Name: 使用自动图像处理分析裂变和萌芽酵母中的脂滴含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习使用自动图像处理技术定量分析裂殖酵母、日本裂殖酵母和酿酒酵母中的脂滴含量。该方法通过荧光显微镜和MATLAB图像分析流程，实现无偏倚、高通量的脂质储存评估，为脂质代谢研究提供标准化数据。

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本工作得到了查理大学基金 PRIMUS/MED/26、GAUK 1308217 和 SVV 260310 的资助。我们感谢 Ondřej Šebesta 在显微成像及图像分析流程开发方面的帮助。我们感谢 ReGenEx 实验室提供的 S. cerevisiae 菌株，以及 JapoNet 和 Hironori Niki 实验室提供的 S. japonicus 菌株。ppc1-88 菌株由日本酵母遗传资源中心提供。共聚焦与荧光显微镜实验在共聚焦与荧光显微镜实验室完成，该实验室由欧洲区域发展基金和捷克共和国国家预算共同资助（项目编号：CZ.1.05/4.1.00/16.0347 和 CZ.2.16/3.1.00/21515）。

1. 溶液与培养基的制备
<ol>
	<li>配制脂质染色液。
	<ol>
		<li>配制脂质染色储备液：将10 mg BODIPY 493/503溶解于10 mL无水DMSO中（终浓度为1 mg/mL）。建议将整瓶10 mg的BODIPY 493/503全部溶解，以避免称量过程中样品损失。 
		注意：DMSO可经皮肤吸收。操作时请穿戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>通过将100 µL的1 mg/mL BODIPY 493/503储备液与900 µL无水DMSO混合，配制工作用脂质染色液（终浓度为0.1 mg/mL）。</li>
		<li>将储备液和工作液分装后，于-20 °C保存。 
		注意：溶解后的BODIPY 493/503在-20 °C下可稳定保存数年，但需避光并防止受潮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为细胞边界可视化配制储备液：将整瓶25 mg级联蓝葡聚糖（Cascade Blue dextran）溶于2.5 mL去离子水中（终浓度为10 mg/mL）。将储备液分装后，避光保存于-20 °C。</li>
	<li>为显微镜载玻片包被液配制溶液：将5 mg大豆凝集素溶于5 mL去离子水中（终浓度为1 mg/mL）。将凝集素溶液分装后，保存于-80 °C。 
	注意：凝集素溶液在-80 °C下可稳定保存数年；正在使用的分装样品可短期存放于-20 °C。</li>
	<li>配制培养基。
	<ol>
		<li>配制400 mL用于S. pombe和S. japonicus的复杂型YES培养基：在500 mL瓶中，将2 g酵母提取物和0.1 g SP补充剂（如营养缺陷型突变株需要）溶于340 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入60 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20%（w/v）葡萄糖溶液。</li>
		<li>配制400 mL用于S. pombe和S. japonicus的定义型EMM培养基：在500 mL瓶中，将4.9 g不含葡萄糖的EMM肉汤溶于360 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入40 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20%（w/v）葡萄糖溶液。 
		注意：有关S. pombe和S. japonicus培养的一般指南，请分别参见文献25和26。</li>
		<li>配制300 mL用于Saccharomyces cerevisiae的复杂型YPAD培养基：在500 mL瓶中，将3 g酵母提取物、6 g蛋白胨和30 mg硫酸腺嘌呤溶于270 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入30 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20%（w/v）葡萄糖溶液。</li>
