使用突触前结构组织微珠与“神经元球”培养进行突触前结构形成检测

本方案适用于研究突触前蛋白的来源：是来自胞体还是轴突，以及在突触形成过程中，突触前蛋白如何以有序的方式在突触前部位聚集。该技术可同时诱导形成数千个突触前结构，且无需使用特殊装置即可在培养中维持轴突，从而高效分析轴突中大量突触前结构的形成过程。

与研究生Honami一同演示该实验步骤的是我实验室的本科生Rie Ishii。按照文本方案中所述，首先对小鼠实施安乐死，然后解剖腹部以获取E16胚胎。

用精细尖头镊子小心地将胚胎的脑组织取出，并转移至含有 4 毫升 HEPES 缓冲盐溶液（HBSS）的 60 毫米细胞培养皿中。去除脑膜并切除嗅球。在体视显微镜下，用镊子的精细尖端分离每个大脑半球的皮层，并将其转移至另一含有新鲜 HBSS 的 60 毫米培养皿中。

每次神经元球培养至少使用三到五个胚胎。在超净台中，用显微解剖弹簧剪将皮层组织剪成小块。然后将剪碎的皮层组织转移至15毫升离心管中。

将切碎的皮层组织置于含有4毫升0.125%胰蛋白酶的HBSS溶液中，在37摄氏度水浴中消化4.5分钟。用无菌移液管将细胞团块转移至一个新的15毫升离心管中，该离心管内含有10毫升HBSS。在37摄氏度孵育5分钟后，重复此步骤一次。

然后将细胞聚集体转移至一个新的15毫升离心管中，管内含有2毫升NGB培养基、0.01% DNase I和10%马血清。用火焰抛光的细玻璃巴斯德吸管将经胰蛋白酶消化的皮层组织反复吹打3至5次。制备神经元球时，用NGB培养基将细胞悬液的细胞密度调整至每毫升100万个细胞。

向培养皿的底部加入 7 毫升 PBS。将皮层神经元以每滴 10,000 个细胞的密度、每滴 10 微升的悬滴形式，接种于 10 厘米培养皿上盖内侧。将培养皿置于 37°C、5%CO₂、湿润条件下培养箱中培养 3 天，以促进神经元球体的形成。

将多聚-L-赖氨酸（PLL）包被液（15 微克/毫升，溶于硼酸盐缓冲液）加入含石蜡珠的玻璃盖玻片中，置于 60 毫米培养皿内。在 37 摄氏度、含 CO2 的培养箱中孵育至少 1 小时。用 PBS 洗涤 4 次后，将 PLL 包被的盖玻片转移至 4 孔板中，每孔加入含 3 微摩尔 AraC 的 NGB 培养基 350 微升。

向培养基中加入AraC以杀死正在分裂的细胞。将含有PLL包被盖玻片的四孔板置于CO2培养箱中孵育至少20分钟，确保培养基温度达到37摄氏度，然后再转移神经元球。在DIV 3时，当神经元球已充分形成后，将其转移至PLL包被的盖玻片上。

在四孔板内，每孔加入五个神经元球。在体外培养第11天（DIV 11），从链霉亲和素包被的磁性颗粒悬液中转移20 µL至微量离心管中。将磁珠固定在附有钕铁硼永磁体的自制装置上，并用100 µL PBS-MCBC缓冲液在1.5 mL微量离心管中洗涤三次。

完全去除珠子上的 PBS-MCBC 后，向洗涤后的珠子中加入预定体积的 LRRTM2 原液。将混合物置于旋转仪上，在 4 摄氏度下孵育 1 至 2 小时。孵育结束后，用 100 微升 PBS-MCBC 洗涤珠子两次。

然后，用 100 微升 NGB 培养基洗涤磁珠。将 LRRTM2 磁珠重悬于 50 微升 NGB 培养基中，用于神经元球状培养物的处理。现在，在体视显微镜下用剃刀刀片以 45 度角剪去黄色吸头的末端。

将黄色吸头末端置于神经元球的胞体区域，通过抽吸去除胞体。将LRRTM2和对照磁珠加入神经元球培养物中。随后，使用铁氧体磁铁将磁珠沉降至神经元球培养板底部，持续一分钟，以启动突触前结构的形成。

该操作可确保所有微珠同时接触到底部。在微珠与神经元球状培养物形成突触前结构后，按照文本方案所述对神经元进行固定和染色。使用倒置荧光显微镜配备60倍油镜和冷却CCD相机，采集微分干涉差（DIC）和免疫荧光图像。

测量轴突中突触前成分的免疫荧光强度。使用珠子上感兴趣区域的免疫荧光强度，减去珠子外区域的强度，再除以轴突强度，沿珠子周围20微米范围内进行计算。

减去背景强度。该比值强度提供了蛋白质累积指数。为了定量分析由LRRTM2微珠诱导的突触前膜中特定蛋白质的累积水平，应始终选择距离细胞体两个视野或更远的区域。

为获得准确测量结果，每张盖玻片应选择五个不同的轴突区域。图中显示的是在 DIV 11 时将 LRRTM2 微珠加入神经元球状培养物后，诱导神经元球轴突的突触前膜中 Munc18-1 蛋白聚集。神经元球轴突上的微珠可在相差显微镜图像中清晰可见。

通过免疫荧光图像可观察到突触前蛋白的聚集。即使在去除胞体的轴突中，在微珠下方也观察到Munc18-1的聚集，与含有胞体的神经元球体的轴突相似。当使用高倍物镜分析轴突片的外周区域时，vGlut1和Munc18-1在有或无胞体的微珠下方轴突的突触前部位均明显聚集。

时间过程实验表明，vGlut1 在突触前部位的积累在30分钟时显著增加。另一方面，Munc18-1 的积累在两小时时开始显著增加，并在四小时达到平台期。这些数据表明，突触小泡蛋白 vGlut1 在突触前部位的积累早于活性区蛋白 Munc18-1。

Fmr1基因敲除神经元突触前膜中Munc18-1的累积量比野生型增加了1.5倍，表明FMRP参与了Munc18-1的累积过程。蛋白质合成抑制剂茴香霉素显著抑制了有或无胞体的轴突中Munc18-1的累积，这表明该累积过程依赖于蛋白质合成。

使用经火焰抛光的细口玻璃巴斯德移液管吹打经胰蛋白酶消化的皮层组织是关键步骤。实验人员需准备两到三种不同口径的火焰抛光移液管，并选择合适口径的移液管。通过该操作，可利用活细胞成像技术检测由LRRTM2微珠诱导的突触前末梢的突触递质释放。

这种附加方法将回答轴突中的蛋白质合成是否参与突触释放的调控。利用该方法，研究人员可探究突前蛋白如何以有序的方式在突触前部位聚集，以及突前蛋白来源的位置。