Name: 使用锚定多路聚合酶链反应的致癌基因融合检测,随后进行下一代测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 了解锚定多路聚合酶链反应结合下一代测序技术检测临床肿瘤样本中的致癌基因融合。该方法可同时评估多种基因融合状态，为癌症诊断和治疗决策提供关键信息。

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本工作由科罗拉多大学分子病理学共享资源中心（美国国家癌症研究所癌症中心支持基金编号 P30-CA046934）和科罗拉多个性化医学中心资助。

<ol><li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li>
<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li>
<li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li>
<li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li>
<li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li>
<li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li>
<li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li>
<li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li>
<li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li>
<li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li>
<li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li>
<li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li>
<li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li>
<li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22JCO+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510(2017).</li>
<li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li>
<li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation%3A+Report+of+10+Cases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li>
<li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li>
</ol>

D.L.A. 已从拜耳肿瘤学、基因泰克、艾伯维和百时美施贵宝获得咨询费。K.D.D. 已从ArcherDx获得赞助旅行。

基于锚定多重PCR的靶向富集与文库构建，结合下一代测序技术，非常适用于临床肿瘤样本中多重基因融合的检测。该方法以RNA为起始输入材料，而非基因组DNA，从而避免了对庞大且重复的内含子区域进行测序的需要。此外，由于该策略在扩增时不受融合伴侣基因身份的限制，因此能够检测出 novel 基因融合事件。这一特性在临床应用中具有重要意义，已有大量文献报道通过AMP方法鉴定出具有临床干预价值的 novel 基因融合事件21,22,23,24,25。
由于该检测基于RNA，因此在处理过程中保持样本中RNA的质量至关重要。同时，确定哪些样本产生的RNA测序结果过于低下而无法信任阴性融合结果也极为重要。这一判断通过评估针对四个看家基因的引物测序数据来实现。如果这些基因的测序结果...

两个或更多基因融合成一个单一的转录单元，可能由大规模染色体变异引起，包括缺失、重复、插入、倒位和易位。通过改变转录调控和/或表达基因产物的功能特性，这些融合基因可赋予癌细胞致癌特性1。在许多情况下，已知融合基因作为主要的致癌驱动因子，通过直接激活细胞增殖和存活通路发挥作用。
基因融合对癌症患者的临床意义最初在慢性髓性白血病（CML）中发现费城染色体及其相应的BCR-ABL1融合基因时得以显现2。小分子抑制剂甲磺酸伊马替尼被开发用于特异性靶向该融合基因，在BCR-ABL1阳性的CML患者中展现出显著疗效3。在实体瘤中，针对致癌性基因融合的治疗也取得了成功，非小细胞肺癌中ALK和ROS1融合基因的抑制即为主要范例4,5。近期，NTRK抑制剂拉罗替尼获得美国FDA批准，用于治疗携带NTRK1/2/3融合的实体瘤，且不受肿瘤原发部位限制6。除指导治疗选择外，基因融合检测在疾病诊断和预后评估中亦具有重要作用。这一点在多种肉瘤及血液系统恶性肿瘤亚型中尤为突出，这些肿瘤的诊断依赖于特定融合基因的存在，或其预后直接由融合基因的存在与否决定7,8,9,10,11。以上仅是基因融合检测在癌症患者临床应用中的部分实例。
由于基因融合检测在临床决策中具有关键作用，因此从临床样本中准确检测基因融合至关重要。目前临床实验室已应用多种技术进行基因融合或染色体结构重排分析，包括：细胞遗传学技术、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）以及5’/3’表达失衡分析等12,13,14,15。目前，癌症中可靶向治疗的基因融合数量迅速增加，导致需要同时检测多个基因的融合状态。因此，一些每次只能检测一个或少数几个基因的传统技术正变得效率低下，尤其考虑到临床肿瘤样本通常非常有限，难以分配至多个检测中使用。而下一代测序技术（NGS）是一种非常适合多基因检测的分析平台，基于NGS的检测方法已在临床分子诊断实验室中广泛应用。
目前用于检测融合/重排的二代测序（NGS）检测方法在所用输入材料、文库构建与靶向富集所采用的化学方法，以及单次检测中涵盖的基因数量方面均存在差异。NGS检测可基于从样本中提取的RNA或DNA（或两者）进行。尽管基于RNA的分析常受限于临床样本中RNA高度降解的倾向，但它避免了对DNA为基础的融合检测中常需测序的大而重复的内含子区域，而这些区域已被证明在NGS数据分析中存在困难16。基于RNA的NGS检测的靶向富集策略主要可分为杂交捕获或扩增子介导的方法。尽管两种策略均已成功用于融合检测，但各自具有相对优势17,18。杂交捕获法通常产生更复杂的文库并减少等位基因丢失，而基于扩增子的方法通常所需输入量更低，且脱靶测序更少19。然而，传统扩增子法富集的主要局限之一在于需要为所有已知的融合伙伴设计引物。这一问题尤为突出，因为许多具有重要临床意义的基因已知可与数十种不同的伙伴基因发生融合；即使引物设计能够覆盖所有已知的融合伙伴，新发的融合事件仍无法被检测到。一种最近提出的技术——锚定多重PCR（简称AMP），可克服这一局限20。在AMP中，一种“半功能性”NGS接头被连接到由输入RNA衍生的cDNA片段上。靶向富集通过基因特异性引物与接头引物之间的扩增实现。因此，无论是否涉及新发的融合伙伴，所有目标基因的融合事件均应可被检测（见图1）。本文描述了ArcherDx FusionPlex实体瘤试剂盒的应用，该试剂盒是一种基于NGS的检测方法，采用AMP技术进行靶向富集与文库构建，用于检测实体瘤样本中的致癌基因融合（完整基因列表见补充表1）。该湿实验操作流程及数据分析步骤已在经《临床实验室改进修正案》（CLIA）认证的实验室中经过严格验证。

