Name: 用于病毒感染活成像和定量的路西酶-荧光报告流感病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 学习使用双报告基因流感病毒BIRFLU进行甲型流感病毒感染的在体活成像与定量分析。该方法通过同时表达荧光素酶和荧光蛋白，实现体外与体内研究的整合，为评估抗病毒治疗效果和免疫应答提供高效平台。

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LM-S实验室对流感病毒的研究部分由纽约流感卓越中心（NYICE）（美国国立卫生研究院 272201400005C）资助，该中心隶属于美国国家过敏与传染病研究所流感研究与监测卓越中心（CEIRS）合同编号HHSN272201400005C（NYICE），并得到美国国防部（DoD）同行评审医学研究计划（PRMRP）基金W81XWH-18-1-0460的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

研究人员一直依赖表达报告基因的重组病毒作为重要的分子工具，以加深并拓展对病毒复制和致病机制的现有认知26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54。其中最常选用的报告基因是荧光素酶和荧光蛋白，主要得益于这些基因在鉴定、改良变体开发以及成像技术检测方面的技术进步43,44,45,46,47,48。重组报告病毒常被用于加速病毒学检测，研究病毒在体外和体内感染的动态过程，以及评估已获批或新型疫苗与治疗策略的有效性26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54。然而，对于甲型流感病毒（IAV），以往的研究仅限于表达单一报告基因，这限制了可开展的研究类型26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54。为克服这一局限，我们构建了一种具有复制能力的双报告基因IAV，可同时表达Nluc荧光素酶和Venus荧光蛋白（BIRFLU）。
本报告中，我们描述了BIRFLU的体外表征及其在流感病毒A（IAV）感染小鼠模型中用于追踪病毒感染的体内实验方法。BIRFLU的Nluc和Venus表达水平与病毒滴度呈正相关。此外，从感染小鼠肺组织中回收的BIRFLU仍保持稳定，并持续表达两种报告基因。该方法为研究人员提供了在培养细胞和动物模型中研究IAV的优良机会，包括鉴定和开发治疗IAV感染的新治疗策略。
尽管BIRFLU是使用PR8的骨架构建的，但也可采用相同的实验方法，利用不同型别、亚型或病毒株骨架来生成其他重组IAV。同样，本报告中描述了在小鼠IAV模型中使用BIRFLU的实验步骤。然而，BIRFLU也可能成为评估其他动物模型中IAV感染的一项重要技术。

