Name: 自组装的人类蛋白质微阵列中的激酶抑制剂筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 了解NAPPA蛋白质微阵列技术用于激酶抑制剂高通量筛选的方法。该技术利用人源体外转录翻译系统表达活性激酶，支持多种激酶及其突变体的药物效应比较分析，为药物发现和临床研究提供灵活平台。

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作者谨向 LaBaer 实验室的全体成员致以感谢，感谢他们在本项目开发过程中提供的帮助与批评建议。本项目得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 U01CA117374、U01AI077883 以及 Virginia G. Piper 基金会的支持。

1. 常用缓冲液和溶液的配制
<ol>
	<li>制备TB培养基：优质肉汤（24 g/L酵母提取物；20 g/L胰蛋白胨；4 mL/L甘油；0.017 M KH2PO4；以及0.072 M K2HPO4）。0.017 M KH2PO4 和 0.072 M K2HPO4 溶液可购买10倍浓缩的磷酸盐缓冲液（0.17 M KH2PO4 和 0.72 M K2HPO4）稀释使用。</li>
	<li>制备LB培养基：Luria-Bertani培养基（5 g/L酵母提取物；10 g/L胰蛋白胨；10 g/L NaCl）。用5 M NaOH将pH调节至7.0。</li>
	<li>制备1x TBS：Tris缓冲盐水（TBS：50 mM Tris-Cl，pH = 7.5；150 mM NaCl）。</li>
	<li>制备1x TBST：在TBS中加入0.1% Tween 20。</li>
</ol>
2. DNA 制备
注意：NAPPA 芯片所用的 DNA 必须具有高纯度，因此不建议使用商业化的质粒小提试剂盒。目前有两种 DNA 制备方案可供选择：实验室自制的高通量小提法（本文所述）或商业化的中提或大提试剂盒。实验室自制小提法的平均通量为每人每天 1,500 个样本。
<ol>
	<li>高通量小量制备质粒DNA的细菌培养
	<ol>
		<li>准备LB/琼脂平板。将30–40 mL LB琼脂培养基（含1.5%细菌学琼脂的LB培养基，并添加用于筛选阳性克隆的抗生素）倒入每个单孔板中。</li>
		<li>在LB/琼脂平板上点样甘油菌种。将甘油保存菌种用LB培养基稀释（1:300，通常为2 µL加入600 µL LB中），振荡10分钟。取3 µL稀释后的菌液点于LB/琼脂平板上，37 °C倒置培养过夜。</li>
		<li>接种培养物。使用经80%乙醇消毒并火焰灭菌的96针接种工具，从琼脂平板上将菌落接种至深孔块中，每孔加入含抗生素的TB培养基1.5 mL。</li>
		<li>培养菌液。用透气封膜覆盖深孔块，在37 °C、300–800 rpm条件下振荡培养22–24小时。 
		注：800 rpm的摇床转速最适合此培养条件。若使用较低转速，可能导致菌液密度不足及DNA纯化得率降低。</li>
		<li>收集菌体。在3,800 x g、4 °C条件下离心30分钟，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验室高通量小量质粒制备 
	注：可使用多通道移液器或自动分液仪进行高通量小量质粒制备。若使用自动分液仪，务必在使用前及更换溶液之间彻底清洗系统。
	<ol>
		<li>准备小量制备过程中所需的所有溶液：
		<ol>
			<li>配制溶液1：TE重悬缓冲液（50 mM Tris，pH = 8.0；10 mM EDTA，pH = 8.0；0.1 mg/mL RNA酶），4 °C保存。</li>
			<li>配制溶液2：NaOH/SDS裂解缓冲液（0.2 M NaOH；1% SDS）。为获得最佳效果，建议使用新鲜配制的溶液。</li>
			<li>配制溶液3：KOAc中和缓冲液（2.8 M KOAc），用冰醋酸调节pH至5.1，4 °C保存。</li>
			<li>配制溶液N2：平衡缓冲液（100 mM Tris；900 mM KCl；15% EtOH；0.15% Triton X-100），用磷酸调节pH至6.3。</li>
			<li>配制溶液N3：洗涤缓冲液（100 mM Tris；1.15 M KCl；15% EtOH），用磷酸调节pH至6.3。</li>
			<li>配制溶液N5：洗脱缓冲液（100 mM Tris；1 M KCl；15% EtOH），用磷酸调节pH至8.5。 
			注：阴离子交换过程中DNA的结合、洗涤和洗脱效果高度依赖于缓冲液中KCl浓度和pH值。必须精确测量缓冲液组分并准确调节pH。任何偏离推荐参数的微小偏差都可能导致得率显著下降。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重悬菌体沉淀。每孔加入200 µL溶液1，在室温下以2,000 rpm振荡5分钟。为确保有效裂解，必须完全重悬沉淀。必要时可使用涡旋振荡器辅助重悬。</li>
		<li>裂解细菌。每孔加入200 µL溶液2，用铝箔封膜密封后轻轻翻转5次。从加入溶液2开始严格计时，总时间不得超过5分钟。</li>
		<li>中和溶液。每孔加入200 µL溶液3，用铝箔封膜密封后翻转5次。由于裂解和中和缓冲液可能使封膜松动，翻转时应小心操作。建议采用部分翻转方式（即液体不接触封膜），以防止样品间交叉污染。</li>
		<li>澄清裂解液。将板在3,800 x g、4 °C条件下离心30分钟。</li>
		<li>在裂解液离心沉淀期间，准备阴离子交换树脂悬液。取一个1 L试剂瓶，加入阴离子交换树脂至300 mL刻度线，再加入溶液N2至总体积达900 mL。 
		警告：此步骤应在通风橱内操作，以防吸入硅基颗粒。</li>
		<li>准备阴离子交换树脂板。将滤板叠放在深孔块上作为废液收集装置。将阴离子交换悬液充分混匀后倒入玻璃槽中，使用宽口P1000吸头向每孔滤板中转移450 µL悬液。</li>
		<li>将叠放的板（树脂板/深孔板）在室温下以130 x g低加速度离心5分钟，弃去穿滤液。</li>
		<li>将裂解液上清转移至树脂板/深孔块叠放装置中。以30 x g低升速离心5分钟。</li>
		<li>洗涤柱。每孔加入400 µL溶液N3（洗涤缓冲液），将树脂板转移至真空抽滤装置中去除洗涤液。重复洗涤3次。最后一次洗涤时确保所有孔完全排空。将叠放板在150 x g下离心5分钟，以去除残留缓冲液。</li>
		<li>洗脱DNA。将树脂板置于干净的800 µL收集板上，每孔加入300 µL溶液N5，室温静置10分钟，然后以20 x g低升速离心5分钟。再以233 x g离心1分钟。</li>
		<li>定量DNA，并将板在-20 °C保存备用，或直接进行DNA沉淀步骤。 
		注：每样本至少需获得30 µg DNA。若DNA得率较低，建议重复小量制备，或在沉淀步骤（第2.3节）中合并两块板的样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA沉淀
	<ol>
		<li>解冻板，涡旋混匀DNA溶液，以230 x g离心30秒，使所有液体沉至孔底。</li>
		<li>每孔加入40 µL 3 M NaOAc和240 µL异丙醇。用铝箔封膜密封后，轻轻翻转3次混匀。</li>
		<li>在3,800 x g、25 °C条件下离心30分钟，小心弃去上清液。 
		注：如需合并两块板，可将第二块板的DNA转移至第一块板的沉淀中，并重复步骤2.3.2–2.3.3。</li>
		<li>洗涤并沉淀DNA。每孔加入400 µL 80%乙醇，用铝箔封膜密封后在1,000 rpm下振荡30分钟。在3,800 x g、25 °C条件下离心30分钟，弃去上清液。</li>
		<li>干燥DNA沉淀。将板倒置倾斜放在纸巾上，干燥1–2小时，直至孔底无酒精残留。用铝箔封膜密封后以230 x g离心2分钟，使沉淀完全沉至孔底。</li>
		<li>板干燥后，可选择用铝箔封膜密封并在-20 °C冷冻保存以备后续使用，或继续进行DNA重悬（第4.1步）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 氨基硅烷载玻片包被
<ol>
	<li>将载玻片放入金属架中，逐片目视检查，确保无划痕或缺陷。</li>
	<li>将载玻片架浸入包被液（2% 氨丙基三乙氧基硅烷试剂的丙酮溶液）中，摇动孵育 15 分钟。该氨丙基三乙氧基硅烷溶液最多可用于包被两批各 30 片的载玻片架，之后需弃用。</li>
	<li>清洗步骤：将载玻片架浸入丙酮洗涤液（99% 丙酮）中，前后摇动，再快速上下晃动 5 次；倾斜至一角使液体滴尽，随后迅速浸入超纯水中上下晃动 5 次；再次倾斜使液体滴尽，然后置于纸巾上。 
	注意：丙酮洗涤液可重复使用两次，而超纯水每次必须更换。</li>
