利用自动化图像处理分析裂殖酵母和芽殖酵母中的脂滴含量

本方案以无偏倚且标准化的方式，实现对多种酵母物种中细胞储存脂质含量从小规模到大规模的定量分析。该技术可快速处理显微图像，并提供详细的定量输出结果，便于比较不同样本，例如各种突变株以及在不同条件下培养的细胞。首先，请参照随附的文字版实验方案，制备染色溶液、培养基和细胞。

确保在开展实验前细胞处于健康状态并处于所需的生长阶段。接下来，为每个待成像样品准备一个显微镜盖玻片。使用水平放置的移液器吸头的长边，将一微升载玻片包被溶液均匀涂布于洁净的盖玻片上。

让包被溶液完全干燥，然后将盖玻片置于无尘环境中保存。接下来，测定细胞培养物的光密度；对于需在相同生长阶段进行分析的培养物，应使所有待测培养物的光密度值尽可能接近，以确保实验条件具有可比性。随后，用移液器将一毫升细胞培养物转移至1.5毫升的微量离心管中。

仅针对酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞，向离心管中加入五微升（5 µL）载玻片包被溶液。随后，短暂涡旋所有微量离心管，并在30°C条件下振荡孵育五分钟。接着，向每份培养等分试样中加入一微升（1 µL）脂质染色溶液，并短暂涡旋混匀。

然后加入10 µL细胞边界可视化溶液，再次短暂涡旋。在室温下以1,000 × g离心3分钟，收集细胞。离心结束后，从上清液中移除950 µL，并用移液器将细胞重悬于剩余的上清液中。

接下来，将2 µL浓细胞悬液移液至凝集素包被的盖玻片上。然后将盖玻片置于干净的显微镜载片上以形成单层细胞，并尽快进行显微观察，以尽量减少成像过程中的人工假象。显微镜的设置需要长时间暴露于强光源下，这可能会对样本造成损伤并导致结果偏差。

因此，使用专用的样本载玻片设置成像条件，该载玻片将不再用于脂滴定量。将专用样本放置于相差显微镜或微分干涉差显微镜的载物台上，并对细胞进行聚焦。在显微镜软件中设置Z轴层扫参数，使其覆盖整个细胞体积。

总垂直距离取决于细胞大小，而光学切片的数量取决于物镜的数值孔径。接下来，设置焦点相对于中央焦平面进行移动。为了成像脂滴，需在绿色通道中实验性地设定光照强度和曝光时间。

成像时需谨慎，因为 BODIPY 是一种非常明亮的荧光染料，可能迅速发生光漂白。此外，应尽量缩短曝光时间以避免信号过饱和。在切换至蓝色通道之前，应先完整采集绿色通道的 Z 堆栈图像，以防止移动的脂滴产生模糊。

为了成像细胞边界，需在蓝色通道中实验性地设定光照强度和曝光时间。如果可能，应在显微镜控制软件中建立并使用自动化的实验工作流程，以促进在标准化条件下对多个样本进行成像。重要的是，所有图像必须在相同设置下采集，以便在样本之间进行适当的比较。

成像条件优化后，聚焦细胞，并在绿色和蓝色通道中分别进行成像。每个样本应采集多个视野的图像，以获得可靠且具有代表性的数据。将蓝色和绿色通道的Z轴层扫图像保存为16位多层TIFF文件。

务必在相应的文件名中包含“绿色”或“蓝色”字样。在 ImageJ 中打开显微图像，并删除在采集过程中有大量细胞发生移动的图像堆栈。这些细胞在不同的 Z 层切片中位置会发生变化。

接下来，移除蓝色通道中包含强荧光非细胞颗粒的任何图像堆栈。这通常是由于成像表面的污垢或培养基中的杂质引起，可能会干扰其附近细胞的检测。同时，移除包含大量死细胞的任何图像堆栈。

这些图像将显示蓝色荧光增强的细胞，与活细胞相比更为明显。尽管样本中存在少量死细胞通常不会造成问题，并且这些细胞在分析过程中会自动被排除，但有时部分死亡或濒死细胞可能会被分割算法误识别为活细胞，从而影响报告结果的准确性。要在 MATLAB 中开始分析，首先创建一个主文件夹，并将所有 MATLAB 脚本复制到该位置。

接下来，创建以不同酵母物种名称命名的子文件夹，并将相应的 TIFF 图像复制到这些文件夹中。然后，启动 MATLAB，打开脚本 MAIN.m，并运行该脚本。

在菜单中选择要分析的酵母物种，然后开始图像处理。根据需要使用电子表格编辑器或统计软件包检查和处理输出文件。该工作流程生成以分号分隔的 CSV 文件，以及包含已检测细胞对象和脂滴的分割 TIFF 文件。

图中显示的是野生型 S.pombe 细胞，分别在复杂型 YES 培养基和定义型 EMM 培养基中培养。与在 YES 培养基中培养的细胞相比，在 EMM 培养基中检测到的脂滴数量较少，且单位细胞体积的染色强度更高。此外，在 EMM 培养基中形成的单个脂滴更大，并表现出更高的总染色强度。

这与先前关于在EMM培养基中培养的细胞内储存脂质含量增加的研究结果一致。接下来，这些图像显示了在YES培养基中培养的处于对数期和早期稳定期的S.japonicus细胞。进入稳定期的细胞每单位细胞体积内的脂滴数量显著减少，而经体积归一化的脂滴荧光强度在两种条件下略有下降。

与对数生长期细胞中的脂滴相比，早期静止期的脂滴通常体积中等偏大，总荧光强度也中等偏高。在酿酒酵母（S.cerevisiae）细胞中，相对于对数生长期，静止期细胞单位体积内的脂滴数量略少。然而，其体积归一化的脂滴荧光强度几乎增加了一倍。

总体脂滴含量的显著增加是由于稳定期单个脂滴的荧光强度和体积明显更高所致。完成该操作后，可将输出数据汇总至统计软件（如 R）中，以绘制结果汇总图并对脂滴含量中任何观察到的差异进行统计学检验。原则上，该图像处理流程可用于其他微生物中脂滴含量的分析，或用于分析其他点状亚细胞结构。