Name: 制备和利用新鲜分离的人类分离器平滑肌细胞，用于9-苯酚敏感阳离子电流的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习从人膀胱组织中酶解分离逼尿肌平滑肌细胞的方法，并利用穿孔膜片钳技术记录TRPM4通道电流。该技术可用于验证9-菲酚等药物对离子通道的抑制作用，为膀胱生理学和药理学研究提供单细胞水平的实验平台。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）授予Georgi V. Petkov的R01DK106964和P20DK123971基金资助。作者感谢Viktor Yarotskyy博士和Sarah Maxwell女士对本文稿的审阅与宝贵意见。我们还衷心感谢南卡罗来纳医科大学（MUSC）和田纳西大学健康科学中心（UTHSC）泌尿外科的主治医师团队：Thomas Keane博士、Harry Clarke博士、Stephen Savage博士、Ross Rames博士、Sandip Prasad博士、Jonathan Picard博士、Christopher Ledbetter博士、Anthony Patterson博士，以及MUSC和UTHSC泌尿外科住院医师：Taylor Vaughan博士、Samuel Walker Nickles博士、Matthew Young博士、Erin Burns博士、Justin Ellett博士、Ryan Levey博士、Austin Younger博士、Mark Currin博士、Nima Baradaran博士、Olugbemisola McCoy博士、Tracy Tipton博士、Bryce Wyatt博士、Alyssa Greiman博士、Sarah Starosta博士、Aaron Bloch博士、Christine Callaway博士、Lucille Cox博士、Christian Dewan博士、Erin Heitman博士、Bradley Houston博士、Stephen Legg博士、Robert S. Libby博士、Cole Locklear博士、Kristen Marley博士、Monica O'Hanlon博士、Patrick Probst博士、Cynthia Sharadin博士、Elizabeth Tourville博士、Daniel Zapata博士，他们在人类组织样本采集过程中提供了重要帮助。