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td><td>IDT</td><td>11-05-01-13</td><td>用于TNA稀释</td></tr><tr><td>1M Tris pH 7.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9850G</td><td>用于文库合并</td></tr><tr><td>25 mL 带分隔的试剂储液槽</td><td>USA Scientific</td><td>9173-2000</td><td>适用于多通道移液器和大体积试剂操作</td></tr><tr><td>96孔半裙边0.1 mL透明PCR板</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9700</td><td>用于热循环仪步骤</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>用于多个检测步骤后的纯化</td></tr><tr><td>Agencourt Formapure试剂盒</td><td>Beckman Coulter</td><td>A33343</td><td>用于TNA提取</td></tr><tr><td>Archer FusionPlex实体瘤检测试剂盒</td><td>ArcherDX</td><td>AB0005</td><td>该试剂盒包含进行Illumina测序文库制备所需的大部分试剂（也可提供用于Ion Torrent测序的试剂盒）</td></tr><tr><td>96孔冰块</td><td>Light Labs</td><td>A7079</td><td>用于在多个步骤中保持样本低温</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>DSP-MD.43</td><td>用于磁珠洗涤</td></tr><tr><td>Illumina文库定量内参标准品</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4906</td><td>用于文库定量</td></tr><tr><td>文库定量引物及ROX低浓度qPCR预混液</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4973</td><td>用于文库定量</td></tr><tr><td>文库定量标准品</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4903</td><td>用于文库定量</td></tr><tr><td>96孔磁力板（N38级）</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td>用于磁珠纯化步骤</td></tr><tr><td>MBC接头Set B</td><td>ArcherDX</td><td>AK0016-48</td><td>含有样本特异性索引的接头，用于实现多重测序</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td>用于离心PCR管</td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate光学96孔板</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4483485</td><td>用于测序前质控文库定量</td></tr><tr><td>Microamp光学膜压缩垫</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312639</td><td>用于文库定量</td></tr><tr><td>微型板旋转器</td><td>Labnet</td><td>MPS-1000</td><td>用于将液体收集至孔板底部</td></tr><tr><td>MiSeq试剂盒v3（600个循环）</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td>包含MiSeq测序运行所需的各种组分</td></tr><tr><td>MiSeqDx系统</td><td>Illumina</td><td></td><td>高通量测序仪器</td></tr><tr><td>Model 9700热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>在检测过程中用于多个步骤</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>9938</td><td>用作通用稀释液</td></tr><tr><td>光学ABI 96孔PCR板盖</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4311971</td><td>用于测序前质控文库定量</td></tr><tr><td>PCR工作站Model 600</td><td>Air Clean Systems</td><td>BZ10119636</td><td>湿实验检测步骤在此“无菌操作台”中进行</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Qiagen</td><td>1019499</td><td>用于TNA提取</td></tr><tr><td>QuantStudio 5</td><td>Applied Biosystems</td><td>LSA28139</td><td>用于测序前质控和文库定量的qPCR仪器</td></tr><tr><td>Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td>用于测定TNA样本中的RNA浓度</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Fisher</td><td>12-402-178</td><td>用于工作区域的常规RNase去污染</td></tr><tr><td>Seraseq FFPE肿瘤融合RNA参考物质v2</td><td>SeraCare</td><td>0710-0129</td><td>用作检测的阳性对照</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher</td><td>BP359-212</td><td>用于清洁步骤和测序准备</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>172-5120</td><td>测序前质控检测的组分</td></tr><tr><td>TempAssure PCR 8联管条</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>用于试剂和样本混合等操作</td></tr><tr><td>模板RT PCR封膜</td><td>USA Scientific</td><td>2921-7800</td><td>用于覆盖96孔板</td></tr><tr><td>U型底96孔微孔板</td><td>LSP</td><td>MP8117-R</td><td>用于磁珠纯化过程</td></tr></tbody></table>