	<li>用加压空气干燥载玻片，从各个角度吹扫约 3 分钟，直至所有水滴完全去除。将包被后的载玻片置于密封盒内的金属架中，室温保存。</li>
</ol>
4. 芯片样品制备
<ol>
	<li>将自制的质粒小提产物（步骤 2.3.6）中的 DNA 沉淀重悬于 20 µL 超纯水中，于 1,000 rpm 振荡 2 小时。对于中提/大提 DNA，将每个样品稀释至终浓度为 1.5 µg/µL，并转移 20 µL 至 800 µL 收集板中。</li>
	<li>配制点样混合液。每块 96 孔板配制 1 mL 点样混合液 [237.5 µL 超纯水；500 µL 多聚赖氨酸（0.01%）；187.5 µL BS3（双磺基琥珀酰亚胺，50 mg/mL 溶于 DMSO）；以及 75 µL 多克隆抗 Flag 兔抗体]。 
	注意：应按指定顺序添加试剂，以避免产生沉淀。</li>
	<li>向每个样品中加入 10 µL 点样混合液，用铝箔密封板孔，于室温下以 1,000 rpm 振荡 90 分钟。随后将板在 4 °C 过夜孵育（约 16 小时）。</li>
	<li>点样当天，先短暂涡旋并离心板子。将每个样品中的 28 µL 转移至一块 384 点阵板中。此步骤可使用自动化设备或多通道移液器完成。务必准确记录样品在 384 点阵板中的位置。</li>
	<li>短暂离心以去除气泡，用铝箔密封板孔。</li>
</ol>
5. NAPPA 芯片的制备：微阵列点样
注意：所有打印条件均已针对设备与材料表中列出的仪器进行优化。若使用其他阵列设备，可能需要进一步优化。
<ol>
	<li>点样仪清理。开始前，清空所有废液罐，并根据需要向储液槽中重新加入超纯水或80%乙醇。使用无尘布和超纯水逐个清洁点样针。用无尘布将点样针擦干，并小心地将其重新放回点样头中。</li>
	<li>点样仪设置：打印参数 [每种墨水的最大点样次数：1次；每点点样次数：1次；多点点样时间间隔：--；点样时间（ms）：0 ms；上样时间（ms）：0 ms；打印深度调节：90 微米；触碰次数：0]。随后执行灭菌程序：使用超纯水清洗2,000 ms，干燥时间为0 ms，等待时间为500 ms；重复此步骤6次；接着使用80%乙醇清洗2,000 ms，干燥时间为1,200 ms，等待时间为500 ms；重复此步骤6次。</li>
	<li>芯片设计：根据所需的点阵模式设置点样仪。设计时应考虑多个因素 [例如，每个样本的重复数、对照点的位置与数量、阵列布局（单个区块或多个相同区块）、需打印的芯片数量、运行时长等]。</li>
	<li>将氨基硅烷涂层载玻片（步骤3.4）放置于点样仪载物台上。检查真空是否牢固吸附所有载玻片。启动加湿器（应设定为60%）。</li>
	<li>将384孔板放置于点样仪载物台上。启动程序。</li>
	<li>标记微阵列。打印完成后，在每张载玻片底部（非打印面）贴上标签。保持载玻片在载物台上的打印顺序为数字顺序。</li>
	<li>将打印好的芯片在室温下储存于密封盒内的金属架中，并放入干燥剂包。在干燥环境中保存的载玻片可稳定存放长达一年。</li>
	<li>（可选）：可使用相同样品打印第二批90张芯片。操作方法为：一旦完成第一块384孔板的打印，立即将其从点样仪载物台上取下，密封后于4 °C保存。待第一批芯片全部打印完成后，将其从载物台上移除，换上新的氨基硅烷涂层载玻片，开始新一轮运行。确保每次使用的每块384孔板在使用前已在室温下平衡30分钟。若每批芯片中每个样本打印超过四个重复，建议将384孔板分装为两块板，以减少样品在点样仪载物台上停留时间，从而降低蒸发损失。 
	注意：在开始第二轮运行前，检查所有储液槽。</li>
</ol>
6. 在NAPPA芯片上检测DNA
<ol>
	<li>封闭载玻片。将载玻片放入移液器盒中，并加入30 mL封闭缓冲液。在摇床中室温孵育1小时。</li>
	<li>染色载玻片。弃去封闭液，加入20 mL封闭缓冲液和33 µL荧光DNA嵌入染料。在振荡条件下孵育15分钟。然后，用超纯水快速冲洗载玻片，并用加压空气吹干。随后进行扫描（第11节）。</li>
</ol>
7. NAPPA 芯片的表达
<ol>
	<li>在室温下，将玻片置于摇床上用封闭缓冲液封闭1小时。每四个玻片使用约30 mL封闭缓冲液，置于移液管盒中。</li>
	<li>用超纯水冲洗玻片，并用过滤压缩空气干燥。按照制造商说明，将密封垫圈贴附至每张玻片上。</li>
	<li>加入体外转录翻译（IVTT）混合液。每张玻片需150 µL IVTT混合液。将82.5 µL HeLa裂解液用33 µL DEPC水稀释，再加入16.5 µL辅助蛋白和33 µL反应混合液。从非标签或非样本端加入IVTT混合液。缓慢吹加混合液（液体在入口端暂时形成液滴是可接受的）。轻轻按压密封垫圈，使IVTT混合液均匀铺展并覆盖整个芯片区域。将小型圆形端口密封盖贴于两端口上。</li>
	<li>将玻片置于支撑架上，转移至可编程冷却孵育仪中。在30 °C孵育90分钟以表达蛋白质，随后在15 °C孵育30分钟以固定目标蛋白。</li>
	<li>洗涤并封闭玻片。取下密封垫圈，将玻片浸入含约30 mL封闭液的移液管盒中：若用于蛋白展示（第8节），使用含5%脱脂奶粉的1× TBST；若用于激酶活性检测或药物筛选（第9节），使用含3%牛血清白蛋白（BSA）的1× TBST。室温下振荡孵育20分钟，并重复此步骤两次。</li>
</ol>
8. 在NAPPA芯片上检测蛋白质
<ol>
	<li>加入一抗。将玻片从封闭液（步骤 7.5）中取出，用纸巾轻轻擦干背面（非印刷面）。将玻片置于支撑架上，每张玻片加入 600 µL 用 1× TBST + 5% 脱脂奶粉稀释 1:200 的一抗（小鼠抗 flag 抗体），室温孵育 1 小时。</li>
	<li>在摇床上用 1× TBST + 5% 脱脂奶粉洗涤玻片（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
	<li>加入二抗。将玻片从洗涤液中取出，用纸巾轻轻擦干背面。将玻片置于支撑架上，每张玻片加入 600 µL 用 1× TBST + 5% 脱脂奶粉稀释 1:200 的二抗（Cy3 标记的抗小鼠抗体），避光、室温孵育 1 小时。</li>
	<li>在摇床上用 1× TBST 洗涤玻片（每次 5 分钟，共 3 次）。用超纯水快速冲洗玻片，并用加压空气吹干。随后进行扫描（第 11 节）。</li>
</ol>
9. 在NAPPA芯片上进行酪氨酸激酶抑制剂筛选
注意：同一次实验中可处理多个载玻片，但需确保每个步骤中一次只处理一个载玻片，且各步骤之间载玻片不得干燥。所有溶液均应加至载玻片的非标签端或非样品端。
<ol>
	<li>准备药物筛选过程中使用的所有溶液：
	<ol>
		<li>通过混合以下组分制备磷酸酶/DNase 溶液：1× 蛋白质金属磷酸酶缓冲液（50 mM HEPES、100 mM NaCl、2 mM DTT、0.01% Brij 35，pH = 7.5）；1 mM MnCl2；8,000 单位λ蛋白磷酸酶；以及 2 单位 DNase I。每张微阵列准备 400 µL 溶液。磷酸酶和DNase需在使用前加入。</li>
		<li>配制药物稀释液。将药物用DMSO重悬至终浓度为10 mM。为确保微阵列上测试的所有药物浓度一致，应为每种浓度制备相同体积的DMSO溶液（即10,000倍浓缩液），并保存于-80 °C。使用时，将药物用水稀释1:100。</li>
		<li>通过混合以下组分制备药物/激酶溶液：1× 激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH = 7.5）；5 mM β-甘油磷酸钠；2 mM DTT；0.1 mM Na3VO4；10 mM MgCl2；500 µM ATP；以及 2 µL 药物（用水稀释1:100）。每张微阵列准备 200 µL 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行磷酸酶和DNase处理。将玻片从封闭液（步骤7.5）中取出，用纸巾轻轻擦干背面。将玻片置于支撑架上，加入200 µL磷酸酶/DNase溶液。加盖微阵列盖玻片以防止蒸发。在30 °C烘箱中孵育45分钟。</li>
	<li>第二次磷酸酶和DNase处理：将阵列从烘箱中取出，弃去盖玻片，去除多余液体，加入200 µL新配制的磷酸酶/DNase溶液。用盖玻片覆盖微阵列，并在30 °C烘箱中继续孵育45分钟。</li>
	<li>在摇床中用1× TBST + 0.2 M NaCl洗涤玻片（每次5分钟，共洗3次）。</li>
	<li>进行药物处理和激酶反应。将玻片从洗涤液中取出，用纸巾轻轻擦干背面。将玻片置于支撑架上，加入200 µL药物/激酶溶液。加盖盖玻片以防止蒸发。在30 °C烘箱中孵育1小时。</li>
	<li>在摇床中用1× TBST + 0.2 M NaCl洗涤玻片（每次5分钟，共洗3次）。</li>