本文所述所有方法均已获得田纳西大学健康科学中心（美国田纳西州孟菲斯市，IRB# 17-05714-XP）和南卡罗来纳医科大学（美国南卡罗来纳州查尔斯顿市，IRB# 00045232）机构审查委员会的批准。经批准的程序允许从接受膀胱部分切除手术的患者供体中获取全层尿路膀胱标本（&#62;1 cm × &#62;1 cm），标本包含所有层次结构，包括黏膜、逼尿肌平滑肌、浆膜以及附着的血管和脂肪组织。患者供体为成年人（目前研究的年龄范围：25至87岁），性别不限，伴有或不伴有膀胱过度活动症症状（根据美国泌尿学会I-PSS评分41进行分类）。手术涉及多种医学状况，包括因尿路上皮癌和腺癌而进行的根治性膀胱切除术。在此类情况下，所采集的膀胱标本远离肿瘤部位。
1. DSM 组织的解剖及无黏膜 DSM 组织块的制备
<ol>
	<li>检查从手术室送至实验室的全层膀胱标本，标本应置于装有冷解离/消化液的 tightly sealed 容器中（DS 成分见图1和表2）。 
	注：标本通常在抵达实验室前已在冷DS中保存数小时至过夜。若需更长时间保存，应在DS（表2）中添加1 mM CaCl2。</li>
	<li>用预冷的DS冲洗人全层膀胱逼尿肌标本（包含黏膜层、逼尿肌层及浆膜层等所有层次），以去除附着的碎片和血液。</li>
	<li>将膀胱标本平铺于直径150 mm、盛有冰冻DS的圆形培养皿上，黏膜面朝上，浆膜面朝下，并用针固定于涂有硅胶对映体（材料表）的皿底（图1B）。</li>
	<li>使用显微剪刀和镊子进行锐性解剖，去除标本周围的脂肪组织、血管、上皮（尿路上皮）以及黏膜肌层。</li>
	<li>切取数块去除了黏膜的逼尿肌组织（长约2-3 mm，宽4-6 mm）（图1C）。</li>
</ol>
2. 酶解分离 DSM 组织块以获得新鲜分离的单个 DSM 细胞
<ol>
	<li>将3至6个DSM组织块放入含有1至2 mL预热（约37 °C）的含木瓜蛋白酶和二硫苏糖醇的DS溶液（DS-P，表2）的离心管中，在约37 °C条件下孵育30–45分钟，期间轻轻振荡管子（每10–15分钟一次）。 
	注意：为精确控制酶解反应的温度，可将装有组织块和酶溶液的离心管置于连接循环加热水浴的玻璃组织培养室（图1D）中，或置于高精度温控振荡水浴槽（图1E）中。</li>
	<li>移除离心管中的DS-P溶液，用冰冻的DS溶液短暂清洗DSM组织块，弃去冷DS溶液，保留DSM组织块沉于管底。</li>
	<li>向含有DSM组织块的离心管中加入1至2 mL含II型胶原酶的DS溶液（DS-C，表2），轻轻混匀，于约37 °C孵育25–40分钟，期间轻轻振荡管子（每10–15分钟一次）。</li>
	<li>弃去DS-C溶液，并用冰冻的DS溶液洗涤经酶处理的DSM组织块5–10次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，保留少量DS溶液于管内，用火焰抛光的巴斯德移液管反复吹打数次，以释放单个DSM细胞。</li>
	<li>取数滴含有分散DSM细胞的DS溶液滴加至玻璃底培养皿或盖玻片上，至少静置5分钟使细胞贴壁后，在显微镜下（使用20倍或40倍物镜）观察细胞状态。</li>
	<li>立即使用新鲜分离的DSM细胞进行电生理实验，或将其保存在含有DS溶液的离心管中，置于约4 °C（冰上或冰箱中）备用（通常在制备后8小时内使用）。 
	注意：同一批次制备的细胞质量可能存在差异，从活力良好的细胞到过度消化的死亡DSM细胞均有（图2）。若采用木瓜蛋白酶-胶原酶序贯消化法获得的不可行细胞比例过高，则应弃用该批次，并重新进行组织块消化，但需缩短孵育时间。若获得的DSM细胞数量过少，则在后续消化中应适当延长孵育时间。α-平滑肌肌动蛋白免疫染色阳性可确认DSM细胞的身份（图3）。</li>
</ol>
3. 采用两性霉素B穿孔式全细胞电压钳技术记录DSM细胞中电压阶跃诱导的阳离子电流
<ol>
	<li>用移液器将 0.25–1 mL 细胞悬液滴加到倒置显微镜载物台上的玻璃底培养皿中，使细胞贴附于玻璃底部。</li>
	<li>孵育至少 45 分钟后，移除灌流液 DS，并通过重力驱动的灌流方式用 E 溶液（表 2）替换：进液管路缓慢将 DS 替换为新溶液，同时连接至真空废液容器的出液管路移除腔室中的液体，防止溢出。注意，E 溶液含有四乙基铵（TEA+）和铯（Cs+）离子，用于抑制 K+ 电流。</li>
	<li>将两性霉素 B 配制成二甲基亚砜（DMSO）工作储备液（每 10 µL DMSO 中含 1 mg 两性霉素 B）。为充分溶解两性霉素粉末，需进行超声处理（至少 15 分钟）并充分涡旋混合。 
	注意：此步骤通常耗时少于 10 分钟。在 1.5 mL 微离心管中将 3–4 mg 两性霉素 B 溶解于 30–40 µL DMSO 效果良好。较大剂量的两性霉素 B 需要更多 DMSO 溶剂，通常导致混合时间延长且管中残留的两性霉素 B 固体颗粒难以完全溶解。</li>
	<li>将两性霉素 B 储备液溶解于移液管溶液（溶液 P，表 2）中，终浓度为 200–500 µg/mL。此步骤需长时间高强度超声和涡旋（高速设置 8–10/10），每步约 30 至 60 分钟，以确保充分混匀并防止两性霉素 B 在移液管溶液中形成沉淀。 
	注意：两性霉素 B 会随时间沉淀，且对光敏感。含两性霉素 B 的工作移液管溶液需检查其溶解性，填充移液电极前手动混匀，并避光保存。</li>
	<li>拉制多个膜片电极，对电极尖端进行火焰抛光，并根据需要用电工蜡涂覆尖端。</li>
	<li>将不含两性霉素 B 的移液管溶液（溶液 P，表 2）短暂浸入电极尖端，以填充电极尖端部分。</li>
	<li>用含两性霉素 B 的相同移液管溶液从后方填充电极。</li>
	<li>将电极安装至连接于膜片钳放大器头级的电极夹持器上。</li>
	<li>使用显微操作器，将电极置于细胞外液表面下方，使电极尖端刚好浸入液面之下。</li>
	<li>在电压钳模式下，将保持电位设为 0 mV，并使用商用放大器上的移液电极偏移调节旋钮（材料表）将电流调至 0 pA。</li>
	<li>使用商用采集软件的“膜测试”窗口/功能（材料表）测定电极电阻。可通过点击 工具&#62;膜测试&#62;播放 或软件中的快捷图标启动该功能。测得的电极电阻应在 2 至 5 MΩ 范围内。 
	注意：商用采集软件提供的膜测试功能或放大器上的封接测试选项，均可通过重复施加电压阶跃来监测电极电阻。</li>
	<li>使用显微操作器将电极向选定的 DSM 细胞推进的同时，持续监测电极电阻（图 4A）。 
	注意：一个可接受的 DSM 细胞应呈现纺锤形的细长形态，细胞周围有清晰的晕圈，边缘分明，并具有半收缩性（蛇形）外观。</li>
	<li>当电极接触细胞表面时——表现为膜测试功能测得的电极电阻迅速升高——通过连接管路对电极夹持器施加轻柔而快速的负压，形成吉欧封接（giga-seal）。这会在电极尖端产生负压，将细胞膜吸入电极，有助于在电极与质膜之间形成吉欧封接或非常紧密的接触（图 4B）。</li>
	<li>一旦形成吉欧封接，通过调节商用放大器上的快速和慢速旋钮补偿移液电极电容，并使用膜测试功能监测吉欧封接的稳定性（漏电流）。</li>
	<li>给予足够时间（通常为 30–60 分钟），使两性霉素 B 沿移液管向下扩散并插入质膜，形成主要对单价阳离子具有选择性的孔道。在此期间，继续使用膜测试功能监测吉欧封接状态。随着细胞穿孔程度增加，电容瞬变的幅度也随之增大（比较 图 4B 与 图 4C，分别显示无穿孔和有效穿孔状态），该变化可通过膜测试功能测得。</li>
	<li>当膜片穿孔达到最佳状态（表现为串联电阻稳定，通常低于 50 MΩ）时，调节放大器上的细胞电容和串联电阻旋钮，消除电容瞬变。此时也可进行串联电阻补偿（图 4D）。</li>
	<li>一旦观察到由指定刺激方案诱发的稳定电压阶跃阳离子电流，即可通过灌流施加待测化合物或生理条件，并使用商用采集软件记录对照、测试条件及洗脱阶段（如可行）的反应。
	<ol>
		<li>采用常规电压阶跃方案记录电流：将 DSM 细胞钳制在 -64 或 -74 mV，以 10 mV 为增量，在 -94 至 +96 或 +106 mV 范围内施加持续 400 或 500 ms 的电压阶跃，随后返回保持电位。 
		注意：膜电位值已根据 14 mV 的液接电位进行校正（使用 P 和 E 溶液，表 2）。液接电位可通过商用采集软件（材料表）中的（工具&#62;液接电位）功能输入溶液离子浓度后计算获得。也可使用斜坡电压方案获取电流记录。</li>
		<li>实验过程中以约每分钟连续运行一次电压方案，记录加药前对照、测试条件及洗脱阶段的电流。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析与可视化
<ol>
	<li>通过点击 文件&#62;打开数据 并 选择要打开的文件，在商业数据分析软件（材料表）中打开对照、测试条件和洗脱阶段的记录文件。 
	注意：通常每个条件下选择三个文件（每个文件包含单次实验协议的一组轨迹）进行打开和分析。随后对响应进行平均，以获得每个条件下的平均响应。用于数据采集的软件包含一个选项，可自动收集用户指定的多次测试运行，并将其平均为单个输出文件，可作为替代方案使用。</li>
	<li>获取每个电压下当前轨迹在最后 200 毫秒内的平均响应；所选的时间区间反映了电压阶跃电流激活的稳态水平。请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>在商业分析软件（材料表）中选择一个待分析的文件。 
		注意：软件会将最近导入的文件置于其活动显示窗口中。打开的文件会显示一系列通过电压阶跃协议获得的重叠轨迹。默认情况下，活动窗口内显示四个光标（显示所选轨迹的 x 和 y 值）。</li>
		<li>通过将光标 2 定位在 400 或 500 毫秒电压阶跃的结束位置，将光标 1 定位在该时间点前 200 毫秒处，以设定 200 毫秒的分析区间。</li>
		<li>通过点击 分析&#62;快速作图&#62;IV（或 IV 快捷图标），获取每个电压下的响应（在生成数据前的提示窗口中，确认 y 轴（电流）信号的区域选项已选择 &#34;光标 1..2&#34; 和 &#34;平均值&#34;）。点击 确定 生成 I-V 曲线图，并将数据放入结果列工作表中，可通过访问 窗口&#62;结果 查看。</li>
		<li>通过重复步骤 4.2.1 - 4.2.3 分析其他文件。点击 分析&#62;快速作图&#62;IV 或 IV 图标 快捷方式，在处理轨迹时选择 追加 而非 替换，以将额外数据添加到结果工作表中。</li>
		<li>通过选择感兴趣的列并按 CTRL+C 复制和 CTRL+V 粘贴，将数据复制到电子表格中。通过点击 文件&#62;另存为，以 (*.rlt) 格式在商业分析软件（材料表）中保存结果工作表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每个细胞，将三种条件下的响应归一化为加药前对照组最大电压阶跃的响应值（根据公式：响应 / 响应对照-最大），并将响应绘制成电流（或电流密度）与电压关系图（图 6）。
	<ol>
		<li>在电子表格处理软件中，确定对照、测试条件（本例中为 9-phenanthrol）和洗脱阶段在每个电压阶跃下的平均响应，单位为电流（pA）或电流密度（pA/pF）。</li>
		<li>将每种条件（对照、9-phenanthrol 和洗脱）在每个电压下的值除以加药前对照组在最高电压（+96 mV，见 图 6）下获得的最大响应值，计算归一化响应，公式如下：条件(x)的归一化响应 = 响应(x) / 响应对照-最大(x)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行汇总分析，将数据整理成可轻松复制到图形化程序（如 GraphPad Prism）中用于可视化的格式。</li>
</ol>

本文所述方法介绍了利用酶消化法从全层人类膀胱标本中分离具有活性的新鲜逼尿肌（DSM）细胞，以及采用两性霉素B穿孔式膜片钳技术记录对TRPM4通道抑制剂9-苯并蒽醇敏感的全细胞阳离子电流的具体步骤。该酶消化法采用两步连续处理流程，本文称之为连续木瓜蛋白酶-胶原酶消化法。首先，在无钙条件下，逼尿肌组织经木瓜蛋白酶和二硫苏糖醇（一种酶稳定剂）处理，以降解细胞外基质并软化组织结构。随后，组织被转移至含钙溶液中，并进一步用胶原酶消化，以实现单个平滑肌细胞的充分解离。分离后的细胞可用于电生理实验，通过穿孔式膜片钳配置记录全细胞阳离子电流，并评估9-苯并蒽醇对TRPM4通道介导电流的抑制作用。该方法可为研究人类逼尿肌细胞中TRPM4通道的功能及其在膀胱过度活动症等病理生理过程中的作用提供可靠的技术支持。