		<li>配制300 mL用于S. cerevisiae的定义型最低限度培养基：在500 mL瓶中，将2 g酵母氮源基础（不含氨基酸）溶于270 mL去离子水中，高压灭菌。在无菌条件下加入30 mL已单独高压灭菌或滤膜除菌的20%（w/v）葡萄糖溶液。 
		注意：有关S. cerevisiae培养的一般指南，请参见文献27。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>将 S. pombe 或 S. japonicus 培养至对数生长期或早期静止期。
	<ol>
		<li>早晨，用新鲜的裂殖酵母生物量接种5 mL YES培养基，在32 °C、振荡（180 rpm）条件下培养数小时。 
		注意：所有培养均应使用体积为培养液体积10倍的锥形瓶，以确保充分通气。一些实验室倾向于在30 °C下培养裂殖酵母，但32 °C的培养温度可缩短倍增时间，且对细胞无不利影响，从而减少实验所需的总时间25,28。</li>
		<li>同一天的傍晚（培养至少6小时后），用新鲜YES培养基将培养物稀释至最终体积为10 mL，使其在次日早晨达到目标光密度（OD）（或细胞数/mL），并在32 °C、振荡（180 rpm）条件下继续培养。了解所用每种菌株的倍增时间有助于准确确定稀释倍数（使用公式1）。 
		<img alt="微生物生长计算公式，用于光密度调整的 Vculture 公式。" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
		其中 Vculture 为稀释所需前培养液体积，Vfinal 为新培养液的总体积（标准培养为10 mL），ODfinal 为次日早晨需达到的目标OD值，ODcurrent 为当前测得的前培养液OD值，t 为细胞生长至收获时的时间，tlag 为延滞期持续时间（取决于实验室条件，需通过实验确定），tDT 为菌株的倍增时间。 
		注意：若需分析对数生长期细胞，应避免前培养物进入静止期，因为这会显著改变细胞生理状态（包括脂滴含量），并持续影响后续数代细胞。</li>
		<li>成像当天早晨，若培养物OD略高于所需值（针对对数生长期细胞），应使用新鲜YES培养基稀释，并继续培养至少两个倍增时间后再进行脂滴染色。否则可直接进入染色步骤（第3节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 S. cerevisiae 培养至对数生长期和静止期。
	<ol>
		<li>下午，用少量新鲜芽殖酵母生物量接种10 mL YPAD培养基，并在30 °C、振荡（180 rpm）条件下过夜培养。</li>
		<li>成像当天早晨，将培养物用YPD培养基稀释至OD 0.1，并继续培养至所需OD值（例如，对数生长期为OD 1）。任何培养物稀释操作均按步骤2.1.2所述进行。随后进入染色步骤（第3节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脂滴染色
<ol>
	<li>为每个待成像样品准备一个显微镜盖玻片。使用水平放置的移液器吸头的长边将1 µL的玻片涂层溶液均匀涂布于洁净的盖玻片上。让涂层溶液完全干燥，并将盖玻片存放于无尘环境中。 
	注意：如需要，可在使用前对载玻片和盖玻片进行清洗。清洗步骤包括：用洗洁精洗涤，用水冲洗，3%盐酸中浸泡过夜，再用蒸馏水洗涤。清洗后的载玻片和盖玻片应保存在纯乙醇中，直至使用。</li>
	<li>根据需要测定细胞培养物的OD值或每毫升细胞数量。尽量使所有测试菌株的数值相近，以确保实验条件具有可比性。</li>
	<li>将每种细胞培养物各1 mL转移至1.5 mL微量离心管中。仅针对S. cerevisiae，加入5 µL玻片涂层溶液，短暂涡旋混匀，并在30 °C下振荡孵育5分钟。</li>
	<li>向每份细胞等分试样中加入1 µL脂质染色溶液，短暂涡旋混匀；然后加入10 µL细胞边界可视化溶液，再次短暂涡旋混匀。 
	注意：请勿预先混合两种染料溶液，否则会导致BODIPY 493/503的荧光淬灭。</li>
	<li>通过离心（1,000 x g，3分钟，室温）收集细胞，并移除几乎全部上清液（约950 µL）。用残留的上清液重悬细胞。</li>
	<li>取2 µL浓细胞悬液滴加到凝集素包被的盖玻片上，然后将其置于洁净的显微镜载玻片上。细胞应形成单层。应尽快进行显微观察（第4节），以尽量减少成像伪影；每次处理最多两个样品。</li>
</ol>
4. 显微镜设置与成像
<ol>
	<li>优化成像条件。 