	<li>重复步骤8.1–8.4，使用稀释1:100的抗磷酸化酪氨酸抗体作为一抗。所有步骤中的1× TBST + 5%脱脂奶粉替换为1× TBST + 3% BSA。</li>
</ol>
10. 自动化杂交方案
注意：也可使用杂交仪在 NAPPA 芯片（第 7–9 节）上自动完成所有杂交和洗涤步骤，相关方案详见补充文件 1。
11. 图像采集
注意：微阵列图像的分辨率应达到20微米或更高。
<ol>
	<li>将蛋白层面朝上装入微阵列芯片滑座架中，再将滑座架装入微阵列扫描仪。</li>
	<li>选择575/30 nm发射滤光片的绿色激光以扫描Cy-3标记的二抗信号。若使用其他荧光染料，请选择相应的激光/波长以检测荧光信号。</li>
	<li>为每幅图像定义名称及其保存位置。</li>
	<li>（可选）：针对每种新的荧光染料，建议优化扫描条件以检测信号强度的线性范围。具体操作为：使用一系列光电倍增管（PMT）电压和增益设置扫描微阵列，直至获得信号未饱和且背景较低的清晰图像。</li>
	<li>使用优化后的设置扫描所有微阵列，并记得关闭自动增益功能。 
	注意：进行数据分析时，所有微阵列均应使用相同的扫描设置进行扫描。对于使用Cy3作为荧光染料的激酶实验，采用所列扫描仪以20%的PMT、25%的激光强度和10微米的分辨率进行图像扫描。 仪器与材料清单</li>
</ol>
12. 数据处理与分析
注意：目前有多种软件包可用于微阵列数据的定量分析，且功能相似。此处描述的实验步骤是针对设备与材料表中所列软件设计的。
<ol>
	<li>加载需要定量的TIFF文件，设计网格以匹配微阵列布局，并调整斑点大小，以尽可能小的面积包含全部信号。相邻斑点不应重叠。目视检查软件运行效果，必要时手动调整网格。</li>
	<li>对微阵列的信号强度进行定量。目视检查各斑点是否存在异常（如非特异性结合、灰尘等），并将异常斑点从数据分析中剔除。</li>
	<li>使用微阵列上无斑点区域的邻近背景信号进行局部背景校正。</li>
	<li>数据归一化。为在不同阵列间比较信号，必须对每个微阵列的信号强度进行归一化处理。为排除异常值，使用去磷酸化微阵列中阳性对照（IgG斑点）信号的30%截尾均值进行数据归一化。 
	注：IgG斑点的信号在微阵列的磷酸化与去磷酸化过程中保持不变，适用于归一化。</li>
	<li>鉴定有活性的激酶。针对微阵列上显示的每个特征，计算其在自磷酸化与去磷酸化阵列中的归一化信号强度比值。设定1.5倍变化为阈值，用于识别有活性的激酶，其余特征均标记为无法发生自磷酸化（N/A）。</li>
	<li>计算在步骤12.5中鉴定出的每个激酶的活性，以调整后信号的百分比表示（即归一化阳性对照阵列（DMSO）的信号强度减去归一化阴性对照阵列（去磷酸化）的信号强度）。</li>
</ol>

<ol><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting protein kinases.</a> Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).</li>
<li>Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors+in+the+treatment+of+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases.</a> Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).</li>
<li>Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA-approved+small-molecule+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacological+Sciencies%22%5BJournal%5D)">FDA-approved small-molecule kinase inhibitors.</a> Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).</li>
<li>Heinrich, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+c-kit+receptor+tyrosine+kinase+activity+by+STI+571%2C+a+selective+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor.</a> Blood. 96 (3), 925-932 (2000).</li>
<li>Stagno, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+frontline+treatment+and+long-term+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes.</a> Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).</li>
<li>Ben Ami, E., Demetri, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safety+evaluation+of+imatinib+mesylate+in+the+treatment+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinions+in+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor.</a> Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).</li>
<li>Ramachandran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein microarrays.</a> Science. 305 (5680), 86-90 (2004).</li>
<li>Festa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+microarray+production+of+freshly+expressed+proteins+in+a+human+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu.</a> Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).</li>
<li>Rauf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+inhibition+of+ERBB4+reduces+cell+growth+in+a+WNT5A-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner.</a> Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+signature+of+autoantibody+biomarkers+for+the+early+detection+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer.</a> Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Autoantibodies+Associated+with+Basal-like+Breast+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prevention%22%5BJournal%5D)">Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Antibody+Immunome+in+Type+1+Diabetes+Using+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays.</a> Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Antibody+Targets+for+Tuberculosis+Serology+using+High-Density+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Autoantibody+Responses+between+Lung+Adenocarcinoma+and+Benign+Pulmonary+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules.</a> Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).</li>