逼尿肌细胞，TRPM4通道，9-苯并蒽醇，两性霉素B，穿孔式膜片钳，酶消化法，木瓜蛋白酶，胶原酶，二硫苏糖醇，人类膀胱组织2+无血清条件下进行，第二步在低钙存在下加入II型胶原酶2+进行木瓜蛋白酶消化时采用低Ca的原理2+ 平滑肌细胞中的条件研究可追溯到20世纪80年代末。用木瓜蛋白酶制备的新生分离颈动脉平滑肌细胞呈细长形，具有活性（拒染台盼蓝）并能对收缩刺激产生反应（胞内钙水平升高）2+ 和组胺）65多年后，该方法被应用于DSM细胞的制备（参见 表1）。选择胶原酶II型而非其他类型，是由于其相对较高的蛋白水解活性，特别适合消化包括膀胱逼尿肌（DSM）在内的平滑肌组织。事实上，仅使用胶原酶处理即可获得单个DSM细胞，尽管需要较长时间的酶消化（≥60分钟）。53,54. 由于胶原酶活性依赖于 Ca2+ 且该酶在 Ca 存在下无活性2+无钙条件下，DSM 组织块的最佳酶消化需要钙离子的存在2+ 66。在本实验中，DS-C 含有 100–200 µM [Ca2+] (表2）。酶处理后，用不含酶或Ca的冷DS轻柔洗涤消化后的DSM组织块数次2+ 以去除与组织结合的酶。冰冷的DS有助于维持DSM细胞的完整性，并抑制残留木瓜蛋白酶或胶原酶的酶活性。最后一步中，使用火焰抛光的巴斯德移液管对经酶处理的DSM组织块进行吹打，以释放单个DSM细胞。DSM细胞可立即转移至记录槽中用于膜片钳实验或其他类型的实验，或暂时保存在冰上的DS溶液中，供同一天内后续使用（通常在制备后8小时内，但细胞活力可维持长达24小时）。
我们确定了成功获取单个膀胱逼尿肌（DSM）细胞时需要考虑的几个重要因素。首先是人体膀胱逼尿肌组织样本来源的质量。为了最大限度地保持组织完整性，从开放性膀胱手术中获取的DSM样本应尽快置于冰冻的解离液（DS）中，并始终保持在低温环境中。具体而言，在从患者体内手术取出后，膀胱组织样本应立即放置在手术室内已准备好的侧台。随后对整个标本（通常在根治性或单纯性膀胱切除术中获得）进行大体检查并切开。经过肉眼检查后，从远离肿瘤、大体上未受累的区域切取一块全层膀胱组织，并立即放入含有冷（约4 °C）解离液（DS）（表2）的离心管（50或100 mL）中，然后盖紧盖子。由于组织采集是计划内的操作，因此在手术开始时即通知手术室人员和辅助工作人员，确保在组织取出时所需材料已在手术室备妥。这些预防措施，加上常规且重复性的处理步骤，可使组织从取出到放入含DS溶液的冷藏容器之间的热缺血时间控制在5分钟以内。随后将容器置于冰箱中或放入装有冰块的冷藏箱内，以维持低温环境，并在冰冻条件下运送至实验室。一旦样本到达实验室，立即开始组织解剖和酶解离步骤。很难预测某一特定的膀胱逼尿肌组织样本在酶解离后是否能获得高质量的DSM细胞，因此我们仍按标准流程进行酶解离操作。在许多实验中，我们课题组在进行电生理实验的同时，还会使用同一膀胱逼尿肌组织制备的肌条进行等长张力记录。我们发现，通常能够从那些成功获得可用于等长收缩研究的活性肌条的组织样本中，同时获得高质量的膀胱逼尿肌细胞（未发表观察结果）。
第二个因素与不同批次酶的变异性有关。我们观察到，无论是木瓜蛋白酶还是II型胶原酶，每次从供应商处收到新批次的酶时，其在消化液（DS）中用于组织消化的酶活性均可能存在差异。因此，我们常规对每一批新到的酶进行酶浓度和孵育时间的优化。为了尽量减少批次间变异的影响，我们会订购较大量同一批次的酶，并将其配制成大量储备液，分装为2 mL的等份，于约-20 °C保存，直至使用。然而，随着时间推移，冷冻储存的酶（储存时间长达2周）可能会逐渐丧失其酶活性。第三个变量是酶消化处理的温度。木瓜蛋白酶和II型胶原酶的酶活性均具有温度依赖性。木瓜蛋白酶和II型胶原酶在涵盖正常生理体温的温度范围内均表现出活性67,68。因此，我们力求将酶处理温度稳定维持在约37 °C，避免更高温度，以保护膀胱逼尿肌（DSM）细胞的完整性。第四个考虑因素是每次制备所得DSM细胞质量的变异性，其范围可从高活力（表现出优良的经典平滑肌特征）到不健康、过度消化的细胞。过长的酶孵育时间是导致获得大量受损细胞的主要原因之一。过度的酶处理还会破坏离子通道、受体和转运蛋白的蛋白质结构，从而对其功能产生不利影响。在解读通过酶法获得的新鲜分离细胞的实验结果时，应充分考虑这一因素。优化酶消化条件的目标是提高高活力细胞的比例。依赖较多活细胞的实验方法（如微阵列分析）相较于适用于较少细胞的实验（如单细胞膜片钳电生理记录或Ca2+成像），需要更严格的优化。在过去十年中，上述各项因素的考量一直指导着我们获取高质量单个DSM细胞的研究工作。
穿孔膜片钳技术作为电生理学研究的主要方法已应用超过二十五年。多篇文献详细阐述了该技术的操作要点69,70,71,72,73。细胞穿孔可通过两性霉素B（amphotericin-B）、制霉菌素（nystatin）、短杆菌肽（gramicidin）或β-七叶皂苷（β-escin）实现（参见参考文献32中对各试剂的概述）。相较于其他电生理学方法，穿孔膜片钳记录的主要优势在于能够保持细胞内原有的环境——包括细胞内Ca2+及信号分子（如cAMP、PKA、磷酸盐和磷酸二酯酶）——基本不变。因此，该技术特别适用于在接近生理条件下研究全细胞离子通道电流及其调控机制。需要注意的是，与传统的全细胞记录或单通道切除式膜片（内向外和外向外）记录等其他电生理方法不同，穿孔膜片钳无法精确控制细胞内成分。根据我们的经验，有三个因素通常对两性霉素B穿孔膜片钳实验的成功至关重要。第一是所选膀胱逼尿肌（DSM）细胞的质量。当DSM细胞活性良好，呈现半收缩状态（蛇形）、高对比度且表面光亮，并具有清晰的细胞边缘，同时紧密贴附于记录浴槽的玻璃底部时，形成吉欧姆（giga）密封和细胞穿孔相对容易。第二和第三个成功因素分别与两性霉素B的来源质量及其溶解效果有关（溶剂为二甲基亚砜/DMSO及细胞内电极液）。我们发现不同供应商在试剂来源和批次间存在差异。每天我们均需从粉末新鲜配制两性霉素B储备液，随后将其稀释至细胞内电极液中。这些步骤需要充分的超声处理和涡旋震荡。使用新鲜配制的含两性霉素B电极液，通常在形成吉欧姆密封后30分钟内即可实现成功的细胞穿孔（&#60;50 MΩ）。电极液中两性霉素B的浓度也需根据其批次和来源进行优化。在我们的实验条件下，电极液中两性霉素B的终浓度范围为200至500 µg/mL。由于两性霉素B对光敏感，其溶液需避光保存。利用两性霉素B穿孔膜片钳技术，我们课题组已在人、豚鼠、小鼠和/或大鼠的DSM细胞中记录到由电压阶跃诱导的K+、Ca2+及非选择性阳离子电流17,21,22,23,29,30,31,35,60。本文中，我们描述了在人DSM细胞中记录非选择性阳离子电流的实验条件。9-菲蒽醇（9-Phenanthrol）是一种TRPM4通道阻断剂，可减弱电压阶跃诱导的电流，支持TRPM4通道在调控DSM兴奋性中的作用。需要注意的是，通常在获得吉欧姆密封并开始穿孔后至少需要45分钟，才能记录到最佳且稳定的电压阶跃诱导的非选择性阳离子电流。电压斜坡（ramp）也可作为电压阶跃方案的替代方法30,64。然而，本文优先采用从超极化膜电位开始的电压阶跃方案而非斜坡方案，因为前者可最大程度减少电压依赖性失活的影响，并允许在电压阶跃持续期间对诱发电流进行平均处理，而斜坡方案则每个电压仅提供一个数据点。这一点尤其适用于人DSM细胞，因为其电流在电压阶跃过程中表现出可变的活动性（图5 和 图6）。两性霉素B穿孔膜片钳技术在鉴定DSM细胞及其他细胞类型特性方面发挥了关键作用，并将继续助力未来的新发现。此外，新鲜分离的单个DSM细胞也可成功用于常规膜片钳模式下的全细胞K+、Cl-和Ca2+电流测量、电流钳模式下的膜电位记录以及单通道记录，这已在我们先前的研究报告中得到证实23,29,35,64。
除了单细胞膜片钳技术外，还可以采用其他技术方法来研究 freshly isolated DSM 细胞，包括 Ca2+ 成像、RT-PCR/q-RT-PCR、免疫细胞化学、原位邻近连接实验以及基因组学方法（例如，微阵列、RNA-seq、CHIP-seq）15,18,30,33,34。随着单细胞转录组检测技术的不断发展并日益灵敏，我们预计未来将能够常规且特异性地将单个 DSM 细胞的电生理或药理学特性与其转录组/蛋白质组谱型相关联。这一目标将通过首先对 DSM 细胞进行电生理记录，随后提取其 mRNA 或蛋白质，并进行转录组/蛋白质组分析来实现。尽管此类方法已在非 DSM 细胞中进行过测试，但目前在技术上仍具挑战性，灵敏度尚不足以作为常规手段，并且仅限于少数选定基因产物的成功检测74。当在来自对照和患病患者供体的膀胱组织所获取的 DSM 细胞上开展功能与分子谱型关联研究时，将有助于深入理解驱动正常 DSM 功能、疾病发病机制的关键生理过程，并有助于发现有效的新型治疗策略。

