使用自动图像处理分析裂变和萌芽酵母中的脂滴含量

该协议有助于对各种酵母物种的细胞储存脂质含量进行定量的小规模到大规模分析，并以公正和标准化的方式进行。该技术允许快速处理微观图像，并提供详细的定量输出，以便轻松比较样品，如各种突变体和在各种条件下生长的细胞。首先，请按照随附的文本协议准备染色解决方案、培养媒体和细胞。

在运行实验之前，确保细胞健康，处于所需的生长阶段。接下来，为要成像的每个样品准备显微镜盖玻片。使用水平定位移液器尖端的长侧将一个微升的滑动涂层溶液铺到干净的盖玻片上。

让涂层溶液完全干燥，然后将盖玻片存放在无尘环境中。接下来，测量细胞培养物的光学密度，并在同一生长阶段分析培养物，尝试在所有测试培养物之间达到类似的值，以确保类似的实验条件。然后，移液器将一毫升的细胞培养成1.5毫升的微离心管。

仅对于 S.cerevisiae 细胞，在管中添加五微升的滑动涂层溶液。然后，短暂地旋转所有的微离心管，并在30摄氏度下孵育，摇晃5分钟。接下来，将脂质染色溶液的微升添加到每个培养的等分，并短暂地涡旋它们。

然后，添加 10 微升的单元边界可视化解决方案，并再短暂旋转它们。在室温下，在1000倍重力下离心，收集细胞，收集细胞3分钟。旋转完成后，从上流液中去除950微升，并使用移液器将剩余的上流液中的细胞重新暂停。

接下来，移液器的两微升的密集细胞悬浮到一个莱金涂层盖玻片。然后，将盖玻片放在干净的显微镜幻灯片上，形成细胞单层，并尽快进行显微镜检查，以最大限度地减少成像中的伪影。设置显微镜需要长时间接触强光源，这些光源可能会损坏样品并扭曲结果。

因此，使用专用样品幻灯片设置成像条件，该幻灯片不会进一步用于脂液滴定量。将专用样品放在相位对比度或差分干扰对比度显微镜设置的舞台上，并聚焦在细胞上。在显微镜的软件中，设置 Z 堆栈设置，以便它们跨越整个细胞体积。

总垂直距离取决于细胞大小，光学切片的数量取决于目标的数值孔径。接下来，将焦点设置为相对于中央焦点平面移动。要对脂质液滴进行成像，请实验性地设置绿色通道中的光强度和曝光时间。

成像时要小心，因为BODIPY是一种非常明亮的荧光色素，可能会迅速光漂白。此外，尽量减少曝光时间，避免过度饱和。在切换到蓝色通道之前，先捕获完整的绿色通道 Z 堆栈，以防止移动脂质液滴模糊。

要对细胞边界进行成像，请实验性地设置蓝色通道中的光强度和曝光时间。如果可能，在显微镜控制软件中设置和使用自动化实验工作流程，以便于在标准化条件下对多个样品进行成像。重要的是，必须使用相同的设置获取所有图像，以便对样本进行适当的比较。

一旦成像条件得到优化，请关注细胞，并在绿色和蓝色通道中成像它们。每个样本的多个视场进行图像，以获得健壮、具有代表性的数据。将蓝色和绿色通道 Z 堆栈图像保存为 16 位多层 TIFF 文件。

请确保在相应的文件名中包含绿色或蓝色单词。打开 ImageJ 中的显微图像，并删除包含大量在采集过程中移动的单元格的任何图像堆栈。这些显示在各个 Z 部分的不同位置。

接下来，删除蓝色通道中包含高荧光非细胞颗粒的任何图像堆栈。这通常是由成像表面的污垢或培养介质中的杂质引起的，并可能干扰其附近细胞的检测。此外，删除包含大量死细胞的任何图像堆栈。

这些图像将显示与活细胞相比，蓝色荧光增加的细胞。虽然样本中存在几个死细胞通常不是问题，在分析过程中这些细胞会自动丢弃，但一些死细胞或死亡细胞有时可能通过分段算法被识别为活细胞，从而扭曲报告的结果。若要在 MATLAB 中开始分析，请先创建一个主文件夹，然后将所有 MATLAB 脚本复制到此位置。

接下来，创建包含各种酵母物种名称的子文件夹，并复制相应的 TIFF 图像到这些位置。现在，启动 MATLAB，打开脚本 MAIN。m，然后运行脚本。

在菜单中，选择要分析的酵母品种并开始图像处理。使用电子表格编辑器或统计包，按要求检查和处理输出文件。工作流生成分号分离的 CSV 文件和带检测到的细胞对象和脂滴的 TIFF 文件。

此处显示的是野生型 S.pombe 细胞，这些细胞生长在复杂的 YES 介质或定义的 EMM 介质中。与在 YES 培养的细胞相比，EMM 介质中检测到的脂质液滴更少，每单位细胞体积的染色强度更高。此外，EMM介质中形成的单个脂质液滴较大，总染色强度增加。

这与先前在EMM中生长的细胞中储存脂质含量增加的发现是一致。接下来，这些图像显示了S.japonicus细胞从指数和早期固定培养生长在 YES 培养。进入固定阶段的细胞显示，每单位细胞体积的脂滴数量明显减少，而体积正常化脂滴荧光强度在两种条件下略有下降。

早期的固定相脂质液滴通常大小中等大，与指数级生长细胞的液滴相比，总荧光强度要稍高。在S.cerevisiae细胞中，与呈指数生长的细胞相比，固定细胞每单位体积的脂质液滴要少一些。然而，它们的体积正常化液滴荧光强度几乎翻了一番。

整体脂液滴含量的急剧上升是由于在固定相中单个脂质液滴的荧光强度和体积要高得多。按照此过程，可以在统计包（如 R）中聚合输出数据，以创建汇总结果的绘图，并针对脂滴含量的任何观察到的差异运行统计测试。原则上，图像处理管道可用于分析其他微生物中的脂液滴含量或分析其他点状亚细胞结构。