<li>Montor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+Pseudomonas+aeruginosa+outer+membrane+protein+immunogenicity+using+self-assembling+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays.</a> Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).</li>
<li>Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+Protein-Protein+Interactions+Using+Nucleic+Acid+Programmable+Protein+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28click+chemistry%29-based+detection+of+global+pathogen-host+AMPylation+on+self-assembled+human+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).</li>
<li>Anderson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+signature+for+the+serologic+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).</li>
<li>Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B-cell+receptor+signaling+pathway+as+a+therapeutic+target+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL.</a> Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).</li>
<li>Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+in+B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib in B lymphoid malignancies.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).</li>
<li>Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cloning+and+expression+library+creation+for+functional+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics.</a> Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).</li>
<li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNASU+plasmid+and+PSI%3ABiology-Materials+repositories%3A+resources+to+accelerate+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

修饰与故障排除 
在优化激酶活性检测NAPPA芯片实验条件的过程中，观察到背景信号高和动态范围低的主要来源之一是打印混合液中使用的BSA。BSA提供了与氨基硅烷表面交联所必需的伯胺，并有助于将DNA和捕获抗体固定在点样位置。然而，BSA本身高度磷酸化，导致阵列上自磷酸化信号的检测难以与背景噪声区分。为解决此问题，测试了打印混合液中多种BSA的替代物，最终确定多聚赖氨酸（poly-lysine）是一种良好的替代选择。多聚赖氨酸不含任何磷酸化位点，因此未表达蛋白的阵列背景信号极低。此外，使用多聚赖氨酸打印的微阵列具有良好的可重复性，并能呈现较高水平的蛋白表达（图2）。
对标准NAPPA检测进行的下一个关键改进是增加了磷酸酶/DNase处理步骤。用磷酸酶处理微阵列可去除蛋白质在体外转录翻译（IVTT）体系中合成和捕获过程中发生的任何磷酸化修饰（图3）。这种磷酸化可能来源于蛋白自身的自磷酸化活性，或来自IVTT体系中残留的激酶活性。在表达完成后去除所有磷酸化修饰，有助于明确鉴定出具有活性并能发生自磷酸化的激酶（图3）。
方案中的关键步骤 
NAPPA 是一种稳定可靠的技术，但如预期一样，其中存在若干关键步骤。第一步是获取适当浓度的高质量 DNA。若使用质量较差或浓度过低的 DNA，将导致微阵列质量不佳，许多蛋白无法正常表达或表达水平不准确，从而减少阵列上可分析的蛋白质数量。第二个关键步骤是微阵列上蛋白质的表达。使用能够高效表达功能性蛋白的体外转录翻译（IVTT）系统，对于研究阵列上的激酶活性至关重要。
TKI筛选中的下一个关键步骤是如何处理微阵列。在实验方案的任何步骤中，微阵列均不得干燥，建议轻柔操作以避免产生划痕，因为划痕可能增加背景信号。由于整个实验中的所有芯片将相互比较，因此必须确保每个孵育步骤在所有载片上保持一致。例如，当处理20张芯片的批次时，应考虑完成单个芯片某一操作步骤所需的时间，以避免不同芯片间孵育时间出现差异。
最后，实验设计以及阳性对照和阴性对照的设置对于质量控制和数据分析至关重要。第一组对照包含在每个芯片上打印的对照点，包括阴性对照[例如空点（未打印任何物质）、水或空载体（仅表达标签）]，以及阳性对照[例如纯化的IgG，可被二抗检测，且不受磷酸化水平变化的影响]。这些对照共同用于评估微阵列的背景信号水平、打印过程中的可能残留污染以及检测方法的信号强度。
接下来的一组对照为药物筛选对照，包括去磷酸化和自磷酸化微阵列（在有或无DMSO的情况下）。如前所述，去磷酸化微阵列用于检测磷酸酶处理后的磷酸化水平，因此可作为所有其他实验的本底基准水平。本底水平越低，实验的动态范围就越高。自磷酸化微阵列表示所有微阵列中磷酸化的最大水平，其信号应强且清晰。该对照不仅用于数据分析，还可用于确认微阵列上的所有反应均已成功进行。
该技术的局限性 
目前，此处介绍的药物筛选技术的一个局限性在于，它只能筛选能够发生自磷酸化的蛋白激酶。一种可能的解决方案是在同一位置同时点样激酶和已知的底物。已有研究成功实现了两种不同蛋白质的DNA共点样15，表明该方法具有可行性。此外，芯片上展示的蛋白质可能未正确折叠，从而导致蛋白质失活。采用人源表达系统显著提高了芯片上检测到的激酶活性；然而，由于某些蛋白质仍处于失活状态，因此无法在芯片上对其进行分析。
第二个局限性在于使用广谱抗磷酸化酪氨酸抗体来检测磷酸化水平。尽管该抗体对磷酸化位点的基序不具有特异性，但所有检测到的磷酸化均发生在酪氨酸残基上，因而无法检测丝氨酸和苏氨酸及其相应的激酶。迄今为止，尽管多次尝试优化孵育和洗涤条件，已有十余种广谱抗磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体测试均未成功。因此，开发一种不依赖抗体的新型检测系统可能是扩展可筛选药物抑制作用的蛋白激酶种类的最佳方案。在此背景下，可选方案包括放射性标记或化学方法（如点击偶联技术）等。然而，这些方法均需进行一系列优化，以最大限度降低背景信号，并为检测提供良好的动态范围。
第三个局限性在于用于点样到芯片上的cDNA克隆的获取。cDNA克隆可通过任何克隆技术获得，包括位点特异性重组系统（如Creator或Gateway23）。另一种选择是从DNAsu文库（网址：&#60;https://dnasu.org/DNASU/Home.do&#62;）购买克隆，该文库提供了超过17,000个cDNA克隆，包括完整的人类激酶组，可直接用于构建NAPPA芯片24。
第四个局限性在于，并非每个实验室都配备有合适的设备来制备和筛选其自身的NAPPA芯片。本方案提供了替代方法，用于生成可打印在微阵列上的DNA，且无需高通量设备，同时还提供了手动完成所有杂交步骤的实验流程。然而，仍需能够使用点样仪和微阵列扫描仪。解决此问题的一个方案是利用位于&#60;http://nappaproteinarray.org/&#62;的NAPPA核心服务与设施，该平台以非营利性学术价格提供定制化的NAPPA微阵列。最后，与其他任何筛选方法一样，微阵列所获得的数据可能受到假阳性或假阴性等假象的影响，因此应通过正交检测方法进行验证。
