自组装的人类蛋白质微阵列中的激酶抑制剂筛选

NAPPA 是一个功能强大的蛋白质微阵列平台，可用于以无偏高通量的方式研究蛋白质活性和功能。NAPPA上显示的蛋白质在基于人类的表达系统中使用人类衍生的核糖体和伴郎产生，以提高自然折叠和活动的可能性。使用NAPPA阵列筛选激酶抑制剂为新药和临床相关激酶突变的检测提供了一个新的平台。

NAPPA 方法产生的蛋白质微阵列可用于许多不同的应用，包括生物标志物发现、蛋白质-蛋白质相互作用、基质识别和药物筛选。沿途执行质量控制步骤。测试您的DNA制剂、DNA微阵列和蛋白质微阵列的质量。

如果在任何步骤的质量都不好，就重新开始吧。演示这个程序的将是丽莎·米勒，一个在我的实验室的技术人员。要准备细菌生长在家庭高通量迷你准备，首先接种细菌在螺旋板96井格式，并让它生长16小时。

第二天，用1.5毫升的特好肉汤介质填充深井板的每个井，辅以抗体安培西林。抗体取决于质粒上的选择标记。然后，用 80% 乙醇和火焰对 96 针设备进行消毒。

使用无菌 96 针装置从隔夜孵化的阿加板中挑选菌落，并潜入深井板的井中，为培养体接种。用气体渗透密封盖住块，在 37 摄氏度和 300 至 800 rpm 的摇床上孵育 22 至 24 小时。之后，颗粒培养和根据手稿重新暂停文化。

将200微升溶液加入两口，用铝密封密封板，并反转五次。将细菌加入200微升溶液中。孵育细胞整整五分钟。要中和溶液，请添加 200 微升溶液三，用铝密封密封板，并反转五次。

然后，在3800G，4摄氏度的旋转板，30分钟清除裂样上清液。要准备心安尼交换树脂板，首先将心安尼交换浆料混合，然后将泥浆倒入玻璃槽中。将过滤板堆叠在深井板上，以充当废物收集容器。

然后，使用宽板 P1000 尖端，混合浆料，将 450 微升浆料转移到滤芯的每个孔中。离心并丢弃流经。现在，将落酸中盐转移到树脂板和深井块的堆栈中。

以最慢的加速速度旋转堆叠板 5 分钟，并丢弃流经。要清洗柱，请向每个井添加 400 微升溶液 N3 洗涤缓冲液。将树脂板转移到真空歧管中，以去除洗涤缓冲液。

重复洗涤步骤三次，然后以30倍的短暂5分钟旋转去除任何剩余的洗涤缓冲液G.To将DNA洗脱，将树脂板放在干净的800微升收集板上。在每个井中加入300微升溶液N5，让它在室温下坐10分钟。然后，在 20 倍 G 下旋转堆叠板 5 分钟，将速度慢速提升至 233 倍 G，一分钟。

使用前在负 20 摄氏度时存放板。首先，将滑梯放在机架上，将幻灯片淹没在玻璃储液罐中，其中含有丙酮中 2%氨基硅烷试剂的涂层溶液。摇动幻灯片 15 分钟。

然后，用丙酮冲洗幻灯片，然后在水中进行最后冲洗。接下来，使用压力空气干燥滑梯。从各个角度吹到它们约三分钟，直到所有水滴被移除。

将涂层的幻灯片在室温下存放在密封紧密的盒子内的金属机架上。现在，继续沉淀手稿中描述的DNA。然后，将DNA颗粒重新在20微升超纯水中重新浇水，以1000转/秒的速度摇动两小时。

要准备阵列样品，请将10微升新鲜制备的打印混合物添加到每个DNA样品中，其中含有抗体、交联和聚聚氨酸。用铝箔密封板，在室温下在 1000 rpm 下摇动 90 分钟。将盘子在四摄氏度下过夜。

在印刷日，短暂地旋转和旋转板。将每个样品的 28 微升转移到 384 井板中。将氨基硅烷涂层幻灯片和 384 井板放在阵列甲板上，然后启动微阵列打印程序。

打印完成后，为微阵列贴上标签。微阵列可以存储数月，直到进一步使用。要测量DNA水平，请将幻灯片放在移液器盒中，用50毫升的阻滞缓冲液封住它们。

在室温下将滑梯孵育在摇摇器上一小时。然后，丢弃溶液，加入20毫升的阻隔缓冲液和33微升的荧光DNA交色染料。用搅拌孵育15分钟。

孵育结束后，用超纯水快速冲洗滑梯，用压力空气干燥。微阵列已准备好进行扫描。要表达微阵列，请按之前所示方式挡住幻灯片，然后用超纯水冲洗，然后用过滤的压缩空气干燥。

将密封垫片连接到每个滑轨上。在幻灯片上加入 130 毫升的体外转录和翻译混合物，轻轻按摩密封垫片，使体外转录和翻译混合展开，覆盖阵列的整个区域，没有任何气泡。将小圆形端口密封件应用于两个端口。