	注意：显微镜的设置需要长时间暴露于强光源下，这可能会对样品造成损伤并导致结果偏差。因此，应使用专门的样品载玻片来设置成像条件，该载玻片将不再用于脂滴（LD）的定量分析。
	<ol>
		<li>使用相差或微分干涉差（DIC）模式对细胞进行聚焦。 
		注意：可采集相差或DIC图像作为参考，但在自动图像分析步骤中不会使用这些图像。</li>
		<li>设置z轴层扫范围以覆盖整个细胞体积。总垂直距离取决于细胞大小；光学切片数量取决于物镜的数值孔径（z轴上的点扩散函数）。设置焦点相对于中心焦平面进行移动。 
		注意：最佳切片层数通常由显微镜控制软件自动设定，无需手动计算。S. pombe的典型细胞宽度为3–5 µm，S. japonicus为4–7 µm，S. cerevisiae为3–7 µm。</li>
		<li>为成像脂滴（LDs），在绿色通道中设置光照强度和曝光时间（BODIPY的激发和发射最大值分别为493 nm和503 nm）。 
		注意：BODIPY 493/503是一种非常明亮的荧光染料；然而，在过强光照下可能迅速发生漂白。此外，活细胞中的脂滴具有移动性，因此应尽量缩短曝光时间，并首先完整采集绿色通道的z轴层扫图像（在切换至蓝色通道之前），以避免产生模糊伪影。同时，需考虑相机信号强度的线性范围，防止像素饱和。</li>
		<li>为成像细胞边界，在蓝色通道中设置光照强度和曝光时间（Cascade Blue葡聚糖的激发和发射最大值分别为400 nm和420 nm）。 
		注意：蓝色通道的信号强度用于图像分割，但不直接用于脂滴定量分析。因此，该通道的最优设置对分析本身并非至关重要。</li>
		<li>如有可能，在显微镜控制软件中创建自动化的实验流程，以便在标准化条件下对多个样品进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像条件优化完成后，对用于定量分析的样品进行成像。按照步骤4.1所述方法，对细胞进行聚焦，并在绿色和蓝色通道中成像。 
	注意：所有图像必须使用相同的设置采集，以便在不同样品间进行比较。每个样品应采集多个视野图像，以获得可靠且具有代表性的数据。</li>
	<li>将蓝色和绿色通道的z轴层扫图像保存为16位多层TIFF文件（即每个视野对应两个文件）。在相应的文件名中包含“green”或“blue”字样。随后进行图像分析（第5节）。</li>
</ol>
5. 图像分析
<ol>
	<li>目视检查所获取图像的质量。
	<ol>
		<li>在 ImageJ29,30 或其他合适的图像分析软件中打开显微图像。</li>
		<li>删除在采集过程中有大量细胞发生移动（从而产生模糊伪影）的图像序列。</li>
		<li>删除蓝色通道中含有高度荧光非细胞颗粒的图像序列（例如载玻片或盖玻片上的污垢、培养基中的杂质）。 
		注意： 蓝色通道中非常明亮的非细胞物体可能会导致细胞检测伪影，或干扰其周围细胞的检测。</li>
		<li>删除含有大量死细胞的图像序列（即与活细胞相比蓝色荧光增强的细胞）。 
		注意： 样品中存在少量死细胞通常不会造成问题，这些细胞会在分析过程中被自动剔除；但偶尔一些死亡或濒死细胞可能被分割算法误识别为活细胞，从而影响报告结果的准确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 MATLAB 软件中分析图像。
	<ol>
		<li>创建一个主文件夹，并将所有 MATLAB 脚本复制到该位置。</li>
		<li>创建一个子文件夹（“pombe”、“cerevisiae” 或 “japonicus”），并将输入的 TIFF 图像文件复制到该文件夹中。</li>
		<li>启动 MATLAB，打开脚本 MAIN.m 并运行。在菜单中选择待分析的酵母物种，然后开始图像处理。 
		注意： 细胞和脂滴（LD）检测所需的部分参数已针对特定物种预设，其余参数则在图像处理过程中自动确定。这些预设值是通过实验确定的，取决于多个因素，如物镜放大倍数、相机类型和灵敏度以及成像设置。如有需要，用户可编辑脚本文件以修改物种特异性预设值，使其更符合实验条件。例如，在细胞识别过程中，可接受的对象大小由“minArea”和“maxArea”参数定义，对象边界内填充体积的最小比例由“Solidity”参数定义。在脂滴识别中，亮度阈值由“th”参数设定（其数值主要受图像位深度和荧光信号强度影响），最大可接受脂滴大小由“MaxArea”参数设定。</li>
