一种用于活细胞中Fura-2类似物检测细胞内Ca2+时校正烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的新方法
2019年9月20日
由于NADH和fura-2类似物的激发波长与发射波长存在光谱重叠，因此在活细胞中对[Ca2+]进行定量测定时，这两种化学物质的信号干扰不可避免。为此，开发了一种新型的在线校正NADH信号干扰以测定[Ca2+]的方法。
紫外激发的多重探针由于自发多重信号的存在而具有固有的信号污染。其中，NADH 是造成多重探针应用受限的主要问题。可通过一种方法精确校正来自 NADH 的外源荧光，从而提取真实且无污染的多重探针信号。
本实验操作将由我实验室的研究助理教授 Jeong Hoon Lee 演示。待心肌细胞沉降至管底后，吸除上清液。在 4°C 条件下，用 2 毫升新配制的 1 毫摩尔 fura-2-FFAM 稀释液对细胞进行标记，孵育 60 分钟。
孵育结束后，将试管直立置于37摄氏度水浴中30分钟，然后去除上清液。随后加入4毫升室温培养基，于室温下保存。对于原位等吸收点fura-2-ffa定点识别，将稀释后的细胞置于显微镜载物台上，静置3分钟使细胞沉降至底部。
将无NADH、37摄氏度、无钙溶液大量灌注到细胞培养体系中，并定位目标细胞。先用皂苷溶液灌注60秒，随后立即重新灌注无NADH、无钙溶液。同时使用350至365纳米激发光扫描（步长0.1纳米），在450和500纳米处同步测量fura-2-ff发射信号，并重新灌注无NADH、无钙溶液。
接下来，从钙饱和溶液中的信号中减去无钙条件下的信号。然后计算每个激发波长下发射光的标准差，并选择标准差最小的激发波长作为各个等吸收点。为了使用多参数测量系统检测背景信号并校正细胞区域内的信号，需将未染色的细胞置于显微镜灌流槽中，静置三分钟使细胞沉降。
以每分钟 2 至 3 毫升的流速，将大量不含钙的 NADH 溶液注入浴槽中约五分钟，并设置视野以覆盖目标细胞。将细胞移出视野后，测量无细胞区域的背景信号，并将这些信号设为偏移值。然后将细胞返回初始位置，测量细胞的背景信号及细胞面积。
为计算R因子，请在将无染料细胞重新装入显微镜并灌注无钙溶液之前，获取细胞背景信号和面积信号。在向细胞悬液灌注苹果酸溶液之前，按前述方法测量信号。测量信号后，依次用丙酮酸溶液、苹果酸-丙酮酸溶液以及鱼藤酮溶液对细胞进行灌注。
然后计算每个信号的斜率。此处展示了校正前后线粒体钙离子变化情况。结果清楚地揭示了线粒体钙离子的显著变化，在无胞质钙条件下线粒体静息钙浓度为1.03 ± 0.13 微摩尔，在1微摩尔钙条件下线粒体最大钙浓度为29.6 ± 1.61 微摩尔。
使用两纳摩尔的TMRE持续灌注监测线粒体跨膜电位。线粒体电位的变化基于假设的初始线粒体膜电位为负150毫伏进行计算，结果显示在加入钙后NADH水平下降，而线粒体膜电位几乎不受影响。通过负载羧基SNARF-1诱导线粒体钙升高，并未影响线粒体pH。
错误的等吸光点会导致 R 值和 NADH 校正不准确。因此，务必正确测量无细胞背景和细胞区域。该技术用于生物分析溢出实验中的线粒体钙动力学研究制备。
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概述
本研究解决了在活细胞中测量钙离子浓度时，NADH 和 fura-2 类似物信号干扰的问题。开发了一种新型在线校正方法，以提高在存在 NADH 信号污染情况下 [Ca²⁺] 测量的准确性。
关键研究组成部分
研究领域
- 荧光测量中的信号干扰
- 活细胞中钙离子的测量
- 校正技术的开发
背景
- 激发和发射波长的光谱重叠使测量变得复杂。
- NADH 可能限制多种探针在荧光显微镜中的应用效果。
- 准确测量[Ca2+]在细胞研究中至关重要。
使用的方法
- 使用 fura-2 进行荧光测量
- 心肌细胞的细胞检测
- 信号校正技术与背景测量
主要结果
- 观察到线粒体钙离子浓度发生显著变化。
- 建立了一种系统性方法以校正NADH的干扰。
- 通过严格的实验流程验证了该技术的可靠性。
结论
- 该研究成功展示了一种提高荧光测量准确性的方法。
- 这对细胞生物学中的定量分析具有重要意义。
常见问题
行业应用价值
准确的细胞内钙离子浓度测定对于药物发现中的靶点验证至关重要，特别是针对线粒体信号通路。NADH 自发荧光会对基于 fura-2 的检测方法产生显著干扰，降低数据可靠性，并增加早期筛选中的假阳性率。该 NADH 校正方法通过分离真实的钙信号，提高了预测可信度，有助于心血管和代谢类靶点项目的机制性风险排除。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在疾病模型中将线粒体钙处理机制作为治疗假设进行探究。
- 操作价值：通过分离NADH自发荧光与真实的fura-2信号，减少机制上的不确定性。
- 预测价值：通过定量、无干扰的钙流测量，提高靶点的可信度。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：通过建立经NADH校正的荧光基线，制备可用于后续化合物筛选的已验证生物系统。
- 可重复性：利用等吸收点测定法标准化激发波长的选择，最大限度减少不同检测间的变异性。
- 多重检测能力：支持使用不同的激发/发射波长组合，同时检测NADH、钙离子、pH值或膜电位。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：可直接应用于神经退行性疾病和代谢紊乱中的线粒体功能障碍模型。
- 转化连续性：通过校正的fura-2-FF信号，将发现阶段的钙流观测结果与临床前验证相衔接。
- 风险调整型推进：减少线粒体钙检测中的假阳性信号，从而实现更可靠的推进/终止决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导化合物发现，再到临床前机制验证的整个发现过程，特别针对线粒体靶点。
- 发现生物学：通过在活细胞检测中分离钙依赖性信号与代谢干扰，支持信号通路的阐明。
- 筛选：通过背景扣除和偏移校正提高检测准备就绪性，改善信噪比，从而优化化合物评估。
- 分析：通过使用在450 nm和500 nm处经校正的发射光进行R因子计算，实现定量的比率测量。
- 转化研究：通过TMRE同时监测钙离子和线粒体膜电位，与临床前研究相衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的校正框架，适用于各类易受NADH干扰的细胞类型和荧光探针。
运营与企业影响
- 科学价值：通过消除NADH诱导的钙信号假阳性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过系统性地识别等吸光点并进行背景扣除，提升检测方法的标准化和可重复性。
- 战略价值：通过降低早期筛选级联中的生物学噪声，支持更优的“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：通过可靠且无干扰的功能性读数，实现对线粒体靶点的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备荧光显微镜和比率探针操作的专业知识。
- 需要配备能够进行波长扫描激发（350–365 nm）和双发射检测（450 nm，500 nm）的仪器设备。
- 要求跨团队统一背景信号测量和偏移校正方案的标准操作流程。
- 在将该方法应用于不同的无染料细胞制备工作流程时，需考虑适应性调整。
- 依赖于对无细胞背景信号和细胞区域信号的精确测量，以避免等吸收点选择错误。