逼尿肌平滑肌（DSM）细胞是膀胱中最丰富的细胞类型，分别通过舒张和收缩过程调控尿液的储存与排泄。DSM细胞形成平滑肌束，与邻近的结缔组织、神经末梢、间质细胞及其他细胞类型相互交织1。目前对DSM细胞在膀胱功能中作用的理解，是通过多层次整合研究方法实现的。每种实验方法——无论是基于体外分离的单个细胞、含有平滑肌束的离体/外植组织条带，还是体内检测（如细胞计数和排尿功能评估）——均能提供关于DSM生理学和药理学特性的独特且重要的信息（详见综述1,2,3,4,5,6）。然而，对分离单细胞所得结果的解释，可将结论明确归因于该单细胞类型本身。这一认识推动了建立一种可靠且可重复的方法，用于从全层膀胱组织标本中获取新鲜分离的DSM细胞。与其他许多细胞类型不同，平滑肌细胞难以被稳定培养，因其会丧失原有的表型特征，包括电生理和收缩特性的特异性改变7,8。这一事实进一步凸显了在具有生理活性的新鲜分离DSM细胞上开展研究的重要性。
在20世纪80年代末至90年代初，Isenberg的研究团队（德国）发表了一系列关于从豚鼠膀胱中新鲜分离的膀胱逼尿肌细胞（DSM细胞）的电生理学研究9,10,11,12,13（表1）。该方法突出了两个重要观察结果，有助于获得有活力的细胞，并为后续研究者提供了初步指导。这两个关键点是：1）在酶消化处理前，先用无Ca2+溶液/培养基对分离的DSM组织块进行预处理；2）使用含有胶原酶的溶液进行组织消化。这两个关键步骤已被整合到此后所有DSM细胞分离方法的改进版本中（表1）。目前，我们课题组采用两步连续的木瓜蛋白酶-胶原酶分离法。首先用含有木瓜蛋白酶的酶液处理DSM组织块，随后在同一溶液（DS，解剖/消化溶液）中用II型胶原酶进行消化。该方法可从多种物种中获得单个DSM细胞，包括豚鼠、猪、大鼠、小鼠，以及重要的人源组织（表1）。
单个DSM细胞可为多种分子生物学和生理学实验提供样本来源。迄今为止，通过免疫细胞化学或RT-PCR/qRT-PCR检测蛋白和mRNA表达，已发现多种离子通道的高表达水平，包括大电导电压门控和Ca2+-激活的（BK）、小电导Ca2+激活的 K+ 3型（SK3），电压门控K+ (Kv），L型电压门控Ca2+ (Cav），以及瞬时受体电位香草酸亚型4（TRPM4）通道和Na/Ca2+ 交换体14,15,16,17,18,19,20,21,22人们认为它们均能调控DSM的兴奋性以及细胞内Ca2+ 水平和收缩力。直接在豚鼠、小鼠、大鼠或人膀胱平滑肌细胞上进行的膜片钳电生理学方法，直接证明了L型Cav，Kv (Kv2.x. Kv7) SK、BK 和 TRPM4 通道17,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31采用的方法包括传统的全细胞电压钳、穿孔式电压钳以及单通道记录（细胞贴附、膜内朝外和膜外朝外构型）。此外，通过电流钳记录逼尿肌（DSM）的膜电位，提供了靶点结合型药理学试剂改变细胞兴奋性的证据。例如，TRPM4抑制剂9-phenanthrol可诱导来自人、豚鼠和大鼠膀胱的逼尿肌细胞发生超极化19,20,22,31在各种电生理学方法中，两性霉素B（以及制霉菌素、短杆菌肽和β-七叶皂苷）穿孔膜片钳记录技术具有关键优势，可保留细胞内源性的信号分子和信号通路。仅允许低分子量阳离子，以及在较小程度上允许Cl⁻- - 但不包括蛋白质或信号分子（如Ca）2+ - 可透过由两性霉素B或制霉菌素在质膜上形成的孔道32穿孔膜片钳实验的成功结果取决于该技术特有的多个变量。本文中，我们详细描述了本课题组多年来成功应用的、利用两性霉素B的实验操作步骤。15,22,33,34,35,36,37,38,39.
可以认为，非选择性阳离子通道仍然是逼尿肌（DSM）细胞中最不为人所理解的通道类型之一。关于类似非选择性阳离子通道的首次报道可追溯至1993年。Wellner 和 Isenberg11的论文描述了一种33 pS的牵张激活单通道，其离子通透性顺序如下：K+&#62;Na+&#62;Cs+>>>Ba2+&#62;Ca2+，且该通道活性可被Gd3+（一种非选择性阳离子通道的通用抑制剂）所抑制。近十年后，Thorneloe 和 Nelson40利用全细胞记录技术，在小鼠DSM细胞中描述了可被Gd3+抑制的Na+通透性阳离子电流。由于非选择性阳离子通道的分子身份及其生物物理特性仍有待明确，该研究领域未来仍需进一步探索。本文所述记录非选择性阳离子通道电流的方案——使用含Cs+、TEA+和硝苯地平（表2）的细胞外液和移液管内液，以生理学和药理学手段抑制Kv和Cav电流——已在非选择性阳离子通道的电生理研究中发挥重要作用，并将继续发挥其价值。我们已采用此特定方案，评估TRPM4通道阻断剂9-菲蒽醇对豚鼠、大鼠及人DSM细胞全细胞阳离子电流的抑制程度19,20,22。
综上所述，本文所述从人膀胱尿路上皮中获取新鲜分离的单个膀胱逼尿肌（DSM）细胞的方法，可提供高活性的细胞，非常适合用于多种膜片钳技术构型、Ca2+成像、免疫细胞化学、原位邻近连接实验以及单细胞RT-PCR/qRT-PCR等电生理学研究，同时也适用于微阵列分析、RNA-seq和CHIP-seq等先进的分子生物学技术。采用两性霉素B穿孔式膜片钳方法可保持细胞原有的内环境，与其他构型相比具有优势。当按照本文所述特定条件操作，以消除DSM细胞中K+和Ca2+电流的贡献时，电压阶跃诱导的电流表现出非选择性阳离子电流的特性，适用于生物物理和药理学表征。

