Caenorhabditis elegans中 2-阿拉希多诺诺基甘油定量的分解标准合成
2019年9月21日
这项工作描述了一个强大和直接的方法，以检测和量化内分泌大麻素2-阿拉基诺诺甘醇（2-AG）在C.elegans。我们通过同位素稀释和液相色谱-电喷雾电化-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）制备并用于2-AG定量的分析化标准。
内啡肽是保守的脂质介质，调节各种生物体中的多种生物过程。首次发现的内啡肽是阿南达米德和2-阿拉奇多诺伊利塞罗尔，2AG。线虫C.elegans是研究多种生物过程的强大动物模型。
最近，我们发现2-AG在调节C.elegans胆固醇贩运方面起着基础性作用。这就是为什么设计和优化一种通过C.elegans的检测和定量来研究内生2-AG的方法变得势在必行。以前报告的分析方法，以量化2AG的生物样品通常涉及使用除去标准，商业收购需要有他们可供购买。
然而，它们价格昂贵，而且由于存在多个双键，因此对随着时间的推移被氧化非常敏感。标准最常见的版本是基于八度氧化氢酸，适合通过同位素稀释、液相色谱和后质谱进行定量。为了克服与2-AG的脱化标准的成本和稳定性相关的困难，我们用一种方便而简单的方法来准备基于2-5-甘油的分析标准。
准备五角标准的顺序需要三个步骤。可以保持在受保护的形式，直到它需要。本工作的主要目的是展示一套完整的方法，从分析脱氧标准的合成到线虫样品的制备和提取，最后通过液相色谱和质谱分析，研究C.elegans中的2-AG。
获得脱毒1-AG作为定量测定的解毒内部标准，遵循三步协议。为了只保护原醇，首先使用巴斯德移液器将38毫克甘油解至10毫升反应管中，然后加入磁搅拌器。接下来，使用五毫升汉密尔顿注射器加入五毫升无水 DCM，并在管内加入干氮，以营造惰性气氛。
使用装满蒸馏乙酸乙酯的浅德瓦尔烧瓶准备一个浴缸。将密封反应管填充在浴池内，然后缓慢地将液氮加入乙酸乙酯中冷却，直到溶剂被冷冻。注意，液体在室温下剧烈沸腾，如果与眼睛和皮肤接触，可能会导致严重烧伤。
接下来，使用汉密尔顿注射器添加54毫克无水对撞。注意，碰撞是挥发性，有一个非常强烈和难闻的气味。在70毫克的特丁基-二甲基-乙酰氯，并在负78度的磁搅拌器上搅拌所有东西三个小时。
加入两毫升盐水以抑制反应。使用两毫升蒸馏二氯甲烷三次提取溶液，使用分离的漏斗每次保持有机提取物。然后，将三种有机提取物与硫酸钠干燥。
使用柱色谱法，以硅胶作为固定相，从 100%六烷开始，以 100% 乙酸乙酯完成 10% 的六烷乙酸酯梯度，然后以 100% 乙酸乙酯完成。对于此酯化步骤，使用巴斯德皮盘将先前声明的产品添加到 10 毫升反应管中，并加入磁性搅拌器。使用五毫升汉密尔顿注射器加入两毫升无水 DCM，并在管内加入干氮，以营造惰性气氛。
使用冰浴将溶液冷却到零度。使用多体积可调微管和搅拌的36毫克阿拉奇尼酸。然后，加入15毫克的40-甲基-氨基苯丙胺，搅拌。
使用多体积可调微管加入15毫克二甲基丙基卡博米德，搅拌。加入两毫升水以淬火反应，然后用两毫升蒸馏DCM三次使用分离漏斗提取溶液。结合三种有机提取物和干燥的硫酸钠，用硅胶作为固定阶段通过柱色谱纯化粗混合物，然后从100%六烷开始增加乙酸六烷的六烷乙酸酯梯度，最后以50 50%乙酸乙基乙酸乙烷完成。
最后，对于脱保步骤，使用巴斯德移液器将先前合成的15毫克产品加入10毫升反应管，并加入磁搅拌器。使用五毫升汉密尔顿注射器加入两毫升无水四氢素，用干氮填充管子，以营造惰性气氛。然后使用冰浴将溶液冷却到零度。
使用汉密尔顿注射器在THF中加入150微升滴，在THF中加入一种四丁基酰胺氟化的摩尔溶液。一小时后，加入两毫升水来淬火。使用分离漏斗用两毫升蒸馏 DCM 三次提取溶液。
将三种有机提取物和干燥的硫酸钠混合。对于漂白过程，将蠕虫转向种子六厘米的NGM板。让蠕虫从两天长到三天，这样盘子里就有很多鸡蛋和成年。
一旦你有足够的鸡蛋和成人，倒五毫升的M9到盘子里。使用玻璃移液器，将蠕虫转移到15毫升猎鹰管中。在2000G下将管子离心两分钟，然后对蠕虫进行颗粒化。
在不干扰蠕虫颗粒的情况下吸吸大部分 M9。加入三毫升漂白溶液，通过倒置轻轻混合溶液约五分钟，或直到看到完整的成年蠕虫数量减少。一旦大部分尸体溶解，离心机在2000G下一分钟。
在不干扰蠕虫颗粒的情况下吸吸大部分漂白溶液。将15毫升M9加入管子，混合好。在2000G下再次离心一分钟。
在不干扰蠕虫颗粒的情况下吸吸大部分 M9。对于蠕虫样本制备，让通过漂白程序获得的N2胚胎在M9缓冲液中过夜，温度为20度。然后，收获同步L1，在2000G下将管子离心两分钟，再用M9缓冲液清洗蠕虫，并量化活L1的数量。将大约1万只蠕虫播种到NGM板中，用一毫升OP 50 Escherichia大肠杆菌先前干燥。
在20度下孵育板至少48小时，直到蠕虫到达L4级。使用冷M9缓冲液在50毫升猎鹰管中收获蠕虫。洗一次，并转移到1.5毫升管。
在2000G下离心一分钟，将蠕虫挖碎。消除大部分上一液。然后，将管浸入液氮中，在零下80度下搅拌。
解冻约100微升属于N2的冷冻蠕虫颗粒，然后加入1.3毫升甲醇。之后，对样品进行四分钟的声波化。声化后，加入1000ppb的内部脱氧标准，2.6毫升氯仿，1.3毫升0.5摩尔氯化钾，0.08摩尔磷酸，最终比例为1比1。
