Name: 淀粉样蛋白纤维蛋白的相互作用和脑线粒体的膜渗透 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 s
Description: 探索淀粉样蛋白纤维与大鼠脑线粒体相互作用的机制，研究其对线粒体膜的渗透作用。该方法为神经退行性疾病中淀粉样蛋白毒性研究提供了可靠的体外模型。

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本工作得到了伊朗赞詹基础科学高等研究院（IASBS）研究委员会资助项目的资助。

所有动物实验均按照德黑兰大学医学科学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规定进行。为尽量减少对大鼠的痛苦和不良影响，实验中通过 sharpening guillotine 刀片并采用坚定而迅速的切割动作来实现。
1. 脑组织匀浆与线粒体分离
注意：线粒体分离所用的所有试剂均按照 Sims 和 Anderson14 的方法配制。
<ol>
	<li>线粒体分离缓冲液的制备
	<ol>
		<li>配制 100 mM Tris-HCl 溶液：称取 0.605 g Tris-HCl，加入约 40 mL 去离子水（DW）于烧杯中溶解。将溶液转移至 50 mL 容量瓶中，加去离子水定容至 50 mL。</li>
		<li>配制 10 mM EDTA 溶液：称取 0.202 g EDTA，加入约 40 mL 去离子水于烧杯中溶解。将溶液转移至 50 mL 容量瓶中，加去离子水定容至 50 mL。 
		注意：两种溶液均可在 4 °C 下保存至少 4 周。</li>
		<li>配制 Tris-HCl/EDTA/蔗糖储备液：在烧杯中加入 30 mL 100 mM Tris-HCl 溶液和 30 mL 10 mM EDTA 溶液。称取 32.86 g 蔗糖，在磁力搅拌下加入烧杯中。待蔗糖完全溶解后，将溶液转移至 100 mL 容量瓶中，加去离子水定容至 100 mL。 
		注意：该溶液可在 4 °C 下保存最多 3 天。</li>
		<li>配制分离缓冲液（IB）：将 100 mL Tris-HCl/EDTA/蔗糖储备液加入约 150 mL 去离子水中。滴加 0.1 M HCl 调节 pH 至 7.4，再加去离子水定容至 300 mL。</li>
		<li>用分离缓冲液配制 15%（v/v）密度梯度介质：将 1.5 mL 密度梯度介质加入 8.5 mL 冷的分离缓冲液中。</li>
		<li>配制 10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）溶液：称取 20 mg 无脂肪酸 BSA，溶于约 1.5 mL 去离子水中（2 mL 离心管中），再加去离子水定容至 2 mL，冰上保存备用。 
		注意：步骤 1.1.4–1.1.6 中的溶液需在进行线粒体分离当天新鲜配制，并全程冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠脑组织的获取 
	注意：雄性大鼠（150–200 g）的断头与脑组织取出操作参照 Sims 和 Anderson14 的方法进行。
	<ol>
		<li>将一个 30 mL 烧杯置于冰桶中，并向其中加入 10 mL 冷的分离缓冲液（IB）。</li>
		<li>使用小型动物断头器断头，并在断头后 1 分钟内取出脑组织，以尽量减少线粒体特性的退化。</li>
		<li>迅速将脑组织转移至含有冷分离缓冲液的烧杯中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织匀浆与线粒体制备 
	注意：线粒体组分的分离参照 Sims 和 Anderson14 所述方法，并结合先前报道的若干修改15。操作过程中需迅速进行，并始终将所有材料置于冰上。
	<ol>
		<li>用 30 mL 分离缓冲液（IB）清洗组织 2 次，转移至含有冷分离缓冲液的烧杯中，用剪刀将脑组织精细剪碎。</li>
		<li>加入 10 倍体积的预冷分离缓冲液（每只大鼠脑组织约 10 mL IB）。</li>
		<li>将组织悬液转移至 20 mL 冷的 Dounce 匀浆器中。</li>
		<li>使用电动研杵进行 9 次上下匀浆。 
		注意：每完成 3 次匀浆后，将混合物置于冰上静置约 30 秒，以确保匀浆液保持低温。</li>
		<li>将匀浆液转移至预冷的 10 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 1,300×g 离心 3 分钟。</li>
