶固定钳牢固固定小鼠颅骨。眼夹可在手术过程中为实验者提供操作的灵活性。此外，它在涉及听觉皮层的实验中也特别有用。然而，必须格外注意以获得精确的立体定位坐标。用手术刀分离小鼠顶骨与枕骨交界处的皮下组织和肌肉。用棉签将硬脑膜擦干。然后穿刺小脑延髓池以引流脑脊液。用棉签固定以持续引流脑脊液。剪除头皮上的皮肤并保持暴露区域干燥。借助游标卡尺标记对应海马体区域的点位。使用手术刀或高速钻头，在显微镜下沿标记点于海马背侧区域上方的颅骨处做切口。通过滴加生理盐水或惰性油保持暴露的脑组织湿润。将刺激电极和记录电极牢固地固定并定位在立体定位仪的电极夹持器中。将刺激电极和记录电极调整至背侧海马CA1区上方。以小鼠脑立体定位坐标为参考，确定背侧纵向CA1海马区域的坐标位置。若使用多通道电极进行记录，应首先利用第一通道确定海马CA1区域的立体定位坐标。将剩余电极放置到位，使刺激电极和记录电极相对于前囟点中线的角度在30度至60度之间。该角度对应于海马CA1区的纵向走向。开启记录系统。打开用于记录和数据采集的神经软件。使用显微操作器缓慢降低记录电极和刺激电极，直至电极刚好接触脑表面。当电极接触脑表面时，观察到阻抗的升高。这可以在屏幕上显示的红色通道中观察到。缓慢将电极降至与所选海马CA1区立体定位坐标相对应的大致深度。给予刺激，直至观察到稳定的诱发出的兴奋性突触后电位。通过输入-输出曲线检测最大刺激强度。利用输入-输出曲线设定基线强度，并设定用于诱发高频刺激或低频刺激的刺激强度。在高频刺激或低频刺激后，记录一小时内的局部全电位。导出数据并使用选定的软件进行分析。将400 ml预先配制好的切片液倒入另一个烧瓶中，并通氧约20分钟。取200 ml已通氧的切片液。用封口膜覆盖，并转移至 -80 摄氏度冰箱中冷冻约 20 分钟，制成冰沙状。将剩余的 200 ml 切片液倒入脑片孵育室中，置于 32 摄氏度水浴中持续通气。取出预冷的切片液，倒入约 50 ml 至烧杯中。将麻醉后的小鼠断头。剪开覆盖头骨的皮肤，沿中线将头骨切至枕骨。用钝头镊子打开头骨。用解剖刀沿中线将两个脑半球分开。用刮勺轻轻挖出脑组织，放入烧杯中的预冷切片液中。用刮勺轻轻剥离皮层，分离出海马体。切除分离出的海马体的隔端和颞端。在切片板上涂抹少量胶水。对于纵向CA1海马切片，用胶水将海马体的CA3区域固定在切片板上。对于作为对照的横切切片，将海马的腹侧末端固定在振动切片机的切片板上。将其放入切片室中。设置振动切片机的参数。使用振动切片机切割已固定的海马组织。一个良好的纵向CA1海马脑切片应包含一层CA1区和两层齿状回。此外，CA1区的锥体细胞层（stratum oriens）和辐射层（stratum radiatum）也应清晰可见。或者，可制备横切的海马脑片，以保留齿状回、CA3 和 CA1 区域的完整性。将脑片转移至水浴中的脑片孵育室，于 32 摄氏度孵育 20 分钟，随后置于室温下恢复。以每分钟2 ml的速度持续向记录室中灌流ACF溶液。将脑片转移至记录室中，用钝头镊子调整脑片位置，并用固定网将其固定。启动数据采集软件。纵向脑切片。对于纵向切片，将刺激电极和记录电极置于内嗅层。将刺激电极放置在脑切片的 septal 侧或 temporal 侧，并从同一层进行记录。或者，将刺激电极和记录电极置于辐射层，在脑切片的 septal 侧或 temporal 侧放置刺激电极。对于作为对照的横切切片，将刺激电极置于 CA3 区的 Schaffer 侧支通路区域，记录电极置于 CA1 区域。打开隔离刺激发生器并给予刺激。调整记录电极的深度，直至观察到稳定的诱发出的兴奋性突触后电位。通过输入-输出曲线检测最大刺激强度。利用输入-输出曲线设定用于基线记录、诱发高频刺激或低频刺激的刺激强度。有关诱导长时程增强或长时程抑制的参数，请参阅所附的 PDF 文件。在体内，诱发兴奋性突触后电位在高频刺激下增加。这表明海马 CA1 区支持长时程增强。对于纵向的海马CA1脑切片，在高频刺激下，海马CA1区的隔侧和颞侧的内分子层和辐射层均观察到反应增强。这表明沿纵向海马CA1区域诱导的突触可塑性并非线性或具有方向特异性。采用已建立的长时程抑制实验方案，在体内和体外均未诱导出长时程抑制效应。综上所述，我们向您展示了如何在体内和体外研究海马CA1区沿纵轴的长时程突触可塑性。有关该实验方案的更多细节，请参阅本视频附带的PDF文件，以帮助您在自己的实验室中开展针对海马CA1区纵轴方向长时程突触可塑性的研究。

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