将样品旋涡1分钟，然后在超声波水浴中对样品进行声波化，在冰上进行15分钟。再次对样品进行两次涡流，一分钟，在2000G下将样品离心10分钟，以诱导相分离。将下相收集到干净的玻璃管中，在氮气下干燥，然后重新放入100微升的乙酰气中。
为了实现内源2-AG的成功定量，有必要使用三步法合成其饱和模拟。之后，它被添加到蠕虫样品中，通过高性能液相色谱提取和分析，并结合质谱法。作为内部标准，合成脱毒1-AG是量化内源代谢物的工具。
该方法使用2-AG和脱氧1-AG的转方进行了优化，其中甘油分子丢失。C.elegans 样品中的 2-AG 内源性通过同位素稀释成功检测和量化，使用化学合成的 1-AG，使用高性能液相色谱法与质谱法相结合。样本 1 使用脱化标准 1-AG 制备，而样本 2 未使用标准。
由于样品1和3中原来除化标准的浓度为1000ppb，因此从峰值面积比可以计算样品1和样品360ppb的样品中2-AG的内源性浓度，3样本的360ppb，平均为350ppb。比率计算为两个分离样本的 2-AG 和脱化 1-AG 峰值区域之间的质量。两者都与脱吸标准添加到提取之前。
鉴于最近发现的2-AG在提高胆固醇贩运方面的重要性，以及缺乏脂质如何影响这一过程的信息，因此有必要对这种内啡肽进行可靠的检测。成功开发一种简单而健壮的合成方法，获得脱化模拟2-AG是该协议的关键步骤。所报告的单烷甘油量化方法大多数涉及使用市售分析标准，这些标准在常规储存条件下通常昂贵且不稳定，因此对于预算较低的实验室来说，这些标准是无法达到的。
但是，此方法通过提出使用更易访问的起始材料对标准进行综合计算来解决这个问题。合成方法无需复杂条件即可直接使用，因此即使在预算减少的情况下，在任何设备最少且可接触反应物的实验室中即可进行。总之，这个新程序描述了一种直接和可重复的检测和量化2-AG的方法，这将有助于回答在描述这些内啡肽在C.elegans胆固醇贩运中的作用后提出的一些问题。
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概述
本研究提出了一种检测和定量秀丽隐杆蚋中内源性大麻素2-arachidonoylglycerol（2-AG）的方法。该方法利用同位素稀释和液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）进行精确测量。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 分析化学
背景
- 内源性大麻素是参与各种生物过程的脂质介质。
- 2-AG是最早发现的内源性大麻素之一。
- 秀丽隐杆蚋是生物学研究的有效模型生物。
- 2-AG对秀丽隐杆蚋胆固醇运输调节至关重要。
研究目的
- 开发一种用于研究秀丽隐杆蚋中内源性2-AG的可靠方法。
- 解决现有方法需要商业可获得的氘代标准的局限性。
- 增强对2-AG在生物过程中作用的理解。
使用的方法
- 分析氘代标准的制备。
- 同位素稀释用于2-AG的定量。
- 液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）。
- 该方法应用于秀丽隐杆蚋样本。
主要结果
- 建立了一种用于定量秀丽隐杆蚋中2-AG的稳健方法。
- 该方法展示了高灵敏度和特异性。
- 研究结果有助于理解内源性大麻素的功能。
- 在研究其他生物体中脂质介质方面具有潜在应用。
结论
- 开发的方法可有效用于研究秀丽隐杆蚋中的2-AG。
- 本研究增强了内源性大麻素研究的工具包。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索更广泛的生物学意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of lipid mediators like 2-arachidonoylglycerol (2-AG) is critical for mechanistic de-risking and target validation in early discovery pipelines. This method enables robust, reproducible quantification of 2-AG in C. elegans using a cost-effective, lab-synthesized deuterated standard, supporting translational research on endocannabinoid pathways. The approach addresses analytical standardization challenges, enhancing predictive confidence for lipidomics-driven discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of endogenous 2-AG for pathway interrogation and functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by providing reliable internal standards for lipid mediator analysis.