		<li>使用电子表格编辑器或统计软件按需检查和处理输出文件；该工作流程生成以分号分隔的 CSV 文件，以及包含已检测细胞对象和脂滴的分割 TIFF 文件。 
		注意： 该工作流程将图像分割为背景和细胞对象，其中每个细胞对象可能由多个相邻细胞组成。因此，“xxxx_cells.csv”文件中的输出并不代表单细胞数据，仅可用于计算单位细胞体积的指标。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

了解脂质代谢及其调控机制对于基础生物学以及临床和生物技术应用都具有重要意义。脂滴（LD）含量是反映细胞脂质代谢状态的一个便捷指标，其中荧光显微镜是测定脂滴含量的主要方法之一。本方案可实现对三种不同且形态各异的酵母物种中单个脂滴的自动检测与定量描述。据我们所知，目前尚无针对裂殖酵母的类似工具。用于图像处理的 MATLAB 脚本作为补充文件提供，同时也可通过 Figshare 数据库获取（DOI 10.6084/m9.figshare.7745738），其中包括本文所有的原始和处理后的图像数据及表格数据、CSV 输出文件的详细说明，以及用于下游数据分析和可视化的 R 脚本。此外，最新版本的 MATLAB 脚本也可从 GitHub 获取（https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis）。
成功的脂滴（LD）分析在很大程度上依赖于所获得的原始荧光图像的质量。为了使分割算法达到最佳性能，显微镜观察应使用无尘的洁净玻璃载片，细胞应形成单层（每个视野中的实际细胞数量并非关键参数），且不应含有大量死细胞。此外，z轴层析成像应从细胞焦平面略下...

脂质在细胞能量代谢和碳代谢、膜组分的合成以及生物活性物质的生成中发挥着关键作用。脂质代谢会根据环境条件、营养物质的可利用性以及细胞周期阶段进行精细调控1。在人类中，脂质代谢与肥胖、2型糖尿病和癌症等疾病密切相关2。在工业领域，由酵母等微生物产生的脂质被视为一种有前景的可再生柴油燃料来源3。细胞将中性脂质储存在所谓的脂滴（LDs）中。这些在进化上保守的结构由三酰甘油、甾醇酯、外层的磷脂单层以及相关蛋白组成1。脂滴起源于内质网，表现出随细胞周期或生长阶段变化的动态特征，并在细胞脂质稳态中发挥重要作用1。在不同生长条件下检测脂质代谢或筛选突变体时，脂滴的数量和形态可作为便捷的替代指标。鉴于脂滴具有高度动态的特性，能够分析单个脂滴特性的技术在脂质代谢研究中尤其受到关注。
多种酵母物种已被用于描述脂质相关代谢途径及其调控机制，或在生物技术中用于生产有价值的化合物或燃料1。此外，对于模式酵母，如芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae 或进化关系较远的裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe，已有全基因组敲除菌株文库可供用于高通量筛选4,5。最近，已在 S. pombe 中描述了脂滴的组成与动态变化6,7,8,9，并在新兴的模式酵母 Schizosaccharomyces japonicus 中分离出与脂质代谢相关的突变体10。
目前有多种技术可用于研究脂滴（LD）的含量与动态变化。大多数方法采用亲脂性染料对脂滴进行染色，例如尼罗红（Nile Red）或BODIPY 493/503。其中后者具有更窄的激发和发射光谱，并对中性脂质（即脂滴）相较于磷脂（细胞膜）具有更高的特异性11。荧光光度法和流式细胞术已成功应用于多种真菌物种，用于揭示影响储存脂质含量的基因和生长条件12,13,14,15。尽管这些方法适用于高通量应用，但无法测量单个细胞内脂滴的数量和形态，而这些参数在不同生长条件和基因型之间可能存在显著差异。相干拉曼散射或数字全息显微术是无需标记的检测方法，可提供脂滴水平的数据，但需要专用且昂贵的设备16,17,18。相比之下，荧光显微镜可在利用常规仪器和图像分析软件的基础上，提供有关脂滴含量的详细信息。目前已存在多种分析流程，其在从图像数据中识别细胞/脂滴方面的复杂程度和自动化水平各不相同，并针对不同细胞类型进行了优化，例如含有较大脂滴的后生动物细胞19,20,21，或出芽酵母17,22,23。其中一些方法仅适用于二维图像（例如最大投影图像），可能无法可靠地描述细胞内的脂滴含量。据我们所知，目前尚无针对裂殖酵母显微图像数据进行脂滴含量和形态分析的工具。开发自动化且稳健的脂滴水平分析方法将提高检测灵敏度和统计功效，并为多种酵母物种中的中性脂质含量提供丰富的信息。