相对于现有方法的意义 
目前市面上已有多种可用于蛋白激酶筛选的平台。其中一种常规方法是结合实验，该实验可使用蛋白片段、激酶结构域、包含激酶结构域及部分调控区域的较大蛋白片段，甚至全长蛋白进行。由于成本较低且表达与纯化流程简便，这些蛋白通常在细菌系统中表达。随后通过某种报告系统（例如荧光信号或标签的存在）来检测目标药物与蛋白之间的相互作用。这类方法的主要局限性在于，蛋白在与药物相互作用时未必处于活性状态，可能导致假阳性或假阴性结果的产生。蛋白片段尤其容易发生构象改变并丧失活性，因此所获得的所有数据都应使用具有活性的蛋白（最好是全长形式）进行验证。另一些平台的局限性在于仅能筛选ATP类似物，从而限制了其广泛应用。
目前大多数基于酶学方法的商业化TKI筛选服务仅使用目的激酶的野生型版本，有时仅包含少数特定突变体。鉴于接受TKI治疗的患者中耐药现象非常普遍，能够检测不同突变体对药物的反应性，对于选择最合适的抑制剂至关重要。由于NAPPA技术的特性，激酶突变体的筛选操作简便，易于实现，唯一需要的工具是将激酶突变体整合到NAPPA cDNA文库中，例如可通过位点特异性诱变技术实现。
未来应用 
在使用激酶抑制剂进行癌症治疗的过程中，最常见的治疗失败原因之一是在治疗期间药物靶点获得了突变。针对这些突变体对激酶抑制剂的反应进行筛选，对于选择第二代或第三代酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）以实现每位患者的个体化治疗至关重要。本文所介绍的药物筛选方法提供了一个无偏倚的筛选平台，可用于测试任何酪氨酸激酶抑制剂对人类基因组中所有酪氨酸激酶的抑制效果。由于NAPPA芯片上的蛋白质是由点样在芯片上的cDNA在体外表达产生的，因此可轻松将任何突变体形式加入cDNA文库，并在芯片上表达。激酶突变体在芯片上生成和表达的便利性，结合NAPPA技术的高通量能力，为研究激酶突变体及其对药物的反应提供了独特的环境，使NAPPA成为个体化药物筛选的理想工具，这也是精准医学的目标之一。

蛋白激酶负责其靶蛋白的磷酸化，能够调节控制多种细胞功能（如细胞增殖、分化、细胞死亡与存活）的复杂分子通路。激酶活性的失调与超过400种疾病相关，使得激酶抑制剂成为目前可用于治疗多种疾病（包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病以及炎症性和自身免疫性疾病）的主要药物类别之一1,2,3。
随着精准医学的发展，发现新的治疗方法（尤其是激酶抑制剂）在药物研发和临床应用上具有重要意义。可用于鉴定潜在新激酶/激酶抑制剂配对的方法有多种，包括从头设计激酶抑制剂，以及为已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的现有药物寻找新靶点。后者尤其具有吸引力，因为已有临床试验数据，可显著缩短药物进入临床应用所需的时间和降低成本。激酶抑制剂重定位的一个典型例子是伊马替尼（imatinib），该药物最初通过抑制BCR-Abl用于治疗慢性髓性白血病（CML），但也被成功用于治疗c-Kit过表达的胃肠道间质瘤（GISTs）4,5,6,7。
激酶抑制剂的筛选可通过结合实验或基于酶活性的实验进行。第一类实验主要关注蛋白质-药物相互作用，可提供诸如结合位点和亲和力等信息。由于在进行此类实验时激酶的活性状态未知，可能因蛋白质构象变化而遗漏某些相互作用或产生假阳性结果。另一方面，基于酶活性的实验要求蛋白激酶具有活性，能够提供有关抑制剂对酶活性影响的重要信息，但这类筛选通常更耗时且成本较高。目前，这两类实验均可从多个商业来源获得。它们为激酶抑制剂的筛选提供了可靠的方案，但仍存在一些局限性，包括：I）大多数方法需要对多个激酶逐一测试，导致大规模蛋白质筛选成本较高；II）可测试的激酶种类仅限于预先选定的一组野生型激酶以及部分已知的突变体形式，限制了对大量新发现的突变亚型的检测。
在此背景下，蛋白质微阵列是一种强大的技术平台，能够克服一些现有商业技术所存在的局限性。该方法适用于利用任何目标序列的全长且具有活性的蛋白质，进行基于酶学的高通量筛选实验。微阵列可通过自组装方法（如NAPPA，即核酸可编程蛋白质阵列）构建，其中蛋白质在实验前即时表达，从而提高阵列上展示的蛋白质确实具有生物活性的可能性。NAPPA上展示的蛋白质利用人源核糖体和分子伴侣蛋白进行合成，以提高其正确折叠和具备天然活性的可能性。
首先通过将编码目的基因并融合了捕获标签的cDNA与捕获试剂共同点样到微阵列表面，从而对蛋白质进行初始编程。随后利用体外转录和翻译（IVTT）系统在微阵列上合成蛋白质，并由捕获试剂将新表达的蛋白质固定在微阵列表面。表达后的NAPPA芯片可用于无偏倚、高通量地研究阵列表面上展示的蛋白质8,9。
此前的研究表明，NAPPA 芯片上展示的蛋白质能够正确折叠，从而与已知的相互作用伙伴结合10；此外，其酶活性在2018年首次得到利用，当时证实了微阵列上展示的蛋白激酶能够发生自磷酸化11。迄今为止，NAPPA 技术已应用于多种不同的研究领域，包括生物标志物发现12,13,14,15,16,17、蛋白质-蛋白质相互作用10,18、底物鉴定19以及药物筛选11。该平台的关键特性之一是其高度的灵活性，使其能够根据不同应用需求进行调整。
本文介绍了一种在自组装NAPPA阵列中筛选酪氨酸激酶抑制剂的实验方案。该平台经过优化，可高效展示具有活性的人源蛋白激酶，并用于分析蛋白激酶活性，具有背景信号低、动态范围高的优点。为将NAPPA技术应用于激酶抑制剂筛选，本研究实施了多项改进，包括：I）打印化学体系的调整；II）在进行激酶抑制剂筛选前对蛋白微阵列进行去磷酸化处理；III）优化阵列上磷酸化蛋白的检测方法。本方案属首次报道，为在NAPPA微阵列中开展激酶研究提供了独特的信息。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>364 孔板（用于点阵排列）</td><td>Genetix</td><td>x7020</td><td></td></tr><tr><td>800 &amp;micro;L 96孔收集板</td><td>Abgene</td><td>AB-0859</td><td></td></tr><tr><td>96针装置</td><td>博克尔</td><td>140500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Millipore-Sigma</td><td>1.00066</td><td></td></tr><tr><td>丙酮 99.9%</td><td>Millipore Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>96孔板用铝封膜</td><td>VWR</td><td>76004-236</td><td></td></tr><tr><td>氨基硅烷（3-氨基丙基三乙氧基硅烷）</td><td>皮尔斯</td><td>80370</td><td></td></tr><tr><td>小鼠来源的抗FLAG M2抗体</td><td>Millipore Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>抗Flag兔多克隆抗体</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>细胞信号传导</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;二水合磷酸甘油钠</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>37535</td><td></td></tr><tr><td>Brij 35</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>BP345-500</td><td></td></tr><tr><td>BS3（双磺基琥珀酰亚胺）</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>DeepWell 块，每箱 50 个</td><td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0661</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 水</td><td>Ambion</td><td>9906</td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA嵌入染料</td><td>Invitrogen</td><td>P11495</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 200 