使用锚定多重聚合酶链式反应联合下一代测序检测致癌基因融合

本方案用于检测患者肿瘤样本中具有重要临床意义的基因融合。通过单次检测即可同时评估数十个基因的融合状态。该技术的优势在于，无论融合伴侣基因为何，均可从经过固定处理的肿瘤样本中鉴定出基因融合。

在临床肿瘤样本中检测特定基因融合可直接为多种癌症的诊断、预后评估及治疗方案选择提供依据。必须认识到，分析算法所识别出的许多融合信号实际上是人为假象。分析数据时最困难的任务就是区分这些假象信号与真实的基因融合事件。

首先稀释总核酸，以达到所需的RNA浓度。对于每个样本，将20微升稀释液转移至预冷的铝块中的随机引物反应条管中，并通过上下吹打6至8次混匀。短暂离心收集样本，然后将全部液体转移至96孔PCR板中，并用封板膜密封。

将酶标板放入热循环仪中，盖上压缩垫，然后关闭盖子。在65摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，将第一链试剂条管中的随机引物合成产物全部转移。

用移液器反复吹打混匀，短暂离心。将全部反应液转移至96孔PCR板中，用常温封膜膜密封。将PCR板放入热循环仪，按照文稿中的说明运行反应程序。

根据文稿说明进行第二链 cDNA 合成、修复及第一轮连接反应，随后进入第二轮连接步骤。对分子条形码（MBC）接头条带管进行编号时，将管子水平放置，铰链朝后，使用永久性记号笔标记。从第一轮连接步骤的磁珠纯化板中取出各样品 40 微升，转移至对应的 MBC 接头条带管中，注意勿扰动磁珠沉淀。

用移液器吹打混匀试剂，离心收集管内液体，并将全部体积转移至连接反应第二步的试剂条管中。混匀样品后离心，然后放入PCR仪中。关闭加热盖，先在22摄氏度反应5分钟，随后在4摄氏度保持。

接下来，通过涡旋振荡重悬连接纯化磁珠，并向一组新的PCR条状管中各加入50 µL。将条状管置于磁力架上孵育1分钟，弃去上清液。从磁力架上取下条状管，用移液器反复吹打，将磁珠重悬于50 µL连接纯化缓冲液中。

将第二次连接步骤中的全部样品体积转移至连接纯化磁珠条中。涡旋振荡样品以充分混匀，并在室温下孵育10分钟。在孵育过程中间时间点涡旋振荡样品一次。

随后，涡旋混匀样品，离心沉淀，并在磁力架上孵育一分钟。弃去上清液，加入 200 µL 新鲜的连接纯化缓冲液。涡旋重悬，离心沉淀，再置于磁力架上一分钟。

经过两次洗涤后，使用超纯水代替缓冲液进行第三次洗涤。将磁珠重悬于20微升5毫摩尔氢氧化钠溶液中，并将样品转移至96孔PCR板。将PCR板放入配备压紧垫的热循环仪中，于75摄氏度孵育10分钟，随后在4摄氏度保存。

待样品冷却至 4 摄氏度后，将反应板置于磁力架上至少三分钟，然后进行第一次 PCR。通过向第一轮 PCR 试剂条的每个孔中加入 2 微升 GSP1 引物来配制 PCR 反应体系。将 18 微升第二次连接产物纯化产物转移至第一轮 PCR 试剂条的各管中，并用移液器吹打混匀。

将样品离心后转移至96孔PCR板中。放入热循环仪，按照文章所述条件运行PCR程序。随后进行磁珠纯化：将20 µL PCR产物加入每孔含有24 µL纯化磁珠的U型底板中。

用移液器反复吹打混匀，将酶标板在室温下静置五分钟，然后将酶标板置于磁力架上孵育两分钟。弃去磁珠上的上清液，用200微升70%乙醇洗涤磁珠两次。最后一次洗涤后，彻底去除乙醇，让样品在空气中干燥两分钟。

将平板从磁铁上取下，加入24微升10毫摩尔Tris-HCl（pH 8.0）重悬磁珠。在无磁条件下孵育3分钟，然后将平板重新放回磁铁上静置2分钟。通过将第二次PCR产物用10毫摩尔Tris-HCl进行1至5倍稀释，开始文库定量。

随后在含有0.5%吐温-20的10毫摩尔Tris-HCl缓冲液中进行1:199、1:199和20:80的系列稀释。取六微升预混液加入光学96孔板的每个孔中，再加入四微升相应的稀释液或标准品，配制关键PCR反应体系。将反应板离心后放入qPCR仪中。

根据文稿说明进行qPCR。文库定量完成后，用10毫摩尔Tris-HCl将所有文库稀释至2纳摩尔。取每种标准化后的文库各10微升，加入一个1.5毫升微量离心管中，混合制成文库池。

接下来，通过将10微升文库混合物与10微升0.2 N氢氧化钠混合，并在室温下孵育5分钟，制备变性扩增子文库（DAL）混合物。孵育结束后，加入10微升pH 7.0的200毫摩尔Tris-HCl，随后加入970微升HT1杂交缓冲液。通过混合300微升HT1、25微升20皮摩尔PhiX以及675微升DAL混合物，制备最终上样管。

将上样管中的全部体积加入测序仪试剂盒的样本孔中，并将试剂盒装入测序仪。首先选择阳性对照样本，确保所有预期的融合基因和致癌性异构体均已被检测到，并列于“强证据”标签页中。针对每个样本，检查每个GSP2对照的平均唯一起始位点数，然后通过点击“可视化”链接查看每个潜在融合基因的支持性读段，该链接将用户导向基于网页的JBrowse界面，以查看单个融合支持读段的堆积图。

确认测序读段大多无错配，且读段中有超过30个碱基与融合伙伴基因比对上，同时确保基因断裂点附近以及引物结合位点相邻的序列无插入或缺失。必须确保每个检出的融合事件均基本无比对错误，并且有相当比例的读段能比对到融合伙伴基因。本方案已用于分析肺腺癌样本中的基因融合状态。

摘要显示了强有力的融合基因证据，而读数统计页面则展示了样本的各项指标。该样本的RNA质量良好，因此若未发现融合基因，则会报告阴性结果。一个有效的融合基因检出应具有较高数量的支持性读段、较高比例的引物来源读段支持该融合，以及较多的起始位点数量。

测序读段的可视化显示，其与融合伙伴基因的大片段区域具有良好的比对结果。相反，人为假象的融合检出在比对至伙伴基因时，支持性指标较低且错误率较高。分析算法产生的人为假象融合检出较为常见。

必须手动检查每一个检出的融合基因，以确保其代表患者样本中真实存在的基因融合事件。