甲型流感病毒（IAV）是一种有包膜的单股负链分段RNA病毒，属于Orthomyxoviridae科1,2,3。世界卫生组织（WHO）估计，全球每年有300万至500万例流感病例，因流感导致的死亡人数超过25万4,5,6。流感的高危人群包括老年人、免疫功能低下者以及儿童7,8,9,10,11。尽管已有疫苗，且疫苗是预防病毒感染最常见且最有效的干预手段，但IAV能够快速进化并逃避免疫系统的识别3,12,13,14,15。2009年大流行性H1N1毒株的再次出现以及致病性IAV的不断出现，再次表明其对全球人类公共卫生构成持续威胁4,16。
在疫情或大流行期间，迅速确定新分离病毒的致病性和传播性至关重要。目前可用的病毒检测技术耗时较长，有时还需采用繁琐的方法，这可能会延迟分析的完成17,18,19,20。此外，现有的病毒检测方法难以实现规模化，而在疫情暴发时规模化检测可能是必需的。最后，目前常使用经验证的动物感染模型（如小鼠、豚鼠和雪貂）来研究流感病毒感染、免疫反应以及新型疫苗和/或抗病毒药物的疗效，这些模型至关重要。然而，由于无法实时观察病毒动态，这些模型存在局限性，使得研究仅限于对病毒感染的静态成像21,22,23,24,25。在这些检测中使用的动物还需被实施安乐死以测定病毒载量，从而增加了完成研究所需的动物数量26。为克服上述所有局限，许多研究人员依赖于使用可复制且表达报告基因的重组流感病毒（IAV），这类病毒能够加速病毒学检测，并实现实时体内病毒载量与扩散的检测26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41。重要的是，这些表达报告基因的IAV在细胞培养和动物感染模型中的复制能力与野生型（WT）IAV相似33,42。
荧光蛋白和生物发光蛋白是研究人员常用的两种报告系统，因其灵敏度高、稳定性好且使用简便。此外，荧光和生物发光蛋白检测技术得到了广泛的支持与发展43,44,45,46,47,48。荧光蛋白与荧光素酶具有不同的发光特性，主要体现在激发态的产生方式以及发射光的检测方法上存在差异43,44,45,46,47,48。荧光蛋白首先通过吸收能量被激发，随后分子从高能态降至低能态时以不同波长的光形式释放能量43。而生物发光则来源于一种涉及底物、氧气，有时还包括ATP的化学放热反应，从而产生光45。由于这两类报告蛋白的性质不同，在特定研究中可能其中一种更具优势。尽管荧光蛋白被广泛用于观察细胞定位28,41，但其在体内的信号强度不足，且常被活体组织的自发荧光所掩盖49。因此，研究人员依赖荧光素酶来评估活体中病毒的动态变化，尽管在离体研究中更倾向于使用荧光蛋白50,51,52,53。与荧光蛋白不同，荧光素酶更适用于在体研究，在非侵入性方法中更具应用价值26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54。最终，研究人员需根据研究类型在荧光蛋白或荧光素酶报告蛋白之间做出选择，这将导致在功能性和灵敏度之间进行权衡，并严重限制重组报告病毒的实用性。此外，还存在关于使用荧光或荧光素酶系统表达的不同报告基因与病毒复制或传播之间相关性的担忧，这可能影响对表达报告基因的IAVs所获得数据的解释。
我们通过构建一种可复制的双报告基因重组甲型流感病毒（BIRFLU），克服了这一局限性，该病毒在同一病毒基因组中同时编码荧光蛋白和荧光素酶蛋白55（图1）。其中，NanoLuc荧光素酶（Nluc）是一种体积小且亮度高的生物发光蛋白48，被插入至甲型流感病毒A/Puerto Rico/08/1934 H1N1（PR8）株的血凝素（HA）基因节段中HA序列的上游24,33,40,55,56,57。此外，Venus（一种常用单体荧光蛋白）被插入病毒非结构（NS）基因节段32,33,36,41,55。由于BIRFLU同时编码荧光和荧光素酶报告基因，因此可任选一种报告蛋白信号作为读数，用于体外或体内病毒复制与传播的检测55。有关BIRFLU的构建及其体外或体内表征的更多详细信息，请参见我们近期发表的论文55。BIRFLU可用于通过一种新型的基于荧光和生物发光的微量中和实验，评估抗病毒药物或中和抗体的有效性55。此外，BIRFLU也可用于在小鼠感染模型中评估病毒动力学55。在本论文中，我们描述了体外表征BIRFLU55的操作流程，以及如何利用活体成像系统检测体内Nluc信号或离体Venus信号，以研究BIRFLU在小鼠中的感染过程。
分子生物学、动物研究和成像技术的前沿方法相结合，为研究人员提供了利用BIRFLU开展甲型流感病毒（IAV）研究的独特机会，包括研究病毒与宿主的相互作用、病毒感染的动态过程；开发用于治疗IAV感染的新型疫苗策略，或探索将IAV作为疫苗载体用于治疗其他病原体感染的潜力。

<table><tbody><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>该软件用于3.1.10和4.4.7</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液（BA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>100 mm细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP成像系统</td><td>BioRad</td><td></td><td>该仪器用于4.4.7</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Dounce组织研磨器</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s改良Eagle&amp;rsquo;s培养基（DMEM）</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>5至7周龄雌性BALB/c小鼠</td><td>国家癌症研究所（NCI）</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>该仪器用于活体成像（4.2和4.3）</td></tr><tr><td>IX81电动倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX81</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 4.7.2软件</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>该软件用于活体成像（4.2和4.3）</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td><td>该仪器用于定量检测荧光素酶活性（3.2.6）</td></tr><tr><td>Madin-Darby犬肾（MDCK）上皮细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗体抗甲型流感病毒NP HB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Nano-Glo荧光素酶检测试剂</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>该试剂用于检测Nluc活性。-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>10%中性缓冲福尔马林</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96孔微孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（PS）100倍浓缩液</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）100倍浓缩液</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394相机</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>德克萨斯红标记的抗小鼠/抗兔二抗</td><td>Jackson</td><td>715-075-150</td><td>-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>TPCK处理的胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Vmax动力学微孔板读数仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于活体成像与病毒侵染定量检测的荧光素酶-荧光报告流感病毒