<table><tbody><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底试管</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>用于盛装消化步骤中所用酶的 DS 管</td></tr><tr><td>9-菲并咯啉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211281</td><td>TRPM4 通道抑制剂</td></tr><tr><td>两性霉素-B</td><td>Fisher</td><td>BP928-250</td><td>用于膜片钳/细胞穿孔</td></tr><tr><td>两性霉素-B</td><td>欧洲药典参考标准</td><td>5</td><td>用于膜片钳/细胞穿孔</td></tr><tr><td>两性霉素-B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>用于膜片钳/细胞穿孔</td></tr><tr><td>模拟涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9006</td><td>细胞内移液管溶液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>DS</td></tr><tr><td>CaCl₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>细胞外溶液和 DS</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-7.5</td><td>用于制备拉制膜片电极的毛细管</td></tr><tr><td>氢氧化铯水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8518</td><td>细胞内移液管溶液</td></tr><tr><td>Clampex 版本 10 软件，包含数据采集（Clampex）和分析（Clampfit）程序</td><td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td><td>pCLAMP-10</td><td>商用软件，为膜片钳系统配置的一部分</td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td>DS-C</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203025</td><td>细胞外和细胞内溶液</td></tr><tr><td>牙科蜡</td><td>Miltex Dental Wax Technologies, Inc.</td><td>18058351</td><td></td></tr><tr><td>带探针的数字温度计</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-077-32</td><td>置于组织浴槽中以监测温度</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DDT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>与木瓜蛋白酶联合使用的还原剂</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>Ca²⁺ 螯合剂，用于细胞内移液管溶液</td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微电极拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>用于拉制具有极细尖端的电极</td></tr><tr><td>漂浮泡沫试管架/支架</td><td>VWR Scientific</td><td>82017-634</td><td>用于固定盛有酶的试管以实现温度控制</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td>DS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>pH 缓冲液</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td>细胞外溶液</td></tr><tr><td>低噪声数据采集系统</td><td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>膜片钳系统配置的一部分</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>01-442-684</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂（六水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>细胞外和细胞内溶液</td></tr><tr><td>MicroForge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>用于电极的火焰抛光</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>细胞外和细胞内溶液</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>硝苯地平</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7634</td><td>L 型电压门控 Ca²⁺ 通道阻断剂</td></tr><tr><td>尼康倒置显微镜 TS100，配备 T1-SM 载物台及 5x、10x、20x 和 40x 物镜</td><td>Nikon</td><td>已停产</td><td>膜片钳系统配置的一部分</td></tr><tr><td>非金属注射器针头，MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF-34G-5</td><td>用于填充细胞内移液管溶液</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003126</td><td>DS-P</td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td>尖端被打断并进行火焰抛光，用于滴定经酶处理的组织，以从组织块中分离单个 DSM 细胞</td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Axon Instruments/ Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B</td><td>膜片钳系统配置的一部分</td></tr><tr><td>PC 计算机</td><td>DELL</td><td>定制配置</td><td>膜片钳系统配置的一部分</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Aspera Instruments</td><td>PH700</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Intramedic</td><td>427-436</td><td>用于向玻璃底记录室连接的细胞外灌流管路</td></tr><tr><td>四乙基氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2265</td><td>添加至细胞外浴液中的 Kv 和 BK 通道离子通道阻断剂</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Precision 摇动水浴箱（型号 2870）</td><td>Thermo Scientific</td><td>已停产</td><td>用于酶消化过程的温度控制水浴，可作为组织室循环水浴系统的替代方案</td></tr><tr><td>100 mL 组织浴槽</td><td>Radnoti</td><td>1583-101</td><td>连接至循环水浴并注满水，将装有 DS 和 DSM 组织块的试管置于其中，以控制消化步骤的温度</td></tr><tr><td>乙烯基管</td><td>ColePalmer</td><td>06405-3</td><td>多种用途，包括连接组织浴槽与循环水浴</td></tr><tr><td>水循环浴槽，Haake D1 L</td><td>Haake</td><td>已停产</td><td>连接至组织浴槽</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 Axiovert 40C 倒置显微镜，配备 10x 和 40x 物镜</td><td>Carl-Zeiss</td><td>已停产</td><td>膜片钳系统配置的一部分</td></tr></tbody></table>

新鲜分离人膀胱逼尿肌平滑肌细胞的制备与应用：用于表征9-苯并蒽酚敏感性阳离子电流

关键词：膀胱逼尿肌，平滑肌细胞，新鲜分离，9-苯并蒽酚，阳离子电流，电生理学，膜片钳技术

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

位于膀胱壁内的逼尿肌平滑肌（DSM）细胞最终实现尿液的储存与排空。制备具有活性、新鲜且分离的 DSM 细胞是一项重要的技术挑战，成功实现该制备可为后续的功能与分子研究提供最佳的细胞材料。本文所开发并详述的方法，已由本研究团队成功应用十余年，其内容包括从开放性膀胱手术中获取的人类膀胱组织标本的解剖，随后对 DSM 组织块进行两步酶解处理并结合机械研磨，以获得新鲜分离的 DSM 细胞。第一步是通过解剖将 DSM 层（亦称固有肌层）从黏膜层（尿路上皮、固有层及黏膜肌层）以及邻近的结缔组织、血管和脂肪组织中分离出来。随后将 DSM 组织切成 2–3 mm × 4–6 mm 的小块，置于含名义浓度 Ca2+ 的解剖/消化液（DS）中。接着将组织块转移至分别含有木瓜蛋白酶和胶原酶的 DS 溶液中，在约 37 °C 下依次处理，每步 30–45 分钟。经含无酶牛血清的 DS 溶液洗涤，并使用火焰抛光的移液管进行机械研磨后，组织块可释放出单个 DSM 细胞。新鲜分离的 DSM 细胞非常适用于离子通道的膜片钳电生理学与药理学表征。具体而言，我们展示 TRPM4 通道阻断剂 9-菲蒽醇可抑制采用两性霉素 B 穿孔膜片钳技术记录到的电压阶跃诱发的阳离子电流。DSM 细胞也可通过其他技术进行研究，例如单细胞 RT-PCR、微阵列分析、免疫细胞化学、原位邻近连接实验以及 Ca2+ 成像。使用单个 DSM 细胞的主要优势在于，所获得的观察结果直接反映单个细胞的特性。对新鲜分离的人类 DSM 细胞的研究已为表征膀胱中多种离子通道（包括允许阳离子通透的通道）的特性提供了重要见解，并将继续作为阐明 DSM 细胞特性及其调控机制的金标准。