		<li>小心弃去上清液，将上清液转移至另一预冷的 10 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 21,000×g 离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用移液枪轻轻搅拌，将沉淀重悬于冷的 15% 密度梯度介质溶液中（每只脑组织 5 mL）。</li>
		<li>在固定角转子中，以 30,700×g、4 °C 离心 5 分钟，采用慢加速（从 0 rpm 升至 500 rpm 用时 45 秒，随后正常加速）和无刹车减速。此步骤应形成两个明显的条带（图 1A，左图）。</li>
		<li>使用巴斯德移液管移除梯度顶部聚集的清晰条带（主要含髓鞘）。然后尽可能移除覆盖在条带 2 上方的密度梯度介质溶液，避免损失条带 2 中富集的线粒体组分。 
		注意：条带 2 含有突触和非突触来源的线粒体。</li>
		<li>在轻轻搅拌下向线粒体组分中加入 8 mL 分离缓冲液（IB）。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 16,700×g 离心 10 分钟，小心弃去上清液，保留底部松散的沉淀。</li>
		<li>用移液枪尖端轻轻搅拌，向离心管中加入 1 mL 10 mg/mL 无脂肪酸 BSA 溶液，再用分离缓冲液定容至每只脑组织 5 mL。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 6,900×g 离心 10 分钟，应形成致密沉淀（图 1A，右图）。</li>
		<li>弃去上清液，将线粒体沉淀轻轻重悬于分离缓冲液中，分装至 0.5 mL 离心管中，液氮中保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质浓度测定
注意：蛋白质浓度采用 Lowry 等人16所述方法测定。
<ol>
	<li>Lowry 法测定所需溶液的配制
	<ol>
		<li>配制溶液 A：称取 0.4 g NaOH 和 2 g Na2CO3，溶于 80 mL 去离子水（DW）中，然后将溶液转移至 100 mL 容量瓶中，加去离子水定容至 100 mL。</li>
		<li>配制溶液 B：称取 0.1 g 酒石酸钠钾和 0.05 g CuSO4，溶于 8 mL 去离子水（DW）中，然后将溶液转移至 10 mL 容量瓶中，加去离子水定容至 10 mL。 
		注：溶液 A 和溶液 B 在 4 °C 下可稳定保存长达 6 个月。</li>
		<li>配制溶液 C：将 0.5 mL 福林酚试剂加入 7.5 mL 去离子水（DW）中。 
		注：溶液 C 需现用现配，并避光保存直至使用。</li>
		<li>通过将 0、20、40、60、80、100 和 120 µL 的 1 mg/mL BSA 溶液分别与适量去离子水（DW）混合，配制成终体积为 1000 µL、终浓度分别为 0、20、40、60、80、100 和 120 µg/mL 的 BSA 标准品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质浓度测定 
	注：为提高准确性，建议本步骤设三个重复。
	<ol>
		<li>向 96 孔板的每个孔中加入 50 µL 标准品溶液或线粒体匀浆液，随后加入 45 µL 溶液 A。然后将酶标板置于 50 °C 水浴中孵育 10 分钟。</li>
		<li>加入 5 µL 溶液 B，并在室温（RT）下避光孵育 10 分钟。</li>
		<li>加入 150 µL 溶液 C，并将酶标板置于 50 °C 水浴中孵育 10 分钟。</li>
		<li>将酶标板放入酶标仪中，于 650 nm 波长处测定各标准品和线粒体悬液的吸光度值。随后根据标准曲线计算线粒体样品中的蛋白质含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 线粒体膜完整性测定
注意：通过在加入Triton X-100破坏膜结构前后测定分离线粒体中苹果酸脱氢酶（MDH）的活性，来确认线粒体膜的完整性。
<ol>
	<li>用预冷的IB缓冲液将线粒体匀浆稀释至1 mg/mL，并分装到两个1.5 mL离心管中（通常每管195 μL线粒体）。</li>
	<li>向其中一管加入5 µL 20% (v/v) Triton X-100（用去离子水稀释），作为酶最大活性的阳性对照；向另一管加入5 µL去离子水作为对照，随后用搅拌器混匀。</li>
	<li>将离心管置于30 °C的恒温水浴中孵育10分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，使用固定角转子以16,000 × g 离心15分钟，使线粒体沉淀。</li>
	<li>小心收集上清液，用于后续采用标准分光光度法测定线粒体苹果酸脱氢酶（MDH）活性，具体方法见下节描述。</li>
	<li>按下式计算线粒体膜完整性： 