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

甲型流感病毒（IAV）可引起人类呼吸道疾病，带来严重的健康和经济后果。与其他病毒类似，研究 IAV 需要使用繁琐的间接方法来检测感染细胞和/或动物感染模型中病毒的存在。这一局限性最近已通过构建表达易于追踪的荧光或生物发光（荧光素酶）报告蛋白的重组 IAV 得到克服。然而，由于 IAV 基因组插入外源序列的能力有限，研究人员此前只能在荧光或荧光素酶报告基因之间进行选择。为克服这一限制，我们构建了一种可复制的双报告基因重组 IAV（BIRFLU），能够稳定表达荧光和荧光素酶两种报告基因，从而便于在体外和体内追踪 IAV 感染。为此，我们对甲型流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 H1N1（PR8）的病毒非结构蛋白（NS）和血凝素（HA）基因片段进行了改造，分别编码荧光蛋白 Venus 和生物发光蛋白 Nanoluc 荧光素酶。本文描述了在 IAV 感染小鼠模型中使用 BIRFLU 的方法，并利用活体成像系统检测两种报告基因的表达。值得注意的是，我们观察到两种报告基因的表达与病毒复制之间具有良好的相关性。结合分子生物学、动物研究和成像技术的前沿手段，该工具为流感研究提供了独特的机会，包括病毒与宿主相互作用以及病毒感染动态的研究。更重要的是，通过在不同病毒基因片段中插入两个外源基因以实现病毒基因组的遗传改造，为以下应用开辟了新途径：（i）新型 IAV 疫苗的开发；（ii）构建可作为疫苗载体的重组 IAV，用于防治其他人类病原体感染。