使用锚定多重聚合酶链式反应联合下一代测序检测致癌基因融合

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

基因融合经常导致多种不同类型癌症的致癌表型。此外，癌症患者样本中某些特定融合基因的存在通常直接影响诊断、预后和/或治疗方案的选择。因此，准确检测基因融合已成为多种疾病临床管理中的关键环节。直到最近，临床基因融合检测主要依赖于单基因检测方法。然而，具有临床意义的基因融合列表不断增长，使得同时评估多个基因融合状态的需求日益迫切。基于下一代测序（NGS）的检测技术通过大规模并行测序核酸的能力满足了这一需求。目前已有多种基于NGS、采用不同基因靶向富集策略的方法可用于临床分子诊断，每种方法各有其优势与局限性。本文描述了采用基于锚定多重PCR（AMP）的靶向富集与文库构建，随后进行NGS检测，以分析临床实体瘤标本中的基因融合情况。在基于扩增子的富集方法中，AMP的独特之处在于其能够在不依赖融合伴侣基因身份的情况下识别基因融合。本文详细介绍了确保从临床样本中准确检测基因融合所需的实验操作步骤和数据分析流程。

如图所示 图3, 图4 和 图5 来自分析用户界面的截图，展示了肺腺癌样本的分析结果。在 图3样本摘要显示在上方，列出了检测到的强证据融合基因以及质控状态（红色圆圈标出）。 ADCK4-NUMBL 融合（列出的3种异构体）因属于持续性转录通读事件而被立即忽略（列表旁的断开圆圈图标表示）。底部 图3 是“读段统计”页面的截图。图中用绿色圆圈标出的是特别有信息量的指标。决定样本通过/失败的关键质控指标用红色突出显示（此指标决定了上方摘要中的通过/失败状态）。如果该值低于20，则阴性融合结果被视为“无信息性”。 图4 和 图5 是两种需要进一步研究的融合基因的融合示意图（上图）和支持该融合的测序读段在JBrows...