我们开发了一种用于分析酵母细胞三维荧光显微图像中脂滴（LD）含量的工作流程。活细胞分别用BODIPY 493/503和Cascade Blue葡聚糖染色，以可视化脂滴并确定细胞边界。细胞被固定在玻璃载玻片上，并使用标准的落射荧光显微镜进行z轴层扫成像。随后，图像由基于MATLAB（一种广泛使用的商业统计分析软件包）开发的自动化流程进行处理。该流程包括图像预处理、分割（区分细胞与背景，去除死细胞）以及脂滴识别。最终以表格形式提供丰富的脂滴水平数据，例如脂滴大小和荧光强度，这些数据可兼容主流电子表格软件工具。该工作流程已成功用于确定氮源可利用性对S. pombe24脂质代谢的影响。本文进一步在S. pombe、S. japonicus和S. cerevisiae中验证该工作流程的功能，采用影响细胞脂滴含量的培养条件或突变体进行演示。

<table><tbody><tr><td>12 位单色 CCD 相机 Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&amp;nbsp;</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>腺嘌呤半硫酸盐，&amp;ge;99%</td><td>Merck</td><td>A9126-25G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>用于中性脂质染色</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖，&amp;ge;99.5%</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡聚糖，级联蓝，分子量 10,000，阴离子型，可与赖氨酸交联固定</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>用于细胞负染色</td></tr><tr><td>二甲基亚砜，&amp;ge;99.5%</td><td>Merck</td><td>D4540</td><td>或更高纯度，保存于分子筛中以保持无水状态</td></tr><tr><td>不含葡萄糖的 EMM 培养基</td><td>Formedium</td><td>PMD0405</td><td>也可由单一组分自行配制培养基</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td>&amp;nbsp;</td><td>或同等软件；用于显微图像数据的目视检查</td></tr><tr><td>高精度盖玻片，22 mm × 22 mm，1.5 号</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>可使用任何 1.5 号盖玻片</td></tr><tr><td>MATLAB 图像处理工具箱，版本 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>大豆凝集素（Glycine max 来源）</td><td>Merck</td><td>L1395</td><td>用于细胞在载玻片上的固定</td></tr><tr><td>MATLAB 软件，版本 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微镜载玻片，26 mm × 76 mm，厚度 1 mm</td><td>Knittel Glass</td><td>L762601.2</td><td>使用适配显微镜载物台的任意载玻片，接种细胞前需彻底清洗</td></tr><tr><td>配备自动 Z 轴物镜移动功能的 Olympus CellR 显微镜</td><td>Olympus</td><td>&amp;nbsp;</td><td>或同等设备</td></tr><tr><td>五通道滤光片组</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td><td>明场、绿色和蓝色通道已足够</td></tr><tr><td>MATLAB 信号处理工具箱，版本 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SP 补充剂</td><td>Formedium</td><td>PSU0101</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>可运行 MATLAB 