体外生成与表征BIRFLU（图1和图2）
利用先进的分子生物学和基于质粒的反向遗传学技术，构建了一种表达两种不同报告基因的重组复制型流感病毒（BIRFLU）（图1）。本研究选择使用Nluc，因其相较于其他荧光素酶具有多项优势，包括分子量小、不依赖ATP、发光强度更高以及底物经过优化48,60。将Nluc插入流感病毒PR8株的HA基因片段中，并在其后连接猪捷申病毒（PTV）2A蛋白自切割位点（2A），位于HA开放阅读框（ORF）之前（图1）。HA的开放阅读框中引入了沉默突变，以消除原有的包装信号，避免可能发生的重组。在Nluc前方添加完整的HA包装信号，以确保修饰后的HA基因片段能正确整合至病毒粒子中，并实现Nluc与HA从同一条病毒RNA片段上的共表达（图1）。此外，将荧光蛋白Venus插入经修饰的流感病毒PR8株NS基因片段中，该片段可通过单一转录本编码两种病毒蛋白NS1和NEP32,36,41,54,57。为此，Venus与NS1的C末端融合，而完整的NEP开放阅读框则克隆至PTV 2A切割位点的下游，该切割位点位于NS1-Venus与NEP序列之间（图1）。最终，将上述修饰的HA和NS病毒质粒构建体与其余IAV PR8反向遗传学质粒共同使用，以生成BIRFLU病毒（图1）。BIRFLU的体外和体内特性此前已有描述55。
在图2中，我们通过荧光检测和间接免疫荧光方法测定Venus、Nluc和NP的表达水平，对BIRFLU在体外的特性进行了表征（图2A、B）。将MDCK细胞培养至形成融合单层后，分别用野生型（WT）或BIRFLU PR8病毒（感染复数MOI为0.1）感染，或进行模拟感染。感染后18小时，通过荧光显微镜直接评估Venus的表达（图2A,B）。Nluc（图2A）和NP（图2B）的表达则通过针对各自蛋白的特异性抗体进行间接免疫荧光检测。正如预期，Venus和Nluc仅在BIRFLU感染的细胞中被检测到，而在野生型PR8病毒感染的细胞中未检测到。此外，间接免疫荧光显微镜结果显示，NP在野生型和BIRFLU PR8感染的细胞中均有表达。如预期，在模拟感染的细胞中未检测到Venus、Nluc或NP的表达（图A,B）。
为了在体外评估 Nluc 的表达水平，使用野生型（WT）或 BIRFLU PR8 病毒（感染复数 MOI 为 0.001）感染 MDCK 细胞，并在感染后 24、48、72 和 96 小时检测组织培养上清液中的 Nluc 活性（图 2C）。仅在感染 BIRFLU 的 MDCK 细胞的组织培养上清液中检测到 Nluc 活性（图 2C）。在感染后 24 小时即可检测到组织培养上清液中的 Nluc 活性，且在感染后 96 小时表达水平更高，这很可能是因为病毒感染诱导的细胞病变效应（CPE）释放了原本保留在细胞内的 Nluc 蛋白。为了评估 BIRFLU 在培养细胞中的适应性，还分析了野生型和 BIRFLU PR8 病毒的生长动力学（图 2D），并通过免疫灶点实验测定组织培养上清液中是否存在具有感染性的病毒（图 2D）。值得注意的是，BIRFLU 的复制动力学与野生型 PR8 病毒相似，尽管其复制略有延迟，且未达到野生型 PR8 病毒的相同病毒滴度。然而，BIRFLU 能够达到 5 × 107 PFU/mL 的滴度（图 2D），表明在病毒基因组中表达两个报告基因不会显著干扰 BIRFLU 在 MDCK 细胞中的复制。
在小鼠中追踪 BIRFLU 感染（图 3 和 图 4）
图3 是在流感病毒（IAV）感染小鼠模型中评估BIRFLU动态的示意图流程。将5至7周龄的雌性BALB/C小鼠用1×PBS进行假感染，或通过鼻内接种1×106 PFU的BIRFLU进行感染。感染后第3天，用异氟烷麻醉小鼠，随后经眼后静脉注射Nluc底物。所有小鼠立即放入IVIS仪器中，使用IVIS在活体状态下检测Nluc信号。接着，处死小鼠并取出肺组织。切除的肺组织随后使用活体成像仪进行离体分析，通过Venus表达测定荧光强度。最后，将小鼠肺组织匀浆，通过空斑实验测定病毒滴度和稳定性。空斑通过Venus的直接荧光、针对Nluc的特异性抗体免疫染色以及结晶紫染色进行检测。
此前报道的具有复制能力的报告基因表达型 IAV 仅表达单一报告基因，最常见的是荧光蛋白或生物发光蛋白，用以替代指示病毒感染与复制。然而，BIRFLU 能够在病毒感染后同时表达这两类报告基因。为评估 BIRFLU 感染后生物发光（活体成像）与荧光（离体成像）之间的相关性，将 5 至 7 周龄的雌性 BALB/c 小鼠以 1× PBS 进行假感染，或经鼻接种 BIRFLU（106 PFU）。在感染后第 3 天，通过眼眶后注射 Nluc 底物，并使用活体成像仪器检测 Nluc 活性（图 4A）。我们选择在第 3 天检测生物发光，因为先前研究表明 IAV（包括 PR8 毒株）的复制高峰出现在感染后第 2 至第 4 天24,54。生物发光信号被监测（图 4A，上图），并用于计算平均总通量（Flux（log10 p/s））（图 4A，下图）。如预期所示，接种 BIRFLU 的小鼠表现出强烈的生物发光信号，而假感染小鼠未检测到任何信号。随后，采集感染小鼠的肺组织，通过离体成像检测 Venus 表达（图 4B，上图）。此外，还计算了荧光平均辐射效率（图 4B，下图）。同时将切除的小鼠肺组织进行匀浆处理，以测定病毒滴度及 BIRFLU 在体内的遗传稳定性（图 4C、D）。通过噬斑实验分析 BIRFLU 的遗传稳定性，利用从小鼠肺组织中分离的病毒进行噬斑形成，并结合荧光显微镜（Venus，上图）、免疫染色（Nluc，中图）和结晶紫染色（下图）进行分析。从小鼠肺组织中回收的 BIRFLU 能够形成噬斑，并稳定表达两种报告基因（图 4C）。值得注意的是，我们观察到生物发光与荧光信号均与病毒复制水平具有良好的相关性。