通过酶解法分离膀胱逼尿肌组织块，可常规获得健康的、新鲜分离的膀胱逼尿肌细胞，用于功能和分子研究，例如：膜片钳电生理学和免疫细胞化学。图1 总结了分离步骤，并展示了用于酶解处理过程中温度控制的实验装置示意图。图2 展示了来自三位不同患者供体的膀胱标本所获得的逼尿肌细胞的明场显微图像。健康的单个逼尿肌细胞在显微镜下表现为纺锤形形态、轮廓清晰、细胞周围有明显的晕轮，以及半收缩性（蛇形）外观（见 图2 中白色箭头所示的逼尿肌细胞）。这些细胞还可对收缩刺激物产生反应，例如毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱或高钾（60 mM K+）刺激。逼尿肌细胞对α-平滑肌肌动蛋白呈免疫阳性反应，证实其细胞身份（图3）。
DSM 细胞非常适合用于研究离子通道特性的膜片钳电生理实验。本文中，我们描述了采用移液管和细胞外溶液（表 2）的两性霉素 B 穿孔式膜片钳记录方法，以最佳方式记录由电压阶跃诱导的阳离子通道电流。在所采用的特定实验条件下，通过 Cs+/TEA+ 阻断 Kv 电流，以及通过硝苯地平阻断 L 型 Ca2+ 电流，可有效消除这些离子成分对全细胞电压激活电流的贡献。图 4 和 图 5 分别展示了两性霉素 B 穿孔式膜片钳方法的实验步骤，以及在三位不同患者来源的人 DSM 细胞中，采用电压阶跃或斜坡电压刺激方案记录到的代表性全细胞电流。需要注意的是，这些记录在电流幅值和外向整流程度上表现出一定程度的变异性。进一步实验表明，TRPM4 通道抑制剂 9-菲蒽醇可在负电压和正电压下有效且可逆地抑制人 DSM 阳离子电流（图 6）。9-菲蒽醇敏感性电流成分在正电压下表现出更强的抑制效应，并呈现外向整流特征（图 6C）。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig01.jpg" /> 
图 1：制备逼尿肌平滑肌（DSM）组织块及用于酶解分离的操作流程示意图。 图中显示了以下内容：（A）来自开放性膀胱手术的全层人膀胱标本，作为冰浴保存的多余手术组织材料置于冰上冷的DS溶液中；（B）将标本固定后部分解剖分离出逼尿肌层的同一标本；（C）从逼尿肌层切割得到的不同尺寸的DSM组织块，较小的组织块可用于酶解消化，较大的可用于其他实验研究；（D, E）用于DSM组织块酶解的两种可选装置：（1）通过管路连接至大型玻璃组织培养室的温控循环水浴，该培养室内盛有水，并配有橡胶管架、装有DSM组织块和酶解液的塑料管（酶解液以解剖/消化溶液DS配制，即DS-P或DS-C，见表2），以及连接至显示屏的温度探针，用于持续监测温度（D）；或（2）一个盛水的大型温控水浴装置，内含支架及装有DSM组织块和酶解液的试管（E）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig02.jpg" /> 
图2：采用序贯木瓜蛋白酶-胶原酶消化法获得的人类新鲜分离的尿道括约肌细胞的代表性明场图像。 (A-F) 显示的是具有活力且生理活性良好的DSM细胞图像，这些细胞是尝试进行穿孔膜片钳记录的合适候选细胞。 (G，H) 非活细胞或消化过度的细胞图像；此类细胞在膜片钳实验中应避免使用。（图中）白箭头和黑箭头指示A-H) 分别指向用于尝试膜片钳记录的被视为存活和非存活的DSM细胞。请注意，图中黑色箭头在各图（A、C 和 G）指向缺乏DSM形态的细胞碎片（圆形片断）或小型细胞，以及在（H）细胞呈苍白且扩张状。图像来自三个不同的膀胱标本（A 和 B ：患者-供体来源一， C 和 D ：患者-供体来源二，以及 E-H ：患者-供体来源三）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig03.jpg" /> 
图3：通过免疫细胞化学分析检测单个人类膀胱逼尿肌（DSM）细胞中瞬时受体电位 melastatin 4 型（TRPM4）通道和 α-平滑肌特异性肌动蛋白的表达。（A）共聚焦图像显示在单个人类膀胱逼尿肌细胞中通过免疫细胞化学法检测到的TRPM4通道蛋白表达。红色染色（左下）表示TRPM4通道蛋白；蓝色（DAPI）染色显示细胞核（左上）；绿色染色表示α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，右上）；合并图像（右下）展示了三者的共定位。（B）共聚焦图像显示，在加入TRPM4特异性竞争性肽（CP）后，分离的人类膀胱逼尿肌细胞中TRPM4通道蛋白免疫染色信号减弱。蓝色（DAPI）染色显示细胞核（左上）；绿色染色为α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，右上）；合并图像（右下）展示三者图像的叠加结果。该结果在四次独立实验中得到验证，实验使用了来自四位患者的膀胱逼尿肌完整组织或多个分离的膀胱逼尿肌细胞。图像引自 Hristov 等（2016）22，经许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig04.jpg" /> 
图4：人膀胱逼尿肌细胞形成吉欧姆封接及两性霉素B穿孔过程的示意图。 图示为含两性霉素B的玻璃微电极与膀胱逼尿肌细胞的空间位置关系，以及通过改变电压阶跃（本例中为-10或-20 mV）在商用采集软件（材料表）中获得的膜测试响应，用于测定电阻。各阶段配置如下：（A）电极接近细胞前的状态；（B）将含两性霉素B的玻璃微电极（以红色圆点表示两性霉素B分子）置于细胞表面并施加负压后，形成吉欧姆封接；（C）吉欧姆封接形成约45分钟后呈现的“细胞附着”构型，此时两性霉素B已沿电极内扩散，其分子插入电极尖端的细胞膜中，形成允许阳离子通透的孔道；（D）与（C）相同构型，但通过放大器上的调节旋钮消除了膜电容瞬变，即对全细胞电容和串联电阻进行了补偿。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig05.jpg" /> 
图 5：采用两性霉素B穿孔膜片钳方法在人膀胱逼尿肌（DSM）细胞中记录的全细胞阳离子电流。 （A）电压阶跃方案示意图，显示保持电位为 -74 mV，随后以 10 mV 为增量、从 -94 到 +96 mV 施加持续 400 ms 的电压阶跃，最后返回至 -74 mV。（B, C）采用（A）中所述电压阶跃方案，从两个不同人膀胱标本/患者供体获得的逼尿肌细胞中记录的代表性电流轨迹及其对应的电流密度-电压关系曲线。（D）采用斜坡电压方案记录的电流轨迹示例（上方插图显示电压在 1 秒内以 0.21 mV/ms 的速率从 -94 mV 变化至 +116 mV，保持电位为 -74 mV）。在图（B-D）右侧，各图展示了所记录逼尿肌细胞的电流密度-电压关系曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59884/59884fig06.jpg" /> 
图6：TRPM4通道阻断剂9-苯蒽醇对人膀胱逼尿肌细胞中电压阶跃诱导的阳离子电流的抑制作用。（A）显示的是采用图5A所述电压阶跃方案在对照、9-苯蒽醇处理及洗脱条件下记录的代表性电流。（B）七个人类膀胱逼尿肌细胞（来自七位不同患者供体）在对照、9-苯蒽醇处理及洗脱条件下归一化反应随电压变化的汇总结果。（C）通过从（B）中对照组的数值减去存在9-苯蒽醇（30 µM）时的数值，获得9-苯蒽醇敏感组分的差值电流。图（B）和（C）中的数据以均值±标准误（SEM）表示，*表示在各电压点下对照组与9-苯蒽醇处理组比较具有显著性差异（p&#60;0.05，配对t检验）。图（A）和（B）已重印自Hristov等（2016）22，经许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59884/59884fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物种</td>
			<td colspan="2">实验步骤详情</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>豚鼠</td>
			<td colspan="2">用 Ca 漂洗 DSM 小块2+无血清培养基（单位：mM：100 NaCl，10 KCl，1.2 KH）2PO4，5 MgCl2，20 葡萄糖，50 牛磺酸，测定 pCa=6（或 1 mM），然后切成小块，通常用酶解液处理 90–120 分钟（分 4 次，每次 30 分钟）（酶解液成分，单位为 mM：130 KOH，20 牛磺酸，5 丙酮酸，5 肌酸，10 HEPES，用甲磺酸调节 pH 至 7.4，1 mg/ml 胶原酶，0.2 mg/ml 链霉蛋白酶 E，1 mg/ml 无脂肪酸白蛋白，pCa=4.2（63 mM）或 3.7（200 mM））。分离的 DSM 单细胞储存在 Kraft-Bruhe（KB）培养基中（单位为 mM：85 KCl，30 K2PO4，5 MgSO₄4，5 钠2ATP，5 K-丙酮酸，5 肌酸，20 牛磺酸，5 β-羟丁酸，1 mg/ml 无脂肪酸白蛋白，用KOH调节pH至7.2。 