的普通办公计算机</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MATLAB 统计与机器学习工具箱，版本 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微生物学用通用蛋白胨 M66</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UPLSAPO 60XO 物镜</td><td>Olympus</td><td>&amp;nbsp;</td><td>或同等物镜</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>不含氨基酸的酵母氮源基础</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用自动化图像处理分析裂殖酵母和芽殖酵母中的脂滴含量

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

脂质代谢及其调控是基础生命科学、应用生命科学和生物技术领域共同关注的重要课题。在这一领域中，多种酵母物种被用作脂质代谢研究的模型或用于工业级脂质生产。脂滴是高度动态的储存结构，其细胞内含量可作为反映脂质代谢状态的便捷指标。荧光显微镜技术是定量分析细胞内脂滴的首选方法，因其依赖于广泛可用的设备，并能够对单个脂滴进行分析。此外，显微图像分析可实现自动化，从而显著提高整体分析通量。本文介绍了一种针对三种模式酵母物种中单个脂滴进行自动检测与定量描述的实验与分析工作流程，这三种酵母分别为裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe和Schizosaccharomyces japonicus，以及芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae。使用BODIPY 493/503对脂滴进行荧光标记，同时在培养基中添加细胞不可渗透的荧光葡聚糖，以帮助识别细胞边界。细胞在绿色和蓝色通道中接受三维落射荧光显微成像，所得的z轴层扫图像由MATLAB分析流程自动处理。该流程输出以表格形式呈现的丰富定量数据，包括细胞内脂滴含量及单个脂滴的特征参数，适用于主流电子表格软件或统计分析软件的后续分析。我们还提供了在不同影响细胞脂质代谢条件下脂滴含量的示例分析。

整个过程总结如下 图1 适用于裂殖酵母（芽殖酵母的工作流程类似），下文提供了如何利用该工作流程在已知影响细胞脂滴含量的不同条件下，研究三种不同酵母物种中脂滴含量的示例。每个示例代表一次独立的生物学实验。
<img alt="脂滴分析工作流程；显微成像示意图；细胞成像；MATLAB自动化；数据分割。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验与分析工作流程的示意图。 以裂殖酵母为例展示该工作流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59889/59889fig01v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
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本文介绍了一种基于 MATLAB 的自动化检测方法，用于对裂殖酵母和芽殖酵母细胞荧光显微镜图像中的脂滴进行定量描述。

脂质代谢及其调控机制在基础生命科学、应用生命科学和生物技术领域均受到广泛关注。在这方面，多种酵母物种是……

本方案以无偏倚且标准化的方式，实现对多种酵母物种中细胞储存脂质含量从小规模到大规模的定量分析。该技术可快速处理显微图像，并提供详细的定量输出结果，便于比较不同样本，例如各种突变株以及在不同条件下培养的细胞。首先，请参照随附的文字版实验方案，制备染色溶液、培养基和细胞。确保在开展实验前细胞处于健康状态并处于所需的生长阶段。接下来，为每个待成像样品准备一个显微镜盖玻片。使用水平放置的移液器吸头的长边，将一微升载玻片包被溶液均匀涂布于洁净的盖玻片上。让包被溶液完全干燥，然后将盖玻片置于无尘环境中保存。接下来，测定细胞培养物的光密度；对于需在相同生长阶段进行分析的培养物，应使所有待测培养物的光密度值尽可能接近，以确保实验条件具有可比性。随后，用移液器将一毫升细胞培养物转移至1.5毫升的微量离心管中。