<img alt="流感病毒基因编辑示意图，显示Nluc、Venus蛋白表达，野生型与BIRFLU病毒的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：IAV PR8 野生型与BIRFLU病毒颗粒结构及基因组片段的示意图。 IAV被含有两种主要病毒糖蛋白血凝素（HA；黑色）和神经氨酸酶（NA；蓝色）的脂双层包被。IAV包含八个单链负义RNA片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS）。每个病毒片段在3’和5’端均含有非编码区（NCR）（黑色方框）。此外，在病毒（v）RNA的3’和5’端还存在包装信号，负责将vRNA高效地包裹进新生病毒颗粒中（白色方框）。IAV PR8的HA和NS病毒片段及其表达产物以黑色表示。Nluc、Venus和PTV 2A的序列分别以红色、绿色和条纹方框表示。图中还示出了BIRFLU病毒中分别表达Nluc和Venus的修饰后HA和NS片段的示意图。本图改编自Nogales 等人55。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="病毒研究分析；荧光显微镜与生长曲线；BIRFLU 与 WT 比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：BIRFLU 的体外表征。（A、B）通过直接荧光和免疫荧光分析蛋白表达。MDCK 细胞经模拟感染或以 PR8 WT 或 BIRFLU 病毒感染（MOI 0.1）。感染后 18 小时固定细胞，通过直接荧光显微镜直接观察 Venus 表达，并利用特异性抗体通过间接免疫荧光检测 Nluc（A）和病毒 NP（B）的表达。细胞核用 DAPI 染色。展示代表性图像（20 倍放大）。比例尺 = 100 μm。（C、D）PR8 WT 与 BIRFLU 的生长动力学。在感染后指定时间点检测以 WT 和 BIRFLU PR8 病毒感染（MOI 0.001）的 MDCK 细胞培养上清液中的 Nluc 活性（C）和病毒滴度（D）。数据表示三次重复的平均值 ± 标准差。病毒滴度通过免疫焦点法（FFU/mL）测定。虚线表示检测下限（200 FFU/mL）。本图改编自 Nogales 等人55。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠病毒学研究时间线：接种、Nluc成像、肺组织采集、蚀斑实验结果图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：BIRFLU在小鼠体内研究的示意图。 通过活体或离体成像，检测了感染1 × 106 PFU BIRFLU的小鼠体内Nluc和Venus报告基因的表达。简言之，在第1天，将5至7周龄的雌性BALB/c小鼠分为两组，一组以1×PBS进行假感染，另一组通过鼻内接种1 × 106 PFU的BIRFLU病毒。感染后第3天，使用异氟烷对小鼠进行轻度麻醉，并通过眼眶后注射Nluc底物。随后利用活体成像直接评估Nluc信号。成像后立即处死小鼠，通过离体成像分析完整摘除肺组织中Venus的表达。取出的肺组织被匀浆化，用于通过蚀斑实验评估病毒复制能力与稳定性。箭头表示荧光（Venus）、免疫染色（Nluc）与结晶紫染色之间的对应关系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物发光成像、Nluc 和 Venus 荧光、病毒滴度分析、实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：体内生物发光与荧光表达。 使用 1× PBS 假感染或经鼻接种 1 × 106 PFU BIRFLU 病毒的 5 至 7 周龄雌性 BALB/c 小鼠，在感染后第 3 天检测整只小鼠的 Nluc 活性（A）。图中显示单只小鼠的代表性图像，颜色标尺表示辐射通量（p/sec/cm2/sr）。对生物发光辐射值进行定量分析，并展示平均总通量（Flux (Log10 p/s)）。Nluc 成像完成后，取小鼠肺组织进行离体成像（B）。图中显示完整肺组织的代表性图像。为定量 Venus 表达水平，将感兴趣区域（ROIs）的平均值标准化至假感染小鼠肺组织的自发荧光，并计算倍数变化。为分析 BIRFLU 在体内的遗传稳定性，从感染小鼠肺组织中回收病毒，通过噬斑实验结合荧光显微镜（Venus，上图）、免疫染色（Nluc，中图）和结晶紫染色（下图）进行分析（C）。图中显示来自一只小鼠的代表性图像。为评估病毒复制能力，成像后将整肺组织匀浆，用于感染 MDCK 细胞，并通过噬斑实验测定病毒滴度（PFU/mL）（D）。箭头指示荧光（Venus）、免疫染色（Nluc）与结晶紫染色结果之间的对应关系。柱状图表示肺组织病毒滴度的均值 ± 标准差（SD）。本图改编自 Logales 等人55。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组织培养基与溶液</td>