- Facilitates hypothesis-driven studies on endocannabinoid roles in model organisms.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible workflow for preparing deuterated standards, ensuring assay consistency.
- Enables quantitative LC-ESI-MS/MS readouts for downstream screening applications.
- Improves assay standardization and scalability by eliminating reliance on unstable commercial standards.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling quantification of conserved lipid mediators.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in lipid metabolism and signaling studies.
- Reduces risk in advancing lipid-targeted programs by ensuring analytical rigor.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust quantification of 2-AG in C. elegans and potentially other systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for endocannabinoid signaling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for lipid mediator assays.
- Analytics: Provides isotopic dilution-based measurements for accurate comparison across samples.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment for lipid metabolism studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, cost-effective standard synthesis protocol for diverse metabolite quantification needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipidomics research.
- Operational Value: Standardizes quantification workflows and enhances reproducibility across labs.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable quantitative data for lipid targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of programs involving lipid mediators and metabolic pathways.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory skills and access to standard organic reagents and chromatography equipment.
- Needs LC-ESI-MS/MS instrumentation for quantitative analysis.
- Demands cross-team agreement on standard preparation and extraction protocols for reproducibility.
- Adaptable to other model systems and metabolites with similar chemical properties.
- Stability and storage of synthesized standards should be monitored to maintain analytical integrity.