proof</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>滤板</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA77002804</td><td></td></tr><tr><td>透气密封圈，50 个/盒</td><td>ThermoFisher/AbGene</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>玻璃箱</td><td>Wheaton</td><td>900201</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl（盐酸）</td><td>默克-西格玛</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Millipore-Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>基于人类的体外转录翻译系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88882</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPure 小鼠 IgG 全分子</td><td>ThermoFisher/Pierce</td><td>31202</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>KCl（氯化钾）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（磷酸二氢钾）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>激酶缓冲液</td><td>细胞信号传导</td><td>9802</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾（KOAc）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P1190</td><td></td></tr><tr><td>λ蛋白磷酸酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>举升垫片，24 x 60 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25X60I24789001LS</td><td></td></tr><tr><td>无把手金属30片载玻片架</td><td>Wheaton</td><td>900234</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 氯化镁</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt; （原钒酸钠）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠（NaOAc）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaOH（氢氧化钠）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi / Maxi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.10 / 740414.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoprep Anion II</td><td>Macherey Nagel</td><td>740503.1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸</td><td>Millipore-Sigma</td><td>79617</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（0.01%）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A-005-C</td><td></td></tr><tr><td>蛋白磷酸酶（λ）</td><td>New England Biolabs</td><td>P0753</td><td></td></tr><tr><td>RNA酶</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>密封垫圈</td><td>Grace Bio-Labs, Inc</td><td>44904</td><td></td></tr><tr><td>硅胶包</td><td>VWR</td><td>100489-246</td><td></td></tr><tr><td>单孔板</td><td>ThermoFisher/Nalge Nunc</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠（3 M，pH 5.5）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>TB培养基（Terrific Broth）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T0918</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;制造商/型号&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可编程控温培养箱</td><td>Torrey Pines IN30 恒温培养箱（带冷却功能）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细菌培养摇床</td><td>ATR Multitron 摇床</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带液体废液收集阱的真空 manifold</td><td>96孔MultiScreen真空抽滤装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔自动移液器/液体处理仪</td><td>Genmate 或 Biomek FX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体分配器</td><td>Wellmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA微阵列仪</td><td>Genetix QArray2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动杂交仪</td><td>Tecan HS4800 Pro 杂交工作站</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微阵列扫描仪</td><td>Tecan PowerScanner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微阵列数据定量</td><td>Tecan Array-Pro Analyzer 6.3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

自组装人源蛋白微阵列中的激酶抑制剂筛选

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

激酶抑制剂的筛选对于深入理解药物特性以及发现具有临床意义的潜在新靶点至关重要。已有多种方法被报道用于实现此类筛选，但每种方法均存在其自身的局限性（例如，仅能筛选ATP类似物、局限于使用纯化的激酶结构域、同时检测少数几种激酶时即伴随显著成本，以及在筛选具有新突变的蛋白激酶时缺乏灵活性）。本文介绍一种可克服部分上述局限性的新方案，可用于无偏倚地筛选激酶抑制剂。该方法的一个优势在于能够跨多种蛋白比较激酶抑制剂的活性，既可在不同激酶之间进行比较，也可用于同一激酶的不同变体之间的比较。本方法采用基于人类细胞的体外转录与翻译系统（IVTT）表达蛋白激酶，从而构建自组装蛋白微阵列。微阵列上展示的蛋白具有酶活性，因而可用来测定激酶抑制剂的作用效果。下文将详细描述从微阵列制备、抑制剂筛选到数据分析的完整实验流程。

自组装NAPPA微阵列提供了一个稳定的平台，可用于多种不同的应用，包括生物标志物发现、蛋白质-蛋白质相互作用、底物鉴定以及药物筛选10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。