本文详细介绍了使用基于锚定多重聚合酶链式反应的文库制备试剂盒，随后进行高通量测序，以检测临床实体瘤样本中的致癌基因融合。文中描述了湿实验操作和数据分析的各个步骤。

基因融合常常导致多种不同类型癌症的致癌表型。此外，某些融合基因在样本中的存在……

本方案用于检测患者肿瘤样本中具有重要临床意义的基因融合。通过单次检测即可同时评估数十个基因的融合状态。该技术的优势在于，无论融合伴侣基因为何，均可从经过固定处理的肿瘤样本中鉴定出基因融合。在临床肿瘤样本中检测特定基因融合可直接为多种癌症的诊断、预后评估及治疗方案选择提供依据。必须认识到，分析算法所识别出的许多融合信号实际上是人为假象。分析数据时最困难的任务就是区分这些假象信号与真实的基因融合事件。首先稀释总核酸，以达到所需的RNA浓度。对于每个样本，将20微升稀释液转移至预冷的铝块中的随机引物反应条管中，并通过上下吹打6至8次混匀。短暂离心收集样本，然后将全部液体转移至96孔PCR板中，并用封板膜密封。将酶标板放入热循环仪中，盖上压缩垫，然后关闭盖子。在65摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，将第一链试剂条管中的随机引物合成产物全部转移。用移液器反复吹打混匀，短暂离心。将全部反应液转移至96孔PCR板中，用常温封膜膜密封。将PCR板放入热循环仪，按照文稿中的说明运行反应程序。根据文稿说明进行第二链 cDNA 合成、修复及第一轮连接反应，随后进入第二轮连接步骤。对分子条形码（MBC）接头条带管进行编号时，将管子水平放置，铰链朝后，使用永久性记号笔标记。从第一轮连接步骤的磁珠纯化板中取出各样品 40 微升，转移至对应的 MBC 接头条带管中，注意勿扰动磁珠沉淀。用移液器吹打混匀试剂，离心收集管内液体，并将全部体积转移至连接反应第二步的试剂条管中。混匀样品后离心，然后放入PCR仪中。关闭加热盖，先在22摄氏度反应5分钟，随后在4摄氏度保持。接下来，通过涡旋振荡重悬连接纯化磁珠，并向一组新的PCR条状管中各加入50 µL。将条状管置于磁力架上孵育1分钟，弃去上清液。从磁力架上取下条状管，用移液器反复吹打，将磁珠重悬于50 µL连接纯化缓冲液中。将第二次连接步骤中的全部样品体积转移至连接纯化磁珠条中。涡旋振荡样品以充分混匀，并在室温下孵育10分钟。在孵育过程中间时间点涡旋振荡样品一次。随后，涡旋混匀样品，离心沉淀，并在磁力架上孵育一分钟。弃去上清液，加入 200 µL 新鲜的连接纯化缓冲液。涡旋重悬，离心沉淀，再置于磁力架上一分钟。经过两次洗涤后，使用超纯水代替缓冲液进行第三次洗涤。将磁珠重悬于20微升5毫摩尔氢氧化钠溶液中，并将样品转移至96孔PCR板。将PCR板放入配备压紧垫的热循环仪中，于75摄氏度孵育10分钟，随后在4摄氏度保存。待样品冷却至 4 摄氏度后，将反应板置于磁力架上至少三分钟，然后进行第一次 PCR。通过向第一轮 PCR 试剂条的每个孔中加入 2 微升 GSP1 引物来配制 PCR 反应体系。将 18 微升第二次连接产物纯化产物转移至第一轮 PCR 试剂条的各管中，并用移液器吹打混匀。将样品离心后转移至96孔PCR板中。放入热循环仪，按照文章所述条件运行PCR程序。随后进行磁珠纯化：将20 µL PCR产物加入每孔含有24 µL纯化磁珠的U型底板中。用移液器反复吹打混匀，将酶标板在室温下静置五分钟，然后将酶标板置于磁力架上孵育两分钟。弃去磁珠上的上清液，用200微升70%乙醇洗涤磁珠两次。最后一次洗涤后，彻底去除乙醇，让样品在空气中干燥两分钟。将平板从磁铁上取下，加入24微升10毫摩尔Tris-HCl（pH 8.0）重悬磁珠。在无磁条件下孵育3分钟，然后将平板重新放回磁铁上静置2分钟。通过将第二次PCR产物用10毫摩尔Tris-HCl进行1至5倍稀释，开始文库定量。随后在含有0.5%吐温-20的10毫摩尔Tris-HCl缓冲液中进行1:199、1:199和20:80的系列稀释。取六微升预混液加入光学96孔板的每个孔中，再加入四微升相应的稀释液或标准品，配制关键PCR反应体系。将反应板离心后放入qPCR仪中。根据文稿说明进行qPCR。文库定量完成后，用10毫摩尔Tris-HCl将所有文库稀释至2纳摩尔。取每种标准化后的文库各10微升，加入一个1.5毫升微量离心管中，混合制成文库池。接下来，通过将10微升文库混合物与10微升0.2 N氢氧化钠混合，并在室温下孵育5分钟，制备变性扩增子文库（DAL）混合物。孵育结束后，加入10微升pH 7.0的200毫摩尔Tris-HCl，随后加入970微升HT1杂交缓冲液。通过混合300微升HT1、25微升20皮摩尔PhiX以及675微升DAL混合物，制备最终上样管。将上样管中的全部体积加入测序仪试剂盒的样本孔中，并将试剂盒装入测序仪。首先选择阳性对照样本，确保所有预期的融合基因和致癌性异构体均已被检测到，并列于“强证据”标签页中。针对每个样本，检查每个GSP2对照的平均唯一起始位点数，然后通过点击“可视化”链接查看每个潜在融合基因的支持性读段，该链接将用户导向基于网页的JBrowse界面，以查看单个融合支持读段的堆积图。确认测序读段大多无错配，且读段中有超过30个碱基与融合伙伴基因比对上，同时确保基因断裂点附近以及引物结合位点相邻的序列无插入或缺失。必须确保每个检出的融合事件均基本无比对错误，并且有相当比例的读段能比对到融合伙伴基因。本方案已用于分析肺腺癌样本中的基因融合状态。摘要显示了强有力的融合基因证据，而读数统计页面则展示了样本的各项指标。该样本的RNA质量良好，因此若未发现融合基因，则会报告阴性结果。一个有效的融合基因检出应具有较高数量的支持性读段、较高比例的引物来源读段支持该融合，以及较多的起始位点数量。测序读段的可视化显示，其与融合伙伴基因的大片段区域具有良好的比对结果。相反，人为假象的融合检出在比对至伙伴基因时，支持性指标较低且错误率较高。分析算法产生的人为假象融合检出较为常见。必须手动检查每一个检出的融合基因，以确保其代表患者样本中真实存在的基因融合事件。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