	<img alt="膜完整性公式，ΔOD340nm，百分比计算，生化分析方法。" src="/files/ftp_upload/59883/59883equ01v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
</ol>
4. MDH 活性测定
注意：MDH 活性测定采用 Sottocasa 等人所述的分光光度法进行17。
<ol>
	<li>MDH 活性测定所需溶液的制备
	<ol>
		<li>制备 50 mM Tris-HCl 溶液（pH = 7.5）：在去离子水中配制 7.9 mg/mL 的 Tris-HCl 溶液，并在 25 °C 下用 1.0 M NaOH 将 pH 调至 7.5。</li>
		<li>制备 50 mM 草酰乙酸溶液：使用草酰乙酸在 Tris-HCl 中配制 6.6 mg/mL 的溶液。 
		注意：该溶液在溶解后不稳定，应于使用前立即配制。</li>
		<li>制备 10 mM β-NADH 溶液：使用 β-NADH 在 Tris-HCl 中配制 7.81 mg/mL 的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MDH 活性测定 
	注意：1.0 mL 反应体系中的最终测定浓度为 50 mM Tris-HCl、5 mM 草酰乙酸和 0.1 mM β-NADH。
	<ol>
		<li>将分光光度计设定为 25 °C 和 340 nm。向空白比色皿中加入 890 µL Tris-HCl 缓冲液、100 µL 草酰乙酸溶液和 10 µL NADH 溶液；向样品比色皿中加入 880 µL Tris-HCl 缓冲液、100 µL 草酰乙酸溶液和 10 µL NADH 溶液。</li>
		<li>将比色皿在分光光度计中孵育 3–4 分钟，并以空白对照调零。</li>
		<li>然后向样品比色皿中加入 10 µL 线粒体匀浆液（1 mg/mL），立即颠倒混匀，并记录 340 nm 处因 NADH 氧化引起的吸光度在 1 分钟内的下降值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 体外α-突触核蛋白、牛胰岛素和HEWL纤维形成
<ol>
	<li>蛋白质制备
	<ol>
		<li>α-突触核蛋白： 
		注意：重组α-突触核蛋白的表达与纯化参照Hoyer等人的方法18并稍作修改，α-突触核蛋白的纯度通过SDS-PAGE确认。
		<ol>
			<li>将纯化的α-突触核蛋白在磷酸盐缓冲液（PBS）中透析过夜。</li>
			<li>使用275 nm处的消光系数5600 M-1 cm-1测定蛋白浓度19。</li>
			<li>将蛋白分装至1.5 mL离心管中，-80 °C保存备用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>牛胰岛素与HEWL：
		<ol>
			<li>提供牛胰岛素和HEWL。</li>
			<li>将每种蛋白溶解于50 mM甘氨酸缓冲液（pH = 1.6；用HCl调节pH）中。</li>
			<li>使用276 nm和280 nm处的消光系数分别为1.0和2.63（对应1.0 mg/mL）测定牛胰岛素和HEWL的浓度20,21。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淀粉样纤维化诱导
	<ol>
		<li>淀粉样纤维化溶液的制备：
		<ol>
			<li>制备硫磺素T（ThT）缓冲液：称取0.3 g NaH2PO4，溶于80 mL去离子水（DW）中，调节pH至6.5，再加去离子水定容至100 mL。</li>
			<li>制备ThT储存液（5 mM）：称取1.6 mg ThT，溶于1 mL ThT缓冲液中，经0.22 μm滤膜过滤，避光4 °C保存备用。 
			注意：该溶液可在4 °C保存最多4周。</li>
			<li>制备ThT工作液（1 mM）：将200 µL ThT储存液（5 mM）加入800 µL ThT缓冲液中。 
			注意：该溶液可在4 °C保存最多1周。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>体外α-突触核蛋白淀粉样纤维形成：
		<ol>
			<li>向1.5 mL离心管中加入294 µL蛋白溶液（200 μM）和6 µL ThT工作液（1 mM），随后进行搅拌。</li>
			<li>将离心管置于恒温混匀仪中，37 °C、800 rpm持续搅拌孵育4天。</li>
			<li>在固定时间间隔取10 µL孵育样品，加入490 µL ThT缓冲液，充分混匀后室温孵育5分钟。</li>