在NAPPA微阵列上研究激酶活性及筛选酪氨酸激酶抑制剂的整体方法如图1所示。首先，通过将cDNA和捕获试剂固定到包被的微阵列上，制备NAPPA微阵列。随后，以cDNA为模板，利用基于人源的体外转录翻译（IVTT）系统进行蛋白质的转录与翻译，新合成的蛋白质由捕获试剂固定在阵列表面9。可通过检测阵列上的DNA水平（验证打印一致性）或检测所展示的蛋白质水平（验证蛋白质表达与捕获效率）来监控微阵列的打印质量（图1）。为了降低背景信号并提高实验的动态范围，微阵列需依次进行以下处理：1）使用λ磷酸酶去除丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸残基上的磷酸化修饰，随后 2）使用DNase处理，以简化点位上的化学成分并降低背景信号（图1）。
下一步是自磷酸化反应，其中微阵列在不含ATP的激酶缓冲液中孵育（阴性对照阵列，称为去磷酸化微阵列），或在激酶缓冲液中添加ATP（阳性对照，称为自磷酸化阵列）或ATP + DMSO（溶剂对照）。需要强调的是，在此步骤中不添加任何外源激酶；因此，通过使用广谱抗磷酸化酪氨酸抗体，随后加入Cy3标记的二抗（图1），检测微阵列上每种展示激酶的磷酸化水平，从而量化其内在活性。
展示一组以四重复方式打印的人类蛋白激酶的 NAPPA-激酶芯片的质量控制结果如图2所示。通过DNA染色检测固定化DNA的水平，结果显示芯片上信号均匀，表明打印到芯片上的DNA量具有一致性。还可以观察到一些未进行DNA染色的特征点。这些特征点对应于某些未加入DNA的打印对照组，即空点（未打印任何物质）、水点、纯化IgG点（聚赖氨酸、交联剂和纯化IgG）以及仅打印混合液（完整的打印混合液：聚赖氨酸加交联剂和抗Flag抗体，不含任何DNA）。NAPPA-激酶微阵列上展示的蛋白水平在体外转录翻译（IVTT）反应后通过抗标签抗体进行检测评估。
在激酶筛选实验中，选用 Flag 作为标签，使用抗 Flag 抗体检测微阵列上展示的蛋白水平。如图所示，含有 cDNA 的大多数点样位点均成功展示了可检测水平的蛋白。部分不含 cDNA 的对照点也显示出抗 Flag 抗体信号：IgG 点（用于检测二抗活性）和空载体点（cDNA 仅编码标签）（图 2）。NAPPA-激酶微阵列在不同芯片之间表现出良好的可重复性，不同打印批次间蛋白展示水平的相关性高于 0.88（图 2）；在同一打印批次内，相关性更高，接近 0.92（数据未显示）。
接下来，使用抗磷酸化酪氨酸抗体检测阵列上展示的蛋白质的激酶自磷酸化活性（图3）。阵列上展示的蛋白质在表达后显示出高水平的蛋白质磷酸化（图3，左侧），这可能是由于阵列上展示的蛋白质本身具有内在激酶活性，或由IVTT反应体系中存在的活性激酶引起。经λ磷酸酶处理后，这些磷酸化信号被完全去除，随后将去磷酸化的微阵列用于激酶活性检测。去磷酸化后，在无ATP条件下进行的自磷酸化反应未检测到显著水平的磷酸化，符合预期；而在含有ATP的激酶缓冲液中孵育的微阵列，可在短至15分钟内检测到蛋白质磷酸化（图3）。在药物筛选实验中，为最大化可检测的激酶数量，激酶活性的测定在自磷酸化反应进行60分钟后进行。
通过比较蛋白质表达后立即测定磷酸化水平的微阵列（图3，左）与经过60分钟自磷酸化反应后测定的微阵列（图3，右），结果显示：i）仅在表达后发生磷酸化的蛋白质，提示这些蛋白质可被IVTT反应体系中存在的蛋白质外源性磷酸化，但不能发生自磷酸化；ii）仅在自磷酸化反应后发生磷酸化的蛋白质，提示这些蛋白质在蛋白质表达后无活性，需要激酶缓冲液中存在的辅助因子才能激活；或iii）在两组微阵列中均发生磷酸化的蛋白质，提示它们在两种条件下均具有活性（图3）。
以在NAPPA-激酶芯片上筛选酪氨酸激酶抑制剂的结果为例，本研究使用了三种在蛋白激酶中具有不同选择性的激酶抑制剂：staurosporine、imatinib 和 ibrutinib。所有筛选实验中，将去磷酸化的NAPPA微阵列在自磷酸化反应过程中与不同浓度的TKI共同孵育，TKI浓度范围为100 nM至10 µM。首先测试的TKI是staurosporine，这是一种广谱蛋白激酶抑制剂，在微阵列上对几乎所有被检测的激酶均表现出强烈的抑制作用11。
接下来测试了伊马替尼（imatinib），这是一种用于治疗慢性髓性白血病和胃肠道间质瘤的ABL和c-Kit抑制剂4,5,6,7。在NAPPA-激酶芯片上，伊马替尼显著降低了Abl1和BCR-Abl1的活性，而其他激酶则基本未受影响（图4A）。激酶活性的数据通过去磷酸化芯片进行归一化处理，并以阳性对照微阵列（仅载体）的百分比形式表示。TNK2（非相关激酶）、Abl1和BCR-Abl1的数据如图4B所示。正如预期，伊马替尼对Abl1和BCR-Abl1表现出选择性抑制作用。由于在阳性对照芯片上缺乏活性，c-Kit的数据无法得出明确结论。
最后，测试了伊布替尼（ibrutinib），一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase, BTK）共价抑制剂。伊布替尼目前用于治疗多种因BTK过度活化引起的血液系统恶性肿瘤，包括慢性淋巴细胞白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症21,22。图4C代表了伊布替尼筛选实验中获得的典型结果。图4D展示了ABL1（非相关激酶）、BTK（经典靶点）以及ERBB4（潜在新靶点）的激酶活性。数据表明，伊布替尼能够以剂量依赖的方式抑制ERBB4的活性。该抑制作用已在体外实验和基于细胞的检测中得到验证11，展示了本平台的强大能力。
综上所述，这些数据表明，NAPPA-激酶微阵列平台可用于酪氨酸激酶抑制剂的无偏筛选。此外，该筛选方法快速且易于定制，可灵活包含任何感兴趣的蛋白激酶变体。
<img alt="ATP通路的自磷酸化过程示意图；磷酸化检测；药物筛选设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：NAPPA芯片上酪氨酸激酶抑制剂的质量控制与筛选示意图。 NAPPA芯片上点样编码目标蛋白的cDNA，该cDNA融合有标签序列和捕获抗体。在体外转录和翻译反应（IVTT）过程中，合成的蛋白质通过标签被芯片表面的捕获抗体捕获。芯片的质量控制（QC）通过使用荧光DNA嵌入染料检测载玻片上点样的DNA水平，以及使用特异性识别标签的抗体检测芯片上展示的蛋白质水平来完成。在激酶筛选实验中，IVTT反应完成后，芯片需经DNase和磷酸酶处理，以去除点样的DNA以及蛋白质合成过程中可能发生的任何磷酸化修饰。去磷酸化处理后的芯片即可用于药物筛选。每次实验常规设置三组对照：（I）去磷酸化芯片，其自磷酸化反应在无ATP条件下进行；（II）自磷酸化芯片，其自磷酸化反应在含有ATP的条件下进行；（III）DMSO处理芯片（溶剂对照），其自磷酸化反应在ATP和DMSO同时存在的条件下进行。不同浓度激酶抑制剂处理的芯片组均遵循与DMSO处理组完全相同的实验流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微阵列分析：DNA染色、蛋白质检测及表达相关性的散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：自组装NAPPA-激酶阵列质量控制的代表性结果。 左图显示通过荧光DNA嵌入染料测定的DNA含量，中图显示通过抗Flag抗体检测的微阵列上展示的蛋白质水平。右侧为两批独立打印的NAPPA-激酶阵列上蛋白质展示水平的相关性图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="磷酸化实验；ATP存在下的自磷酸化；蛋白质印迹图；时间过程分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：NAPPA-激酶芯片中激酶活性的代表性结果。采用四重复排列展示蛋白激酶的微阵列，通过使用抗-pTyr抗体检测蛋白质磷酸化，并随后使用Cy3标记的抗小鼠抗体，以研究芯片上蛋白激酶的活性。对照芯片在自磷酸化反应中未进行磷酸酶/DNase处理，且未添加ATP，用于检测蛋白表达后（表达后）的背景磷酸化水平。其余微阵列经磷酸酶/DNase处理后，在无ATP条件下进行自磷酸化反应（去磷酸化微阵列，阴性对照）或在含ATP条件下进行（自磷酸化微阵列）。对于自磷酸化微阵列，自磷酸化反应时间分别为15分钟、30分钟、45分钟或60分钟，如图所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="激酶抑制实验结果；伊马替尼和依鲁替尼剂量反应的网格图和活性图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59886/59886fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：NAPPA-激酶阵列上酪氨酸激酶筛选的代表性数据。（A）将经磷酸酶/DNase处理的NAPPA-激酶阵列在自磷酸化反应过程中与不同浓度的伊马替尼共同孵育，并使用抗磷酸化酪氨酸抗体检测激酶活性。（B）暴露于伊马替尼的NAPPA-激酶阵列上观察到的激酶活性的定量结果。数据相对于阴性对照阵列（去磷酸化）信号进行归一化，并以阳性对照阵列（在DMSO存在下进行自磷酸化反应）信号的百分比表示。类似的数据也展示了依鲁替尼的筛选结果（C, D）。该图改编自Rauf等人的研究11。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/59886fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件1. 使用自动杂交仪在NAPPA阵列中筛选酪氨酸激酶抑制剂的替代方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59886/Supplementary_File_1_Festa_and_Labaer.docx">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种用于激酶抑制剂筛选的自组装人源蛋白质微阵列的详细制备方案。