仅针对酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞，向离心管中加入五微升（5 µL）载玻片包被溶液。随后，短暂涡旋所有微量离心管，并在30°C条件下振荡孵育五分钟。接着，向每份培养等分试样中加入一微升（1 µL）脂质染色溶液，并短暂涡旋混匀。然后加入10 µL细胞边界可视化溶液，再次短暂涡旋。在室温下以1,000 × g离心3分钟，收集细胞。离心结束后，从上清液中移除950 µL，并用移液器将细胞重悬于剩余的上清液中。接下来，将2 µL浓细胞悬液移液至凝集素包被的盖玻片上。然后将盖玻片置于干净的显微镜载片上以形成单层细胞，并尽快进行显微观察，以尽量减少成像过程中的人工假象。显微镜的设置需要长时间暴露于强光源下，这可能会对样本造成损伤并导致结果偏差。因此，使用专用的样本载玻片设置成像条件，该载玻片将不再用于脂滴定量。将专用样本放置于相差显微镜或微分干涉差显微镜的载物台上，并对细胞进行聚焦。在显微镜软件中设置Z轴层扫参数，使其覆盖整个细胞体积。总垂直距离取决于细胞大小，而光学切片的数量取决于物镜的数值孔径。接下来，设置焦点相对于中央焦平面进行移动。为了成像脂滴，需在绿色通道中实验性地设定光照强度和曝光时间。成像时需谨慎，因为 BODIPY 是一种非常明亮的荧光染料，可能迅速发生光漂白。此外，应尽量缩短曝光时间以避免信号过饱和。在切换至蓝色通道之前，应先完整采集绿色通道的 Z 堆栈图像，以防止移动的脂滴产生模糊。为了成像细胞边界，需在蓝色通道中实验性地设定光照强度和曝光时间。如果可能，应在显微镜控制软件中建立并使用自动化的实验工作流程，以促进在标准化条件下对多个样本进行成像。重要的是，所有图像必须在相同设置下采集，以便在样本之间进行适当的比较。成像条件优化后，聚焦细胞，并在绿色和蓝色通道中分别进行成像。每个样本应采集多个视野的图像，以获得可靠且具有代表性的数据。将蓝色和绿色通道的Z轴层扫图像保存为16位多层TIFF文件。务必在相应的文件名中包含“绿色”或“蓝色”字样。在 ImageJ 中打开显微图像，并删除在采集过程中有大量细胞发生移动的图像堆栈。这些细胞在不同的 Z 层切片中位置会发生变化。接下来，移除蓝色通道中包含强荧光非细胞颗粒的任何图像堆栈。这通常是由于成像表面的污垢或培养基中的杂质引起，可能会干扰其附近细胞的检测。同时，移除包含大量死细胞的任何图像堆栈。这些图像将显示蓝色荧光增强的细胞，与活细胞相比更为明显。尽管样本中存在少量死细胞通常不会造成问题，并且这些细胞在分析过程中会自动被排除，但有时部分死亡或濒死细胞可能会被分割算法误识别为活细胞，从而影响报告结果的准确性。要在 MATLAB 中开始分析，首先创建一个主文件夹，并将所有 MATLAB 脚本复制到该位置。接下来，创建以不同酵母物种名称命名的子文件夹，并将相应的 TIFF 图像复制到这些文件夹中。然后，启动 MATLAB，打开脚本 MAIN.m，并运行该脚本。在菜单中选择要分析的酵母物种，然后开始图像处理。根据需要使用电子表格编辑器或统计软件包检查和处理输出文件。该工作流程生成以分号分隔的 CSV 文件，以及包含已检测细胞对象和脂滴的分割 TIFF 文件。图中显示的是野生型 S.pombe 细胞，分别在复杂型 YES 培养基和定义型 EMM 培养基中培养。与在 YES 培养基中培养的细胞相比，在 EMM 培养基中检测到的脂滴数量较少，且单位细胞体积的染色强度更高。此外，在 EMM 培养基中形成的单个脂滴更大，并表现出更高的总染色强度。这与先前关于在EMM培养基中培养的细胞内储存脂质含量增加的研究结果一致。接下来，这些图像显示了在YES培养基中培养的处于对数期和早期稳定期的S.japonicus细胞。进入稳定期的细胞每单位细胞体积内的脂滴数量显著减少，而经体积归一化的脂滴荧光强度在两种条件下略有下降。与对数生长期细胞中的脂滴相比，早期静止期的脂滴通常体积中等偏大，总荧光强度也中等偏高。在酿酒酵母（S.cerevisiae）细胞中，相对于对数生长期，静止期细胞单位体积内的脂滴数量略少。然而，其体积归一化的脂滴荧光强度几乎增加了一倍。总体脂滴含量的显著增加是由于稳定期单个脂滴的荧光强度和体积明显更高所致。完成该操作后，可将输出数据汇总至统计软件（如 R）中，以绘制结果汇总图并对脂滴含量中任何观察到的差异进行统计学检验。原则上，该图像处理流程可用于其他微生物中脂滴含量的分析，或用于分析其他点状亚细胞结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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