			<li>设定荧光分光光度计的激发和发射狭缝宽度分别为5 nm和10 nm，激发波长为440 nm，发射波长为485 nm，测定ThT荧光强度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>体外牛胰岛素淀粉样纤维形成：
		<ol>
			<li>向1.5 mL离心管中加入637 µL蛋白溶液（250 µM），随后加入13 µL ThT工作液（1 mM），并进行搅拌。</li>
			<li>向透明底96孔板的每孔中加入含20 µM ThT的蛋白溶液（250 µM）200 µL，并用透明封口膜密封。</li>
			<li>将96孔板放入荧光酶标仪中，57 °C孵育，不进行震荡。</li>
			<li>每30分钟测定一次ThT荧光，激发波长440 nm，发射波长485 nm，持续12小时。 
			注意：每次测定前震荡5秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>体外HEWL淀粉样纤维形成：
		<ol>
			<li>向透明底96孔板的每孔中加入含20 µM ThT的蛋白溶液（1 mM）200 µL，并用透明封口膜密封。</li>
			<li>将96孔板放入荧光酶标仪中，57 °C孵育，不进行震荡。</li>
			<li>每2小时测定一次ThT荧光，激发波长440 nm，发射波长485 nm，持续4天。 
			注意：对于上述三种蛋白，淀粉样纤维的形成均通过原子力显微镜确认（图2B）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 使用淀粉样纤维处理线粒体、MDH释放检测及ROS测定
<ol>
	<li>分离线粒体与淀粉样纤维共孵育
	<ol>
		<li>开启离心机和水浴锅，并设定至 4 °C 和 30 °C分别。</li>
		<li>使用IF将线粒体匀浆稀释至终浓度为1 mg/mL。</li>
		<li>准备两组含有线粒体匀浆的1.5 mL离心管（一组用于MDH释放检测，另一组用于线粒体ROS测定）。</li>
		<li>加入新鲜或淀粉样纤维形式的α-突触核蛋白、牛胰岛素或溶菌酶（终浓度为 5 µM, 10 µM, 20 µM，以及 25 µM；使用PBS或甘氨酸缓冲液作为对照）加入线粒体匀浆中（终体积 = 200 µL）（参见 表1, 表2，以及 表3）随后用移液管轻轻搅拌溶液。 
		注意：在MDH释放实验中，使用Triton X-100（终浓度为0.5% [v/v]）作为阳性对照，以检测最大酶释放量。</li>
		<li>将含有线粒体悬液的试管置于设定为温水浴的环境中孵育 30 分钟 30 °C.</li>
		<li>按照第6.2和6.3节所述，检测线粒体MDH的释放及ROS含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体MDH释放实验
	<ol>
		<li>将孵育后的线粒体匀浆在16,000 x g条件下离心 g 孵育15分钟，然后小心收集上清液，用于按照第4节所述方法检测线粒体MDH的活性。</li>
		<li>按下式计算MDH释放量占最大效应（Triton X-100）的百分比：</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="MDH释放公式，Triton X-100，实验信号分析方程，科学计算。" src="/files/ftp_upload/59883/59883equ02v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">
<ol start="3">
	<li>线粒体活性氧检测 
	注意：线粒体活性氧含量使用对氧化敏感的荧光前体二氢二氯羧基荧光素二乙酸酯（DCFDA）进行测定22。
	<ol>
		<li>准备用于线粒体活性氧检测的溶液。将DCFDA溶于甲醇中配制成50 µM溶液（现配现用），并将琥珀酸溶于去离子水（DW）中配制成200 mM溶液。</li>
		<li>取191 µL已孵育的线粒体匀浆液加入96孔板的每个孔中，随后加入4 µL的50 µM DCFDA溶液（终浓度为1 µM）和5 µL的200 mM琥珀酸溶液（终浓度为5 mM）。</li>
		<li>将96孔板置于30 °C的恒温水浴中孵育30分钟，并轻轻搅拌。</li>
		<li>将96孔板放入荧光酶标仪中，设置激发波长为485 nm，发射波长为530 nm，测定荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 统计分析
<ol>
	<li>所有实验至少重复 2 到 3 次，每次设三个复孔，并进行适当的统计学检验。本研究结果以均值 ± 标准差表示，采用配对 Student's t-检验计算统计学显著性。*p &lt; 0.05；**p &lt; 0.01 表示差异具有统计学意义（P 值小于 0.01 和 0.05）。</li>
</ol>

