淀粉样纤维与脑线粒体的相互作用及其对线粒体膜的通透化作用

在本视频中，我们描述了一项利用大鼠脑线粒体作为体外生物模型，研究淀粉样蛋白在膜水平毒性机制的模型研究。尽管已有大量报告直接研究淀粉样蛋白聚集体在磷脂模型系统中对膜扰动的机制，但这些研究尚未明确针对生物膜形成初期的事件。在本视频中，我们以α-突触核蛋白的淀粉样纤维为研究对象，分析大鼠脑线粒体膜作为体外生物模型。

我们认为，线粒体作为一种膜结构特征明确的细胞器，可为与神经退行性疾病相关的膜水平淀粉样蛋白细胞毒性的分子机制研究提供一个极为有用的生物学模型系统。使用小型动物断头器将大鼠断头，并在断头后一分钟内从颅腔中取出大脑，以尽量减少线粒体特性可能发生的降解。操作过程中需迅速进行，并在整个实验过程中将所有材料保持在冰上。

用 30 毫升分离缓冲液清洗组织两次。转移至含有冷分离缓冲液的烧杯中，用剪刀将脑组织充分剪碎。将组织悬液转移至 20 毫升预冷的Dounce匀浆器中。

使用电动研杵对组织块进行匀浆，上下研磨九次。每完成三次研磨后，将混合物置于冰上静置约30秒，以确保匀浆液保持低温。将匀浆液转移至预冷的离心管中，在4°C条件下以1,300 G离心3分钟。

小心倾去上清液，并将其转移至预冷的离心管中。在4 °C条件下以21,000 ×g离心10分钟。弃去上清液，用移液器轻轻搅拌，将沉淀重悬于密度梯度介质中。

在4摄氏度下，使用固定角转子以30,700 G离心5分钟。用巴斯德吸管去除顶部积累的尖锐状物质，该物质主要含有髓鞘。向线粒体组分中加入8毫升分离缓冲液，同时用吸管轻轻搅拌混合物。

在4°C、16,700 G条件下离心10分钟。小心移除上清液，保留底部松散的沉淀物不受扰动。向离心管中加入1毫升浓度为10毫克/毫升的无脂肪酸BSA，同时用移液器枪头轻轻搅拌混合物。

加入分离缓冲液，定容至五毫升。在4°C条件下以6,900 G离心10分钟。此步骤应产生一个坚实的沉淀。

弃去上清液，并用预冷的分离缓冲液轻轻重悬线粒体沉淀。用预冷的分离缓冲液将线粒体匀浆稀释至1 mg/mL，分装至两个1.5 mL离心管中，每管通常加入195 µL线粒体悬液。向其中一管加入5 µL 20%（体积比）Triton X-100作为酶最大活性的阳性对照，向另一管加入5 µL去离子水作为对照，随后用搅拌器混匀。

将试管置于30 °C的温水浴中孵育10分钟。在4 °C条件下，使用固定角转子以16,000 ×g离心15分钟，沉淀线粒体。小心收集上清液，用于通过下一部分所述的标准分光光度法测定线粒体苹果酸脱氢酶活性。

按如下方法计算线粒体膜的完整性。测定苹果酸脱氢酶活性时，分别向空白组和样品检测组比色皿中加入890微升和880微升的50毫摩尔Tris-HCl缓冲液，随后加入100微升50毫摩尔的草酰乙酸以及10微升10毫摩尔的β-NADH。将比色皿放入分光光度计中，以空白组为参比进行测定。

向样品比色皿中加入10微升线粒体匀浆（1毫克/毫升），立即通过倒置混匀。记录340纳米处因NADH氧化导致的吸光度在1分钟内的下降值。

对于α-突触核蛋白淀粉样纤维化，向每个1.5毫升离心管中加入294微升、200微摩尔的蛋白溶液。然后加入6微升、1毫摩尔的硫黄素T（ThT）溶液。混匀溶液后，将离心管置于恒温混匀仪中，在37°C、800转/分钟持续振荡条件下孵育。

对于牛胰岛素淀粉样纤维化实验，向1.5毫升离心管中加入637微升浓度为250微摩尔的蛋白质溶液。然后加入13微升浓度为1毫摩尔的ThT溶液，随后进行搅拌。将200微升蛋白质溶液分装至透明底96孔板的每个孔中。

使用透明封板膜密封反应板。将反应板放入Cytation 5荧光酶标仪中。每30分钟检测一次ThT荧光，持续12小时。

采用440纳米激发波长和485纳米发射波长。选择待测孔。每次测量前振荡培养板5秒钟。

将温度设置为57摄氏度，不进行振荡。准备两组含有线粒体匀浆的1.5毫升离心管，一组用于MDH释放检测，另一组用于线粒体ROS测定。向线粒体匀浆中加入新鲜或淀粉样纤维形式的α-synuclein、牛胰岛素或鸡卵清溶菌酶的等分试样，随后轻轻吹打混匀。

将含有线粒体悬液的试管置于30摄氏度的温水浴中孵育30分钟。进行苹果酸脱氢酶释放实验时，将孵育后的线粒体匀浆在16,000 G条件下离心15分钟。小心收集上清液，用于检测线粒体MDH活性，具体方法见方案第四部分。

按如下方法计算MDH的释放量。用于线粒体ROS检测时，将191微升孵育后的线粒体匀浆加入96孔板的每个孔中，再加入4微升50微摩尔的DCFDA。

然后加入 5 µL 的 200 mM 琥珀酸。将酶标板置于 30 °C 的温水浴中，轻轻搅拌孵育 30 分钟。将酶标板放入 Cytation 5 荧光酶标仪中，按照方案部分的说明测定荧光强度。

通过在加入Triton X-100破坏膜结构并释放酶前后，测定分离线粒体中的苹果酸脱氢酶（MDH）活性，评估线粒体膜的完整性。如图所示，我们通常发现线粒体制剂的完整性约为93%。采用硫黄素T（ThT）荧光法检测淀粉样纤维的生长情况。

三种蛋白质的淀粉样纤维化曲线均呈现典型的S型模式，分别在约96小时、12小时和96小时达到平台期，对应α-突触核蛋白、牛胰岛素和鸡卵清溶菌酶，提示形成了淀粉样纤维，这一结果通过原子力显微镜（AFM）测量得到了进一步证实。通过检测线粒体苹果酸脱氢酶（MDH）的释放以及线粒体活性氧（ROS）水平，研究了淀粉样纤维可能引起的线粒体膜通透化及损伤。如左侧图所示，将α-突触核蛋白淀粉样纤维添加至线粒体后，观察到MDH显著释放。

尽管胰岛素纤维可检测到轻微的释放，但鸡卵清溶菌酶纤维则被发现无效。右图显示了淀粉样纤维对线粒体活性氧含量的影响。在加入鸡卵清溶菌酶或胰岛素淀粉样纤维后，线粒体活性氧未见显著升高，而经α-突触核蛋白纤维处理后，脑线粒体中的活性氧含量显著增加。

本视频介绍了一项关于腓骨聚集体在膜水平上细胞毒作用机制的模型研究，展示了来源于不同蛋白质的淀粉样纤维如何导致不同程度的膜损伤和通透化。尽管某些关于淀粉样纤维及其特异性结合膜的研究主题似乎表明其具备与膜相互作用并引起膜失稳及后续扰动的能力。观看本视频后，您将能够研究不同肽段的天然形式、前纤维态及成熟淀粉样纤维与来自不同组织或脑部不同区域的分离线粒体之间的相互作用。