激酶抑制剂的筛选对于深入了解药物特性以及发现潜在的新靶点至关重要……

NAPPA 是一种强大的蛋白质微阵列平台，可用于无偏倚、高通量地研究蛋白质活性与功能。NAPPA 上展示的蛋白质是在基于人类的表达系统中产生的，该系统使用人源核糖体和分子伴侣，以提高蛋白质天然折叠和活性的可能性。利用 NAPPA 芯片筛选激酶抑制剂，为新药测试以及与临床相关的激酶突变研究提供了新平台。采用NAPPA技术制备的蛋白质微阵列可用于多种不同的应用，包括生物标志物发现、蛋白质-蛋白质相互作用、底物鉴定以及药物筛选。在实验过程中需执行质量控制步骤，对DNA制备物、DNA微阵列以及蛋白质微阵列的质量进行检测。如果任何步骤中质量不佳，只需重新开始。本实验操作由本实验室技术员 Lisa Miller 示范。为进行实验室内部高通量小型质粒提取，首先将细菌接种至96孔板中的琼脂平板，然后培养16小时。第二天，向深孔板的每个孔中加入 1.5 毫升优质肉汤培养基，并添加氨苄青霉素抗体。所用抗体取决于质粒上的筛选标记。随后，用 80% 乙醇对 96 针装置进行消毒，并通过火焰灭菌。使用无菌的96针装置从过夜培养的琼脂平板上挑取菌落，并将其浸入深孔板的孔中以接种培养物。用透气封膜覆盖深孔板，于37摄氏度、300至800 rpm条件下在摇床中培养22至24小时。随后，离心收集菌体，并根据论文所述方法重悬培养物。通过向每个孔中加入200微升溶液二来裂解细菌，用铝箔封板，倒置混匀五次。细胞准确孵育五分钟。为中和溶液，加入200微升溶液三，用铝箔封板，倒置混匀五次。然后，以 3800 G、4 °C 离心 30 分钟，以澄清裂解液上清。为制备阴离子交换树脂板，首先混合阴离子交换悬液，并将悬液倒入玻璃槽中。将滤板堆叠在深孔板上方，作为废液收集容器。然后，使用宽口 P1000 吸头混匀悬液，并将 450 微升悬液转移至过滤板的每个孔中。离心后弃去滤过液。接着，将裂解液上清转移至树脂板与深孔块的叠合装置中。将叠放的板在30 × g 条件下以最慢升速离心5分钟，弃去流出液。洗涤柱时，向每个孔中加入400 µL N3洗涤缓冲液。将树脂板转移至真空 manifold 以去除洗涤缓冲液。重复洗涤步骤三次，然后以30 × g短暂离心5分钟，去除残留的洗涤缓冲液。为洗脱DNA，将树脂板置于干净的800 µL收集板上。向每孔加入300 µL N5溶液，在室温下静置10分钟。随后，将叠放的板以20 × g离心5分钟，缓慢加速至233 × g并维持1分钟。使用前将培养板置于负20摄氏度保存。首先，将载玻片放置于支架上，并浸入盛有包被液的玻璃容器中，包被液为含2%氨基硅烷试剂的丙酮溶液。摇动载玻片15分钟。然后，用丙酮冲洗载玻片，再用清水进行最后冲洗。接着，使用加压空气干燥载玻片。从各个角度吹气约三分钟，直至所有水滴完全去除。将包被的载玻片置于密封盒内的金属架上，于室温保存。接下来，按照文中的描述进行DNA沉淀。然后，将DNA沉淀重悬于20 µL超纯水中，并在1000 rpm条件下振荡2小时。为制备芯片样品，向每份DNA样品中加入10微升新配制的打印混合液，该混合液包含抗体、交联剂和多聚赖氨酸。用铝箔密封板后，在室温下以1000 rpm振荡90分钟。将板在4摄氏度下过夜保存。在打印当天，轻轻涡旋并离心反应板。将每个样本28微升转移至384孔板中。将氨基硅烷包被的载玻片和384孔板放置于点样仪载物台上，启动微阵列打印程序。打印完成后，对微阵列进行标记。微阵列可保存数月，以备后续使用。为检测DNA含量水平，将玻片放入移液管盒中，并用50毫升封闭缓冲液进行封闭处理。将载玻片置于室温下的摇床上孵育一小时。然后弃去溶液，加入20毫升封闭缓冲液和33微升荧光DNA嵌入染料，在振荡条件下孵育15分钟。孵育结束后，立即用超纯水冲洗载玻片，并用加压空气吹干。微阵列即可用于扫描。若需表达微阵列，按前述方法对载玻片进行封闭处理，随后用超纯水冲洗，并用过滤压缩空气吹干。将密封垫圈安装到每张载玻片上。在载玻片上加入130微升体外转录与翻译混合液，轻轻按压密封垫圈，使体外转录与翻译混合液均匀铺展，覆盖整个芯片区域，且无气泡产生。将小型圆形端口密封圈贴在两个端口上。在30摄氏度下孵育90分钟以表达蛋白，随后在15摄氏度下孵育30分钟以固定目标蛋白。然后移除垫圈，用含脱脂奶粉的15毫升TBST溶液将芯片洗涤三次，每次5分钟，并在同一溶液中封闭1小时。为检测芯片上的蛋白，移除含脱脂奶粉的TBST溶液，将芯片置于网格板上，加入600微升一抗（小鼠抗Flag抗体），按1:200比例用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释后使用。室温孵育一小时。用50毫升含5%脱脂奶粉的1×TBST缓冲液，在摇床上洗涤载玻片，每次五分钟，共洗涤三次。对二抗重复上述步骤。孵育一小时结束后，在摇床中用1×TBST洗涤载玻片，每次五分钟，共洗涤三次。随后，用超纯水快速冲洗载玻片，并用加压空气吹干。载玻片即可用于扫描。进行磷酸酶和DNase处理时，按照文中的描述，使用添加了3% BSA的TBST缓冲液洗涤并封闭表达芯片。然后，将芯片放置于网格板上，加入200 µL磷酸酶-DNase溶液，并覆盖一张微阵列盖玻片以防止蒸发。在烘箱中30摄氏度孵育1小时30分钟。然后，在摇床上用1×TBST和0.2摩尔氯化钠洗涤载玻片，每次5分钟，共洗三次。进行药物处理和激酶反应时，将载玻片置于网格板上，并加入200微升药物激酶溶液。加盖盖玻片以防止蒸发。在烘箱中于 30 摄氏度孵育一小时。获得可重复数据的关键在于各玻片之间的孵育时间保持一致。这在激酶反应期间尤为重要。应计算处理每张载玻片所需的时间。随后，在摇床中用1×TBST和0.2摩尔氯化钠洗涤载玻片，每次五分钟，共洗涤三次。使用磷酸化酪氨酸抗体作为一抗，以含3%牛血清白蛋白的TBST按1:100稀释，进行重复蛋白检测。与一抗孵育后，使用1× TBST和3%牛血清白蛋白进行洗涤；与二抗孵育后的洗涤步骤则使用TBST。洗涤并干燥，操作同前。进行图像采集时，将微阵列芯片装入载玻片架盒中，再将盒体装入微阵列扫描仪。使用优化后的设置扫描所有微阵列芯片，并在跨实验比较图像时，记得关闭自动增益功能。将图像转移至定量分析软件，将网格与斑点对齐，并对微阵列上每个特征的信号强度进行定量。随后进行统计分析。在本研究中，微阵列显示大多数含有互补DNA的斑点均成功呈现出可检测水平的蛋白质。NAPPA激酶微阵列在不同芯片之间表现出良好的可重复性，不同打印批次间蛋白质表达水平的相关性高于0.88。NAPPA激酶阵列中激酶活性的代表性结果显示，蛋白质表达后出现高水平的磷酸化。通过比较磷酸酶处理后立即检测磷酸化水平的微阵列与经过60分钟自磷酸化反应后再检测的微阵列，表明阵列上存在具有活性的蛋白激酶。在NAPPA激酶芯片上，伊马替尼显示出对ABL1和BCR-ABL1活性的显著抑制，而其他激酶则基本未受影响。以去磷酸化芯片为归一化对照，并以阳性对照微阵列的百分比表示，结果显示伊马替尼对ABL1和BCR-ABL1具有选择性抑制作用。依鲁替尼筛选的典型结果表明，ABL1非相关激酶的激酶活性未受影响。BTK 是其经典靶点，而 ERBB4 可能是其新的潜在靶点，在伊布替尼存在时表现出活性降低。数据表明，伊布替尼能够以剂量依赖的方式抑制 ERBB4。蛋白质微阵列筛选的成功在很大程度上依赖于微阵列本身的质量。应使用多种阳性对照和阴性对照特征，以确保数据分析的准确性。NAPPA 激酶检测是一种筛选平台，因此所获得的数据应在后续实验中进行验证，后续实验可能包括体外激酶检测或基于细胞的检测。由于本方案从 cDNA 开始，因此可轻松将任何激酶突变或变异整合到微阵列中，并进行高通量研究。在制备阴离子交换树脂悬液和板时，建议佩戴口罩，以防止可能吸入树脂颗粒。

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