用于病毒感染活成像和定量的路西酶-荧光报告流感病毒

研究人员以前曾产生过可表达荧光或生物发光蛋白的重组流感病毒。我们单一表达的流感病毒中记者基因的一部分严重限制了它在实验中的使用。我们的协议描述了双报告流感病毒的使用，这种病毒既表达荧光和生物发光报告基因，又超越了其局限性。

这项技术的主要优点是使用单一重组流感病毒进行体外和体内研究。在执行此技术时，快速注射荧光素酶基板和正确规划小鼠处理非常重要，因为基板会迅速代谢。此外，建议剃须小鼠，以改善生物发光信号的检测。

要感染小鼠，请从1X PBS中制备BIRFLU开始。将病毒保持在冰上直到接种。检查是否没有头趾捏反射，以确保小鼠麻醉，并接种其内鼻与准备的BIRFLU稀释。

确保所有小鼠在将小鼠返回笼子之前都正常呼吸。打开成像软件并按初始化，然后设置用于成像的参数。要监测感染BIRFLU的小鼠，剃光胸部，改善生物发光信号的检测。

一旦小鼠麻醉，使用22测量针逆轨管理100微升的Nluc荧光素酶基质，稀释1至10在PBS。注射后，立即将动物放在隔离室中，胸部朝上。然后，将隔离室放在成像仪器中，关闭门并获取图像。

成像后，将小鼠返回到笼子并监测它们，直到它们完全康复。使用成像软件 ROI 工具通过指定感兴趣的区域并单击度量来分析获得的生物发光数据。要对小鼠肺进行外体成像，请根据手稿方向采集肺，启动图像采集软件，并设置成像参数。

初始化机器后，将肺放在黑色背景托盘中，并确保组织彼此分离。将纸盒引入成像器，关闭门并获取图像。成像后，立即取出组织，并在4摄氏度的冰上储存，如果样品将在同一天处理。

如果稍后将处理，请将其快速冻结在干冰的管子中，并将其储存在80摄氏度。要处理图像，请选择 ROI 工具，绘制每个肺周围感兴趣的区域，然后单击"测量"。BIRFLU在体外通过确定受感染细胞中的金星、Nluc和NP表达水平而具有特征。

金星和Nluc表达只在受BIRFLU感染的细胞中检测到，而NP在野生型PR8和BIRFLU感染的细胞中均得到表达。在模拟感染的细胞中未观察到任何表达式。此外，在感染后24小时、48小时、72小时和96小时，在组织培养超级自然剂中测量了Nluc活性。

感染后24小时就检测到，表达水平在96小时时增加。也可以证明BIRFLU的复制动力学与野生型PR8病毒相当。BIRFLU具有同时表达荧光和生物发光检测基因的能力，两者的相关性可以通过小鼠肺的体内和外活成像进行评估。

感染BIRFLU的小鼠的肺部在体内和荧光外体显示高生物发光。在体内也确定了BIRFLU的病毒滴定剂和遗传稳定性。对小鼠肺部病毒的斑块检测表明，该病毒可以形成斑块并表达两个记者基因。

BIRFLU还可用于评估抗病毒和中和抗体对流感的有效性。这些测定的输出都相互关联，而且快速、容易。