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<li>Oladzad Abbasabadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+membrane+integrity+induced+by+amyloid+aggregates+arising+from+variants+of+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

大量实验结果支持以下假说：纤维状聚集体的细胞毒性与其同生物膜相互作用并使其通透的能力密切相关4,5。然而，大多数数据基于人工脂质双层膜，而人工膜未必能反映生物膜的内在特性，因为生物膜是包含多种磷脂和蛋白质的异质性结构。本文以脑线粒体作为体外生物膜模型，描述了一种在膜水平上研究纤维状聚集体细胞毒性的方法。
实验过程中，需迅速操作并将所有物品保持在冰上，以制备膜结构完整的功能活性线粒体。此外，线粒体浓度（基于总蛋白测定）是影响膜与淀粉样纤维相互作用的重要因素，因此在整个实验方案中必须保持恒定。本研究中所用的线粒体制剂包含突触和非突触来源的线粒体。若需制备纯化的非突触线粒体，应使用40%、23%和15%（v/v）的密度梯度培养基&#160;，具体方法如Sims和Anderson14所述。由于线粒体是一种膜结构明确的细胞器，可作为研究淀粉样蛋白在膜水平诱导细胞毒性机制（特别是与神经退行性疾病相关）的极具价值的生物模型系统。本实...

与淀粉样蛋白相关的疾病，称为淀粉样变性疾病，是一大类由不溶性蛋白质沉积物出现在不同组织和器官中所定义的疾病1,2。其中，神经退行性疾病是最常见的类型，其特征是蛋白质聚集体出现在中枢或周围神经系统中2。尽管已有多种机制被提出参与淀粉样蛋白聚集体的毒性作用3，但越来越多的证据表明，细胞膜的破坏和通透化是淀粉样蛋白病变的主要机制4,5。除了质膜外，细胞内细胞器（例如线粒体）也可能受到影响。
有趣的是，越来越多的证据表明，线粒体功能障碍在包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病的发病机制中起着关键作用6,7。与此相关，大量研究报告指出，淀粉样β肽、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白以及与肌萎缩侧索硬化症相关的突变SOD1蛋白会结合并在线粒体上聚集8,9,10,11。目前认为，淀粉样蛋白聚集体引起膜通透化的机制可能是通过形成离散的通道（孔道），或通过类似去垢剂的非特异性机制实现的5,12,13。值得注意的是，这些结论大多基于使用磷脂模型体系的研究报告，而直接针对生物膜中发生事件的研究则较为罕见。显然，这些人工脂双层并不一定能够反映生物膜的内在特性&#160;，包括线粒体膜在内的生物膜均为结构异质性体系，由多种多样的磷脂和蛋白质组成。
在本研究中，采用从大鼠脑组织中分离的线粒体作为体外生物学模型，用于检测由α-突触核蛋白（作为一种淀粉样变性蛋白）、牛胰岛素（作为与注射部位局部淀粉样变性相关的天然人胰岛素具有显著结构同源性的模型肽）以及鸡卵清溶菌酶（HEWL；作为研究淀粉样聚集的常用模型蛋白）所形成的淀粉样纤维的破坏作用。通过观察线粒体基质中苹果酸脱氢酶（MDH）的释放以及线粒体活性氧（ROS）水平的升高，进一步研究淀粉样纤维与线粒体膜之间的相互作用及其可能造成的膜损伤。

