通过长距离反向PCR检测活跃的嗜热LINE-1逆转座子活性

该方法可检测称为LINE-1的逆转座子活性。这些可移动遗传元件可在癌症基因组中引起新生插入，从而导致基因组不稳定。这种基于PCR的技术相较于高通量测序方法具有操作简便、成本低廉的优势。

本文展示了该方法在检测源自人类22号染色体TTC28基因内LINE-1的新生插入事件中的应用价值。LINE-1的活性可作为恶性肿瘤或癌前病变的生物标志物，尤其适用于结肠癌或高级别浆液性卵巢癌等上皮性肿瘤类型。除LINE-1插入外，该方法还可检测其他基因组异常，例如始终因特定原因而发生的DNA重排。

为了选择合适的限制性内切酶并设计反向引物，首先从 LINE-1 数据库（如 L1Base）下载 TTC28 LINE-1 序列的 FASTA 格式文件。TTC28 LINE-1 的 L1Base 编号为 135。所下载序列应包含 LINE-1 序列两端上下游各五千个碱基的侧翼序列。

将序列导出至文字处理软件。此处，Line-1 侧翼序列以棕色字体标注，Line-1 序列以灰色字体标注。为确定唯一的标签，需分析 TTC28 Line-1 三端下游一千个碱基的序列，并将其输入多聚腺苷酸化信号预测工具，例如 Polyadq 或 Dragon PolyA Spotter。

标注此一千碱基窗口内的所有加 poly(A) 信号。此处以粉红色高亮显示的 TTC28 LINE-1 自身较弱的加 poly(A) 信号与下游最强加 poly(A) 信号之间的序列，即为该 LINE-1 的独特标签，此处以黄色高亮显示。为设计反向 PCR 引物，可将该独特标签序列输入基于网页的引物设计工具（如 NCBI 的 Primer-BLAST），以生成特异性 PCR 引物，并将产物长度参数设置为最小值，以确保引物对之间的距离较近。

选择合适的基因组数据库。由于Primer Blast输出的是相对的常规PCR引物，因此需使用反向互补功能对引物对进行反向PCR设计。引物设计时，应尽可能对应于东部的多聚腺苷酸化信号区域。

我们设计了三对引物，分别用青绿色和绿色高亮显示，对应于TTC28 LINE-1独特标签中的三个强多聚腺苷酸化信号。接下来，为了选择合适的限制性内切酶，可使用基于网页的工具（如RestrictionMapper）在硅片上对LINE-1序列及其上下游各五千碱基的侧翼区域进行酶切分析。这将提供一份全面的限制性内切酶列表，这些酶可切割该区域，产生不同的限制性片段。

选择在LINE-1五端上游进行五端切割的限制性内切酶，或者如果切割位点位于LINE-1内部，则选择靠近LINE-1五端的酶。同时选择在唯一标签下游进行三端切割的限制性内切酶。由特异性限制性内切酶产生的包含LINE-1序列及其唯一标签的天然限制性片段长度不应超过12 kb，否则可能无法通过PCR有效扩增。

需要注意的是，所选用的限制性内切酶应对DNA甲基化不敏感，能够通过加热失活，并能产生彼此互补的黏性末端。为了展示长距离反向PCR，我们将使用SacI限制性内切酶，该酶在DNA上的DAZCTC位点进行切割，此处以浅绿色高亮显示。SacI在TTC28 LINE-1位点满足所有上述条件，并产生一个长度为5,700个碱基对的天然限制性片段。

使用市售的DNA提取试剂盒从样本中提取基因组DNA，该试剂盒能够提取高质量、高分子量的DNA，适用于长距离反向PCR。本文中，我们根据制造商说明书，从MCF7乳腺癌细胞系和正常人血液中提取了基因组DNA。使用荧光计测定DNA浓度。

将100纳克DNA与DNA分子量标记物一同在琼脂糖凝胶上进行电泳，以检测DNA的质量和数量。为制备环状DNA模板，首先使用合适的限制性内切酶对DNA进行消化。此处我们使用SacI酶消化MCF7和血液基因组DNA。按照文本方案配制消化反应体系。

轻弹管壁混匀溶液，短暂离心。按照制造商说明书，将反应混合物在37摄氏度孵育1小时，随后进行热失活。接下来，根据文本方案配制连接反应主混合液，用于自连消化后的DNA。

每个反应中，将30 µL连接反应主混合液直接加入上一步得到的50 µL已消化DNA溶液中。通过轻弹管壁混匀溶液，并短暂离心。将反应混合物置于热循环仪中，在22 °C孵育10分钟，最后在60 °C进行10分钟的热失活步骤。

该环状DNA模板将用于后续的反向PCR步骤。在PCR仪中设置退火温度梯度，通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度。根据文本方案，将所有组分混合，配制PCR反应的预混液。

在梯度中为每个退火温度设置一个反应。每个反应中，分配19微升主混合液至PCR管，并加入1微升由血液基因组DNA制备的环状DNA模板。运行梯度PCR程序。

取6 µL PCR产物，在一次反应中以不同退火温度进行琼脂糖凝胶电泳。为检测MCF7细胞系基因组中新生的TTC28 LINE-1逆转座活性，使用反向引物对针对由MCF-7细胞系产生的环状DNA模板进行PCR扩增。操作步骤与梯度PCR相同，但此次将温度梯度替换为最佳退火温度，即64 °C。

通过琼脂糖凝胶电泳分析长距离反向PCR产物的结果。该电泳后的琼脂糖凝胶图像显示，从MCF7和血液样本中提取的基因组DNA具有高分子量，适用于长距离反向PCR。该电泳后的琼脂糖凝胶图像表明，我们设计的反向引物对可在梯度中的所有退火温度下扩增正确的环状模板，表现为在5 kb至7 kb DNA标记之间出现明显的条带。

然而，在较低温度下也观察到多条条带，表明引物特异性差以及退火温度不理想。因此，对于这对引物，64摄氏度为最佳退火温度。该琼脂糖凝胶图像显示了对MCF7细胞系和正常血液中提取的DNA进行长距离反向PCR后获得的PCR产物。

一个大小为 5,700 个碱基对的 PCR 产物（以星号标记）代表位于其天然位点的 LINE-1 对应的天然 PCR 产物。该天然 PCR 产物在 MCF7 和正常血液 DNA 中均可观察到。新生的 LINE-1 逆转座事件以及 MCF7 基因组可通过琼脂糖凝胶上不同大小的 PCR 产物检测到，同时还能观察到天然 PCR 产物。

通过单分子长读长测序技术对远距离反向PCR产物进行测序，可在核水平高分辨率下实现靶标鉴定。尽管较为繁琐，也可对远距离反向PCR产物进行克隆并采用桑格测序法进行测序。在本视频中，检测到了位于22号染色体上一个LINE-1元件的活性。

相同的实验流程可适用于监测在不同类型肿瘤中具有活性的其他 LINE-1 元件。