			<td>成分</td>
			<td>储存条件</td>
			<td>用途</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织培养基：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），10% 胎牛血清（FBS），1% 青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺（PSG）（DMEM 10% FBS 1% PSG）。</td>
			<td>445 ml DMEM，50 mL FBS 和 5 mL 100x PSG。</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>MDCK 细胞的维持培养</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>感染后培养基：DMEM 0.3% 牛血清白蛋白（BA），1% PSG（DMEM 0.3% BA 1% PSG）。</td>
			<td>491 ml DMEM，4.2 ml 35% BA 和 5 ml 100x PSG</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>病毒感染后 MDCK 细胞的维持</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x 磷酸盐缓冲液（PBS）</td>
			<td>80 g NaCl，2 g KCl，11.5 g Na2HPO4·7H2O，2 g KH2PO4，加 ddH2O 至 1 L，调节 pH 至 7.3</td>
			<td>室温</td>
			<td>用于配制 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>将 10x PBS 用 ddH2O 稀释</td>
			<td>室温</td>
			<td>洗涤细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>感染用培养基：1x PBS，0.3% 牛血清白蛋白（BA），1% 青霉素-链霉素（PS）（PBS/BA/PS）。</td>
			<td>487 mL 无菌 1x PBS，4.2 mL 35% BA 和 5 mL 100x 1% PS（100 U/mL）</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>病毒感染实验</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>固定/透化溶液：4% 甲醛，0.5% Triton X-100，溶于 1x PBS。</td>
			<td>400 mL 10% 中性缓冲甲醛，5 mL Triton X-100 和 595 mL 1x PBS</td>
			<td>室温</td>
			<td>MDCK 细胞的固定与透化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>封闭液：1x PBS 中含 2.5% 牛血清白蛋白（BSA）。</td>
			<td>2.5 g BSA 溶于 97.5 mL 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>免疫荧光与蚀斑实验的封闭液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体稀释液（1% BSA 溶于 1x PBS）</td>
			<td>1 g BSA 溶于 99 mL 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>一抗与二抗的稀释</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% 结晶紫溶液</td>
			<td>1 g 结晶紫溶于 400 mL 甲醇，加入 600 mL ddH2O</td>
			<td>室温</td>
			<td>蚀斑实验中 MDCK 细胞的染色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>经 TPCK 处理的胰蛋白酶（TPCK-treated trypsin）</td>
			<td>用 ddH2O 配制成 1,000 倍浓缩液，浓度为 1 mg/mL</td>
			<td>-20 °C</td>
			<td>用于病毒感染实验</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：组织培养基与溶液。