<table><tbody><tr><td>2&amp;prime;,7&amp;prime;二氯二氢荧光素二乙酸酯</td><td>Sigma</td><td>35845</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>默克</td><td>1012171000</td><td></td></tr><tr><td>黑色96孔板</td><td>康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色透明底96孔板</td><td>康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>基本不含脂肪酸的BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>晶莹透明封口胶带</td><td>康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO₄</td><td>Sigma</td><td>451657</td><td></td></tr><tr><td>透析袋（截留分子量 2 KDa）</td><td>Sigma</td><td>D2272</td><td></td></tr><tr><td>邓氏匀浆器</td><td>波特-埃尔维耶姆</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>荧光酶标仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Cary Eclipse VARIAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>福林</td><td>默克</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>断头台</td><td>伊朗制造</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>默克</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>鸡卵清溶菌酶（HEWL）</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>默克</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>草酰乙酸</td><td>Sigma</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>CS0030</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸钾钠</td><td>Sigma</td><td>217255</td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>analytik jena</td><td>SPEKOL 2000 型号</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>默克</td><td>1076871000</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫黄素T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>默克</td><td>1082191000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>QUELAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>QUELAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr></tbody></table>

淀粉样纤维与脑线粒体的相互作用及其对线粒体膜的通透化作用

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

越来越多的证据表明，膜通透化（包括线粒体等内部膜结构）是神经退行性疾病中淀粉样蛋白聚集体诱导毒性的常见特征和主要机制。然而，目前大多数关于膜破坏机制的研究均基于磷脂模型系统，直接针对生物膜水平上发生的事件的研究仍较为罕见。本文介绍了一种用于研究淀粉样蛋白在膜水平毒性机制的模型。在分离线粒体时，采用密度梯度介质以获得髓鞘污染最少的线粒体样品。在确认线粒体膜完整性后，利用大鼠脑线粒体作为体外生物模型，研究源自α-突触核蛋白、牛胰岛素和鸡卵清溶菌酶（HEWL）的淀粉样纤维与其相互作用。结果表明，纤维状组装体处理脑线粒体可导致不同程度的膜通透化及活性氧（ROS）含量升高。这提示淀粉样纤维与线粒体膜之间的相互作用具有结构依赖性。研究表明，淀粉样纤维的生物物理特性及其与线粒体膜的特异性结合可能为上述现象提供部分解释。

本方案描述了一种体外生物学模型，用于研究淀粉样纤维与大鼠脑线粒体之间的相互作用。在线粒体制备过程中，使用15%（v/v）密度梯度介质去除脑组织中的主要污染物——髓鞘14。如图1A所示，在30,700 × g 条件下离心后出现两条明显条带：第一条带主要成分为髓鞘（即条带1），第二条带则富含线粒体组分。
通过修改 Sims 和 Anderson14描述的方案，制备了含有突触和非突触线粒体的线粒体悬液。为制备纯化的非突触线粒体，Sims 和 Anderson 之前已详细阐述了该方案14。在离心的最后一步，加入10 mg/mL 无脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid-free BSA），以获得致密的线粒体沉淀（图 1A）。通过在使用 ...