			替代方法：将DSM碎片在Ca中冲洗10分钟2+无血清培养基（单位：mM）：140 NaCl，5 KCl，1.2 MgCl2，10 葡萄糖，20 牛磺酸，5 HEPES，用 NaOH 调至 pH 7.4）。然后将 DSM 组织块置于相同的 Ca2+- 含 5 mg% 胶原酶、2 mg% 链霉蛋白酶的无血清培养基 100 &#956;M CaCl2 搅拌 2×20 分钟。</td>
			<td>Klockner &amp;#38; 艾森伯格（1985）13,34 Klockner &amp;#38; 伊森伯格（1986）35 施耐德等人（1991）10 Bonev &amp;#38; 伊森伯格（1992）9 Weidelt &amp;#38; 伊森伯格（2000）36 摩尔等人（2004）14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>豚鼠、长白猪和人类</td>
			<td colspan="2">DSM 组织块在 Ca 中预孵育 5 分钟2+无钙克氏液中，随后切成小块，并在含酶消化液中进行酶解消化2+不含胶原酶 I 型（0.5-2 mg/ml）和蛋白酶（pronase，0.1-0.5 mg/ml）的 Krebs 溶液 36&#176;C 持续搅拌20-30分钟。在某些情况下，消化后的组织块进一步通过钝头移液管吹打或旋转震荡，直至细胞释放。分离的细胞保存于改良的Krebs溶液中（见Klockner所述） &amp;#38; 伊森伯格13）通常在3小时内使用。Krebs溶液的成分为（mM）：140 Na+，6 K+，2 Ca2+, 1.2 Mg2+，152.4 Cl-，10 葡萄糖，10 HEPES，用 Tris 调至 pH 7.35–7.4。用于 Ca2+无钙溶液，Ca2+ 和 Mg2+ 从 Krebs 溶液中省略。</td>
			<td>Inoue &amp;#38; 布拉丁（1990）37 Inoue &amp;#38; 布拉丁（1991）38 Nakayama &amp;#38; 布拉丁（1995）39,40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人类</td>
			<td colspan="2">Ca中的DSM碎片2+无钙 HEPES 台氏液（单位：mM：105.4 NaCl，20.0 或 22.3 NaHCO₃）3，3.6 KCl，0.9 MgCl2，0.4 NaH2PO4，19.5 或 4.9 HEPES，5.4 或 5.5 葡萄糖，4.5 或 5.5 Na-丙酮酸）并切成 DSM 小块。将 DSM 小块浸入酶溶液（Ca2+ 含 0.7 mg/ml I 型胶原酶、0.7 mg/ml 木瓜蛋白酶、1 mg/ml 白蛋白的无钙 HEPES 溶液中，4°C 过夜孵育 4&#176;C. 将条带在 36.5&#176;C 孵育15至30分钟，用新鲜溶液洗涤并轻轻吹打。将储存于Ca中的分离细胞2+ 含HEPES Tyrode溶液中，或立即用于实验。</td>
			<td>蒙哥马利 &amp;#38; 弗莱（1992）24 Gallegos 和 Fry（1994）41 Fry 等（1994）42 Sui 等（2001）43 吴等（2002）44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>豚鼠</td>
			<td colspan="2">DSM 在 PSS（单位：mM，137 NaCl，5.4 KCl，2 MgCl）中切成小块2，2 CaCl2，0.42 KH2P04，4.17 NaHCO₃3，10 葡萄糖，10 HEPES，用 NaOH 调至 pH 7.4）。将 DSM 组织块置于以下消化液中孵育 10 分钟（单位：mM：80 Na-谷氨酸盐，55 NaCl，6 KCl，10 HEPES，11 葡萄糖，2 MgCl₂）2，以及 0.2 CaCl2）然后转移至含有相同溶液但添加1 mg/ml胶原酶2、1 mg/ml胰蛋白酶抑制剂（有时可省略）、1 mg/ml无脂牛血清白蛋白的离心管中，于约70分钟内处理 35&#176;C 或 60 分钟左右 37&#176;C通过巴斯德吸管在无钙且不含酶的相同溶液中吹打获得单个DSM细胞。吹打后，Ca2+ (1 mM) 被加入，细胞被储存于 4&#176;C细胞均于同日使用。</td>
			<td>Bonev &amp;#38; Nelson (1993)53,54 Heppner 等（1997）26 Petkov 等（2001）47 Shieh 等（2001，2007）48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>豚鼠、小鼠、大鼠和人类</td>
			<td colspan="2">该方案采用锐器解剖后，在含钙环境中进行两步酶解消化处理2+无酶消化液（单位：mM：80 Na-谷氨酸盐，55 NaCl，6 KCl，10 HEPES，11 葡萄糖，2 MgCl₂）2）。首先，将DSM碎片在25-45分钟内进行处理 37&#176;C 含1-2 mg/ml 木瓜蛋白酶、1 mg/ml 二硫苏糖醇和1 mg/ml 牛血清白蛋白的解离溶液（单位：mM，80 单谷氨酸钠，55 NaCl，6 KCl，2 MgCl₂）2，10 HEPES 和 10 葡萄糖，用 NaOH 调节至 pH 7.3），然后将 DSM 组织块转移至消化液中，消化液含 1–5 mg/ml 胶原酶 XI（Sigma）或胶原酶 II 型、1 mg/ml 牛血清白蛋白、0 或 1 mg/ml 胰蛋白酶抑制剂以及 100 &#956;M 钙2+，孵育6-30分钟。孵育后，用不含酶和Ca的消化液将消化后的组织反复洗涤数次2+ 然后轻柔地进行机械吹打，以获得单个平滑肌细胞。</td>
			<td>Petkov 等（2001）50 Thorneloe &amp;#38; 尼尔森（2003）51 Thorneloe &amp;#38; 尼尔森（2004）33 Petkov &amp;#38; Nelson (2005)27 Hristov 等（2008）52 Layne 等（2010）53 Hristov 等（2011）15 Xin 等（2012）54 Parajuli 等（2012）25 Malysz 等（2013）29 Parajuli 等（2013）31 Lee 等（2013）55 Malysz 等（2014）23 Smith 等（2013）19,20 Hristov 等（2016）22 Lee 等（2017）56 Yarotskyy 等（2018）57</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：从不同物种的膀胱中分离单个膀胱壁平滑肌细胞所用的酶解方法汇总。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液类型</td>
			<td>成分（单位：mM）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS（解剖/消化溶液）</td>
			<td>80 Na-谷氨酸盐, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 和 11 葡萄糖，用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-P（含木瓜蛋白酶的 DS）</td>
			<td>含 1–2 mg/ml 木瓜蛋白酶、1 mg/ml 二硫苏糖醇和 1 mg/ml 牛血清白蛋白的 DS 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-C（含胶原酶的 DS）</td>
			<td>含 1–2 mg/ml II 型胶原酶、1 mg/ml 牛血清白蛋白、0 或 1 mg/ml 胰蛋白酶抑制剂以及 100–200 μM Ca2+ 的 DS 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P（移液电极液）</td>
			<td>110 CsOH, 110 天冬氨酸, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA 和 30 CsCl，用 CsOH 调节 pH 至 7.2，并添加两性霉素-B（300–500 μg/ml）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E（细胞外液）</td>
			<td>10 四乙基氯化铵（TEA）, 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES 和 10 葡萄糖，用 NaOH 或 CsOH 调节 pH 至 7.3–7.4，并含 0.002–3（2–3 mM）硝苯地平</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：解剖/消化溶液（DS）以及穿孔膜片钳实验中使用的移液管和细胞外溶液的成分。