在30摄氏度下孵育90分钟，用于蛋白质表达，随后在15摄氏度下孵育30分钟，用于查询蛋白的固定。然后，取出垫片，用牛奶在 15 毫升 TBST 中清洗三次，每次 5 分钟，然后在同一溶液中块开一个小时。为了检测阵列上的蛋白质，用牛奶去除TBST，将幻灯片放在格子板上，并应用600微升的原抗体、小鼠抗旗、稀释一至两百和1倍TBST，辅以5%牛奶。

在室温下孵育一小时。在摇摇器上用 50 毫升 1 倍 TBST 和 5% 牛奶清洗滑梯，每次 5 分钟。重复二级抗体的过程。

一个小时的孵育期结束后，在摇摇器上用1倍TBST清洗幻灯片三次，每次5分钟。然后，用超纯水快速冲洗滑梯，并使用压力空气干燥。幻灯片已准备好扫描。

要进行磷酸酶和DNase治疗，请用TBST清洗和阻挡表达的幻灯片，并辅以手稿中描述的3%BSA。然后，将幻灯片放在格栅板上，并应用 200 微升磷酸酶 DNase 溶液。将微阵列盖滑放在顶部以避免蒸发。

在30摄氏度下在烤箱中孵育1小时30分钟。然后，在摇摇器上用 1x TBST 和 0.2 摩尔氯化钠清洗幻灯片三次，每次洗涤 5 分钟。要进行药物治疗和激酶反应，将幻灯片放在格子板上，并应用200微升药物激酶溶液。

将盖滑放在顶部以避免蒸发。在烤箱中孵育一小时，温度为30摄氏度。可重现数据的关键是跨幻灯片的一致孵育时间。

这在激酶反应期间尤其重要。应说明处理每张幻灯片所需的时间。之后，在摇摇器上用1xTBST和0.2摩尔氯化钠清洗滑梯三次，每次5分钟。

重复蛋白质检测，使用原发抗体磷磷酪氨酸抗体稀释1至100在TBST，辅以3%牛血清白蛋白。使用1x TBST和3%牛血清白蛋白在用原抗体孵育后进行洗涤，使用TBST进行二次抗体孵育后洗涤。如前所述，清洗和干燥。

对于图像采集，请将微阵列加载到幻灯片架杂志中。将杂志加载到微阵列扫描仪中。使用优化的设置扫描所有微阵列，并记住在比较实验图像时关闭自动增益。

将图像传输到量化软件，将网格与点对齐，并量化微阵列上每个要素的信号强度。继续进行统计分析。在这项研究中，微阵列显示大多数含有互补DNA的斑点成功地显示了可检测的蛋白质水平。

NAPPA激酶微阵列在幻灯片中表现出良好的可重复性，不同印刷批次的蛋白质显示水平的相关性高于0.88。NAPPA激酶阵列中激酶活性的代表性结果表明，表达后蛋白磷酸化水平高。磷酸酶处理后测量磷酸化水平的微阵列与60分钟的自磷酸化反应后的比较表明阵列上存在活性蛋白激酶。

在NAPPA激酶阵列上，imatinib显示ABL1和BCR-ABL1活性显著减少，而其他激酶大多未受影响。激酶活性对脱磷化阵列进行正常化，并代表正对微阵列的百分比，显示对ABL1和BCR-ABL1的选择性抑制。伊布鲁替尼筛查的典型结果表明，ABL1非相关激酶的激酶活性不受影响。

Btk 规范目标， 和 ERBB4 潜在的新目标， 显示减少活动在伊布鲁替尼的存在。数据表明ERBB4可以抑制伊布鲁替尼在剂量特定的方式。蛋白质微阵列筛查的成功在很大程度上取决于微阵列本身的质量。

应使用几个正负控制功能进行适当的数据分析。NAPPA激酶测定是一个筛选平台，因此，获得的数据应在后续测定中验证，其中可能包括体外激酶测定或基于细胞的测定。由于我们的协议从cDNA开始，任何激酶突变或变异都可以很容易地融入微阵列中，并在高通量中研究。

在制备 Anion 交换树脂浆料和板材时，建议使用口罩防止可能吸入树脂颗粒。