本文提供了一种研究不同肽和蛋白质的天然形式、前纤维状结构及成熟淀粉样纤维与来自不同组织及脑区的分离线粒体之间相互作用的实验方案。

越来越多的证据表明，膜通透化（包括线粒体等内部膜结构）是一种常见特征和主要……

在本视频中，我们描述了一项利用大鼠脑线粒体作为体外生物模型，研究淀粉样蛋白在膜水平毒性机制的模型研究。尽管已有大量报告直接研究淀粉样蛋白聚集体在磷脂模型系统中对膜扰动的机制，但这些研究尚未明确针对生物膜形成初期的事件。在本视频中，我们以α-突触核蛋白的淀粉样纤维为研究对象，分析大鼠脑线粒体膜作为体外生物模型。我们认为，线粒体作为一种膜结构特征明确的细胞器，可为与神经退行性疾病相关的膜水平淀粉样蛋白细胞毒性的分子机制研究提供一个极为有用的生物学模型系统。使用小型动物断头器将大鼠断头，并在断头后一分钟内从颅腔中取出大脑，以尽量减少线粒体特性可能发生的降解。操作过程中需迅速进行，并在整个实验过程中将所有材料保持在冰上。用 30 毫升分离缓冲液清洗组织两次。转移至含有冷分离缓冲液的烧杯中，用剪刀将脑组织充分剪碎。将组织悬液转移至 20 毫升预冷的Dounce匀浆器中。使用电动研杵对组织块进行匀浆，上下研磨九次。每完成三次研磨后，将混合物置于冰上静置约30秒，以确保匀浆液保持低温。将匀浆液转移至预冷的离心管中，在4°C条件下以1,300 G离心3分钟。小心倾去上清液，并将其转移至预冷的离心管中。在4 °C条件下以21,000 ×g离心10分钟。弃去上清液，用移液器轻轻搅拌，将沉淀重悬于密度梯度介质中。在4摄氏度下，使用固定角转子以30,700 G离心5分钟。用巴斯德吸管去除顶部积累的尖锐状物质，该物质主要含有髓鞘。向线粒体组分中加入8毫升分离缓冲液，同时用吸管轻轻搅拌混合物。在4°C、16,700 G条件下离心10分钟。小心移除上清液，保留底部松散的沉淀物不受扰动。向离心管中加入1毫升浓度为10毫克/毫升的无脂肪酸BSA，同时用移液器枪头轻轻搅拌混合物。加入分离缓冲液，定容至五毫升。在4°C条件下以6,900 G离心10分钟。此步骤应产生一个坚实的沉淀。弃去上清液，并用预冷的分离缓冲液轻轻重悬线粒体沉淀。用预冷的分离缓冲液将线粒体匀浆稀释至1 mg/mL，分装至两个1.5 mL离心管中，每管通常加入195 µL线粒体悬液。向其中一管加入5 µL 20%（体积比）Triton X-100作为酶最大活性的阳性对照，向另一管加入5 µL去离子水作为对照，随后用搅拌器混匀。将试管置于30 °C的温水浴中孵育10分钟。在4 °C条件下，使用固定角转子以16,000 ×g离心15分钟，沉淀线粒体。小心收集上清液，用于通过下一部分所述的标准分光光度法测定线粒体苹果酸脱氢酶活性。按如下方法计算线粒体膜的完整性。测定苹果酸脱氢酶活性时，分别向空白组和样品检测组比色皿中加入890微升和880微升的50毫摩尔Tris-HCl缓冲液，随后加入100微升50毫摩尔的草酰乙酸以及10微升10毫摩尔的β-NADH。将比色皿放入分光光度计中，以空白组为参比进行测定。向样品比色皿中加入10微升线粒体匀浆（1毫克/毫升），立即通过倒置混匀。记录340纳米处因NADH氧化导致的吸光度在1分钟内的下降值。对于α-突触核蛋白淀粉样纤维化，向每个1.5毫升离心管中加入294微升、200微摩尔的蛋白溶液。然后加入6微升、1毫摩尔的硫黄素T（ThT）溶液。混匀溶液后，将离心管置于恒温混匀仪中，在37°C、800转/分钟持续振荡条件下孵育。对于牛胰岛素淀粉样纤维化实验，向1.5毫升离心管中加入637微升浓度为250微摩尔的蛋白质溶液。然后加入13微升浓度为1毫摩尔的ThT溶液，随后进行搅拌。将200微升蛋白质溶液分装至透明底96孔板的每个孔中。使用透明封板膜密封反应板。将反应板放入Cytation 5荧光酶标仪中。每30分钟检测一次ThT荧光，持续12小时。采用440纳米激发波长和485纳米发射波长。选择待测孔。每次测量前振荡培养板5秒钟。将温度设置为57摄氏度，不进行振荡。准备两组含有线粒体匀浆的1.5毫升离心管，一组用于MDH释放检测，另一组用于线粒体ROS测定。向线粒体匀浆中加入新鲜或淀粉样纤维形式的α-synuclein、牛胰岛素或鸡卵清溶菌酶的等分试样，随后轻轻吹打混匀。将含有线粒体悬液的试管置于30摄氏度的温水浴中孵育30分钟。进行苹果酸脱氢酶释放实验时，将孵育后的线粒体匀浆在16,000 G条件下离心15分钟。小心收集上清液，用于检测线粒体MDH活性，具体方法见方案第四部分。按如下方法计算MDH的释放量。用于线粒体ROS检测时，将191微升孵育后的线粒体匀浆加入96孔板的每个孔中，再加入4微升50微摩尔的DCFDA。然后加入 5 µL 的 200 mM 琥珀酸。将酶标板置于 30 °C 的温水浴中，轻轻搅拌孵育 30 分钟。将酶标板放入 Cytation 5 荧光酶标仪中，按照方案部分的说明测定荧光强度。通过在加入Triton X-100破坏膜结构并释放酶前后，测定分离线粒体中的苹果酸脱氢酶（MDH）活性，评估线粒体膜的完整性。如图所示，我们通常发现线粒体制剂的完整性约为93%。采用硫黄素T（ThT）荧光法检测淀粉样纤维的生长情况。三种蛋白质的淀粉样纤维化曲线均呈现典型的S型模式，分别在约96小时、12小时和96小时达到平台期，对应α-突触核蛋白、牛胰岛素和鸡卵清溶菌酶，提示形成了淀粉样纤维，这一结果通过原子力显微镜（AFM）测量得到了进一步证实。通过检测线粒体苹果酸脱氢酶（MDH）的释放以及线粒体活性氧（ROS）水平，研究了淀粉样纤维可能引起的线粒体膜通透化及损伤。如左侧图所示，将α-突触核蛋白淀粉样纤维添加至线粒体后，观察到MDH显著释放。尽管胰岛素纤维可检测到轻微的释放，但鸡卵清溶菌酶纤维则被发现无效。右图显示了淀粉样纤维对线粒体活性氧含量的影响。在加入鸡卵清溶菌酶或胰岛素淀粉样纤维后，线粒体活性氧未见显著升高，而经α-突触核蛋白纤维处理后，脑线粒体中的活性氧含量显著增加。本视频介绍了一项关于腓骨聚集体在膜水平上细胞毒作用机制的模型研究，展示了来源于不同蛋白质的淀粉样纤维如何导致不同程度的膜损伤和通透化。尽管某些关于淀粉样纤维及其特异性结合膜的研究主题似乎表明其具备与膜相互作用并引起膜失稳及后续扰动的能力。观看本视频后，您将能够研究不同肽段的天然形式、前纤维态及成熟淀粉样纤维与来自不同组织或脑部不同区域的分离线粒体之间的相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