甲型流感病毒（IAV）是具有传染性的呼吸道病原体，可引起每年的流行和偶发的大流行。本文介绍了一种利用新型重组荧光素酶和荧光双报告甲型流感病毒（BIRFLU）在活体中追踪病毒感染的实验方案。该方法为研究人员提供了在活体内研究甲型流感病毒的优良工具。

甲型流感病毒（IAVs）可引起人类呼吸道疾病，具有显著的健康和经济影响。与其他病毒一样，……

研究人员此前已构建出表达荧光或生物发光蛋白报告基因的重组流感病毒。我们之前在流感病毒中单一表达报告基因的方法严重限制了其在实验中的应用。本方案描述了一种双报告基因流感病毒的使用方法，该病毒可同时表达荧光和生物发光报告基因，从而克服了上述局限性。该技术的主要优势在于使用单一的重组流感病毒进行体外和体内研究。进行该技术操作时，快速注射荧光素酶底物并合理规划小鼠操作流程非常重要，因为底物会迅速被代谢。此外，建议剃除小鼠毛发以提高生物发光信号的检测效果。为了感染小鼠，首先在1× PBS中制备BIRFLU。在接种前将病毒保持在冰上。通过检查是否存在脚趾夹捏反射来确认小鼠是否已麻醉，并通过鼻内接种方式给予制备好的BIRFLU稀释液。在将小鼠放回笼子之前，确保所有小鼠呼吸正常。打开成像软件并点击初始化，然后设置成像所用的参数。为了监测感染BIRFLU的小鼠，需剃除其胸部毛发，以提高生物发光信号的检测效果。小鼠麻醉后，使用22号针头经眼后静脉注射100 µL Nluc荧光素酶底物（用PBS稀释10倍）。注射后立即把动物放入隔离室，胸部朝上放置。然后将隔离室放入成像仪器中，关闭舱门并采集图像。成像完成后，将小鼠放回笼中，并监测其状态直至完全恢复。使用成像软件的感兴趣区域（ROI）工具，通过划定感兴趣区域并点击“测量”来分析获得的生物发光数据。为进行小鼠肺组织的离体成像，需按照文稿中的指示收集肺组织，启动图像采集软件，并设置成像参数。机器初始化后，将肺组织置于黑色背景的托盘中，并确保各组织彼此分离。将托盘放入成像仪中，关闭舱门，采集图像。成像完成后，立即取出组织，若样品将在同一天进行处理，则将其置于冰上并在4 °C条件下保存。如果需要后续处理，请迅速将样本置于干冰上的离心管中冷冻，并在 -80 摄氏度下保存。为处理图像，请选择 ROI 工具，在每侧肺组织周围绘制感兴趣区域，然后点击“测量”。BIRFLU 已通过体外实验进行表征，通过检测感染细胞中 Venus、Nluc 和 NP 的表达水平来确定其特性。只有在感染了BIRFLU的细胞中才能检测到Venus和Nluc的表达，而NP在野生型PR8和BIRFLU感染的细胞中均有表达。在未感染的对照细胞中未观察到任何表达。此外，在感染后24、48、72和96小时，已测定细胞培养上清液中的Nluc活性。感染后24小时即可检测到，96小时时表达水平升高。还可证明BIRFLU的复制动力学与野生型PR8病毒相似。BIRFLU能够表达荧光和生物发光报告基因，可通过小鼠肺组织的活体和离体成像评估两者之间的相关性。感染BIRFLU的小鼠肺部在活体中显示出强烈的生物发光信号，离体后也表现出荧光。同时已测定BIRFLU在体内的病毒滴度和遗传稳定性。对小鼠肺组织中分离的病毒进行蚀斑实验表明，该病毒能够形成蚀斑，并表达两种报告基因。BIRFLU 还可用于评估抗病毒抗体和中和抗体对抗流感病毒的效果。这些检测方法的结果彼此之间均具有相关性，且操作快速简便。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用于病毒感染活成像和定量的路西酶-荧光报告流感病毒

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。...

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于&lt;10...

高通量流感病毒检测方法

利用荧光素酶和活体成像系统（IVIS）作为一种新方法，在临床症状出现前识别疾病终点。IVIS使我们能够实时观察脑炎病毒在多天内的侵袭过程，从而为未来研究提供更为精确的疾病模型。该技术还使我们能够比当前常用的动物模型更快地评估抗病毒药物和疫苗的潜在保护作用。通过在多个时间点对同一动物进行连续监测，可减少实验动物使用数量、降低成本，并降低动物的整体发病率，确保疾病研究过程更加人道且更具科学性。...

体内成像系统（IVIS）检测神经侵袭性脑炎病毒

来源：Chang, X., 等. 利用磷酸钙转染法构建假型H5禽流感病毒及抗体中和活性检测. J. Vis. Exp.

利用荧光素酶报告基因检测评估假病毒感染

来源：Garcia, V.，等．表达荧光素酶的重组病毒高通量滴定．J. Vis. Exp. (91)，e51890，doi:10.3791/51890...

基于荧光素酶的病毒定量样品制备

本视频展示了一种利用表达重组荧光素酶和荧光蛋白的双报告流感病毒A在小鼠模型中追踪病毒感染的方法。该方法可同时用于活体（in vivo）和离体（ex...

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我们描述了一种荧光报告型痘苗病毒的使用方法，该病毒可通过光谱上可区分的报告荧光蛋白的时相特异性表达，实现对病毒感染性和基因表达的实时检测。我们详细介绍了一种基于孔板的方法，用于精确定位小分子抑制剂作用下病毒复制受干扰的具体阶段。...

用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

本文介绍了一种基于荧光素酶表达的高通量方法，用于滴定多种RNA和DNA病毒，该方法可使用自动化或手动液体处理设备进行操作。...

高通量滴定表达荧光素酶的重组病毒

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组（r）SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统（IVIS）以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.

利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

学习使用双报告基因流感病毒BIRFLU进行甲型流感病毒感染的在体活成像与定量分析。该方法通过同时表达荧光素酶和荧光蛋白，实现体外与体内研究的整合，为评估抗病毒治疗效果和免疫应答提供高效平台。

一种用于活体成像与病毒侵染定量检测的荧光素酶-荧光报告流感病毒

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