我们介绍一种采用两步酶解法从人膀胱标本中分离单个新鲜逼尿肌平滑肌细胞的方法。所获得的有活力的逼尿肌细胞可通过多种单细胞技术进行研究，包括文中所述的两性霉素B膜片钳电生理学技术，以揭示其生理学和药理学特性。

逼尿肌平滑肌（DSM）细胞位于膀胱壁内，最终实现尿液的储存与排泄。 viable、...的制备

逼尿肌平滑肌细胞构成尿 bladder 壁，最终实现尿液的排出与储存。本方案提供了一种经过验证且可靠的从组织中新鲜分离单个平滑肌细胞的方法。新鲜分离的人类逼尿肌平滑肌细胞为在单细胞水平上进行电生理学和分子检测提供了可能。通过研究来自对照、正常及病变人膀胱的单个逼尿肌平滑肌细胞，我们有机会验证离子通道等药理学靶点。单个人逼尿肌平滑肌细胞非常适合进行膜片钳电生理学等电生理实验。本文将介绍研究一种名为TRPM4（瞬时受体电位香草酸亚型4通道）的非选择性阳离子通道的示例。初学者可能在解剖和酶消化步骤上遇到困难，这些步骤需要较高的操作效率和经验，包括识别获取新鲜分离的膀胱平滑肌细胞的关键步骤。熟悉人膀胱组织学结构非常重要，分离单个细胞的实验方案步骤具有较强稳定性，但初次使用本方案时应预期获得的细胞质量可能不理想。首先检查全层尿路膀胱标本。将标本黏膜面朝上、浆膜面朝下固定于盛有冰冻 DS 的硅胶对映体涂层 150 mm 圆形培养皿中，通过锐性分离仔细去除全部黏膜组织。切取数块无黏膜的逼尿肌平滑肌（DSM）组织。将三至六块 DSM 组织放入含有 1 至 2 毫升预热的含木瓜蛋白酶和二硫苏糖醇（DS-P）的 DS 溶液的离心管中。在37摄氏度下孵育30至45分钟，期间每10至15分钟摇动试管一次。孵育结束后，从试管中移除DS-P，并用冰冻的DS短暂清洗DSM组织块。将含有DSM组织块的DS转移至新试管，移除DS，使DSM组织块留在试管底部。向试管中加入1至2毫升含有II型胶原酶的DS，即DS-C。在37摄氏度下孵育，并偶尔轻轻振荡。弃去DS-C，用冰冻的DS将酶处理过的DSM组织块洗涤5到10次。最后一次洗涤后，将DS保留在离心管内，用火焰抛光的巴斯德移液管轻轻吹打组织块，以释放单个DSM细胞。取0.25至1毫升细胞悬液，滴加到置于倒置显微镜载物台上的玻璃底培养小室中，孵育至少45分钟，使细胞充分贴壁。然后，将DS从浴液中取出，并通过灌流更换为E溶液。拉制多个膜片电极，对电极尖端进行抛光处理，必要时用牙科蜡涂覆尖端。将膜片电极尖端浸入不含两性霉素B的移液管溶液中片刻，以填充电极尖端。 膜片钳电生理实验的成功取决于 DSM 细胞的质量以及两性霉素 B 的溶解效果。使用含有两性霉素 B 的相同移液管溶液反向填充电极，并将电极安装到连接膜片钳放大器头部的电极 holder 上。利用显微操作器将电极置于细胞外液表面下方，使电极尖端刚好浸入溶液中。然后，使用商用采集软件的膜测试窗口功能测定电极电阻，并将电极推进至目标细胞。当电极接触细胞表面时，通过管道向电极施加轻柔而迅速的负压，使电极尖端产生负压，从而形成吉欧封接（giga-seal），并通过膜测试确认封接成功。让两性霉素B在移液管中扩散并插入质膜，耗时30至60分钟，形成主要对单价阳离子具有选择性的孔道。使用膜测试功能持续监测吉欧封接（giga-seal）。当穿孔达到最佳状态时，通过调节放大器上的细胞电容和串联电阻旋钮，消除电容瞬变信号。当观察到稳定的电压阶跃阳离子电流后，按照文中所述的常规电压阶跃方案记录电流。通过灌流施加待测化合物或生理测试条件，分别记录对照条件、测试条件以及洗脱阶段的反应。该方案可用于分离健康且新鲜的膀胱平滑肌细胞，以进行功能和分子水平的研究。健康的单个膀胱逼尿肌细胞在显微镜下呈现纺锤形形态，边缘清晰分明，细胞周围有明确的晕轮结构，并具有半收缩状态的外观。此外，新分离的膀胱逼尿肌细胞对机械刺激和卡巴胆碱具有反应性。在后续的膜片钳实验中，应避免使用细胞碎片以及无活性或消化过度的细胞。分离的细胞已用于制霉菌素B穿孔式全细胞膜片钳实验，在三种不同的人类膀胱平滑肌（DSM）细胞中，采用电压阶跃或电压斜 ramp 方案测量全细胞电流。实验结果表明，TRPM4通道抑制剂9-苯并蒽酚可有效且可逆地抑制人类膀胱平滑肌阳离子电流。对9-苯并蒽酚敏感的电流组分在正电压下表现出更强的抑制作用，并呈现外向整流特性。酶处理步骤（步骤 2.2 和 2.3）的条件，包括温度、酶处理持续时间、酶的批号来源以及人膀胱逼尿肌细胞（DSM 细胞）的质量，是获得高质量人 DSM 细胞的关键决定因素。人 DSM 细胞也非常适用于检测细胞内第二信使水平（包括钙离子和环磷酸腺苷）、通过免疫细胞化学法检测蛋白质表达、通过原位邻近连接试验检测共表达，以及通过 RT-PCR、qRT-PCR、微阵列和新一代测序技术检测 mRNA 表达。人 DSM 细胞的研究已显著推动了我们对 BK 通道、钙离子通道和 TRPM4 通道在尿道膀胱功能中作用的理解。未来的发展将能够将电生理学或药理学特性与转录组或蛋白质组谱型进行特异性关联。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

制备和利用新鲜分离的人类分离器平滑肌细胞，用于9-苯酚敏感阳离子电流的表征

详细介绍在离体器官中对平滑肌进行高分辨率 Ca2+...

平滑肌中局灶性 Ca2+ 瞬变的检测

在本视频中，我们演示了使用两步序贯酶消化法从人膀胱标本中分离逼尿肌平滑肌细胞。...

膀胱逼尿肌平滑肌细胞分离：一种通过酶消化法从人膀胱组织标本中获取逼尿肌细胞的实验方案

本视频展示了利用两性霉素B介导的穿孔膜片钳技术，对逼尿肌平滑肌细胞中瞬时受体电位 melastatin 4...

两性霉素B介导的穿孔膜片钳分析：一种用于研究膀胱尿路上皮细胞离子电流的电生理学技术

我们描述了一种可用于结合细胞内Ca2+浓度测量与电生理膜片钳研究的人类心房肌细胞的分离方法。...

人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

我们展示了一种用于直接研究肠神经系统中神经元和胶质细胞组分的细胞培养方案。该方法通过取自成年小鼠肌间神经丛的神经元/胶质细胞混合培养，在盖玻片上建立培养体系，从而能够利用电生理学、免疫组织化学等方法对单个神经元和胶质细胞的功能进行检测。 等等.

一个 体外 成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

本文介绍了一种简单而高效的方法， 体外...

膀胱平滑肌条收缩力作为评估下尿路药理学的方法

本文介绍了研究人子宫肌层ex vivo收缩的实验方案及其在药物发现中的应用。...

人类子宫平滑肌收缩力测量以辅助药物开发

去逼尿肌的膀胱模型可直接进入尿路上皮下层，用于研究在储尿和排尿过程中，尿路上皮下层/固有层中生物活性介质可利用性的局部调控机制。该制备方法 closely...

一种去除了逼尿肌的离体小鼠膀胱模型，用于在膀胱充盈过程中直接接触尿路上皮下层

本文提供了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）在体外生成神经肌肉接头（NMJs）的实验方案。该方法可在单个孔中于一个月内诱导形成具有成熟形态和功能的神经肌肉接头。所获得的神经肌肉接头有望用于相关疾病的建模、病理机制的研究，或用于药物化合物的治疗性筛选。...

由人诱导性多能干细胞体外诱导生成神经肌肉接头

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。...

一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

学习从人膀胱组织中酶解分离逼尿肌平滑肌细胞的方法，并利用穿孔膜片钳技术记录TRPM4通道电流。该技术可用于验证9-菲酚等药物对离子通道的抑制作用，为膀胱生理学和药理学研究提供单细胞水平的实验平台。

新鲜分离人膀胱逼尿肌平滑肌细胞的制备与应用：用于表征9-苯并蒽酚敏感性阳离子电流关键词：膀胱逼尿肌，平滑肌细胞，新鲜分离，9-苯并蒽酚，阳离子电流，电生理学，膜片钳技术

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