淀粉样蛋白纤维蛋白的相互作用和脑线粒体的膜渗透

阿尔茨海默病的一个特征是Aβ1-42肽水平升高。本文提供了一种合成Aβ1-42寡聚体的实验方案，该寡聚体可损害海马区的长时程增强作用（Long-Term...

制备寡聚态β-淀粉样蛋白1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

通过渗透泵输注抗体治疗可抵消慢性β-淀粉样蛋白寡聚体灌注动物模型中的神经退行性变

本文介绍了一种改良的滚管法，可用于对啮齿类动物脑片进行长期培养，并在光刻蚀盖玻片上实现精确复位的间歇性高分辨率成像。该方法能良好维持神经元的存活率和脑片的形态结构。文中还展示了利用该完全封闭系统，结合病毒实现细胞类型特异性表达的应用实例。...

封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

本方案描述了如何从合成肽制备Aβ寡聚体 体外...

A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

基于基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）的分子成像可实现对生物样本中多种分析物的同步定位。本文介绍了一种利用MALDI-IMS检测和可视化阿尔茨海默病及脑淀粉样血管病样本脑组织中β淀粉样蛋白的实验方案。...

利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

本文介绍了两种可单独或联合使用的方法，用于分析β-淀粉样蛋白对纤维蛋白凝块结构的影响。其中包括一种制备凝块的方案 体外...

通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

本方案介绍了一种用于培养SH-SY5Y细胞和原代大鼠海马神经元的增殖、分化与染色的工作流程，旨在通过受激发射损耗（STED）显微镜对线粒体超微结构进行可视化与分析。...

利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

此处，我们描述通过增强或维持线粒体相关内质网膜（MAMs）组成型稳定因子的轴突运输速率来进行测量的方法 实时监测阿尔茨海默病（AD）神经元中神经毒性β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成，作为衡量线粒体相关内质网膜（MAM）稳定性的直接且定量的指标，并助力AD治疗药物的开发。...

阿尔茨海默病（AD）神经模型中线粒体相关内质网膜（MAM）稳定性的定量分析

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

探索淀粉样蛋白纤维与大鼠脑线粒体相互作用的机制，研究其对线粒体膜的渗透作用。该方法为神经退行性疾病中淀粉样蛋白毒性研究提供了可靠的体外模型。

淀粉样纤维与脑线粒体的相互作用及其对线粒体膜的通透化作用

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