使用锚定多路聚合酶链反应的致癌基因融合检测,随后进行下一代测序

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。...

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

本文描述了两种下一代测序 panel 的临床方案。其中一个 panel 检测血液系统恶性肿瘤，而另一个 panel...

用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

我们介绍一种基于靶向RNA测序的方法，包括制备带索引的cDNA文库、使用定制探针进行杂交与捕获，以及数据分析，以检测特定转录本的基因表达、突变和基因融合。靶向RNA测序可在台式测序仪上对选定转录本进行经济高效且快速的评估。...

靶向RNA测序实验用于分析基因表达与基因组变异

本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。...

利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。...

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

本文介绍了一种用于识别特定患者不同样本中克隆性和亚克隆性改变的方法。尽管此处描述的实验集中于某一特定肿瘤类型，但该方法可广泛适用于其他实体瘤。...

通过靶向测序方法进行比较性病变分析

非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）治疗管理中需检测的分子生物标志物日益增多，推动了快速且可靠的分子检测方法的发展。本文介绍了一种采用超快速下一代测序（NGS）技术对NS-NSCLC患者进行基因组变异评估的工作流程。...

基于超快速扩增子的非小细胞非鳞状肺癌下一代测序

本方案提供了一种可重复的方法，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中可视化基因扩增。...

福尔马林固定石蜡包埋样本中基因扩增的荧光原位杂交稳健检测

本方案描述了一种用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中可靶向基因组改变的自动化、通过ISO15189认证的下一代测序工作流程。...

使用下一代测序技术检测非小细胞肺癌中的可靶向基因变异

了解锚定多路聚合酶链反应结合下一代测序技术检测临床肿瘤样本中的致癌基因融合。该方法可同时评估多种基因融合状态，为癌症诊断和治疗决策提供关键信息。

使用锚定多重聚合酶链式反应联合下一代测序检测致癌基因融合

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