Name: 从小鼠横纹肌瘤分离的原发性肿瘤细胞的肿瘤球衍生和治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习从小鼠横纹肌瘤分离原代细胞并进行肿瘤球培养与治疗的方法。该技术可模拟肿瘤微环境，为药物筛选和肿瘤起源细胞研究提供可靠平台。

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本研究工作得到了艾里森医学基金会资助项目 AG-NS-0843-11 以及美国国家癌症研究所癌症中心支持资助项目 P30CA030199 内的 NIH 启动基金对 A.S. 的资助。

小鼠的饲养、处理和处死均按照桑福德伯纳姆普雷比斯医学发现研究所批准的IACUC方案进行。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>准备 100 mL 细胞分离培养基：F10 培养基添加 10% 马血清（HS）。</li>
	<li>准备 50 mL 胶原酶 II 型溶液：将 1 g 胶原酶 II 型粉末溶解于 50 mL 细胞分离培养基中（注意每 1 mL 培养基中酶的单位数，因为不同批次的酶单位可能不同）。分装该溶液并储存于 -20 °C 冰箱中，待使用前取出。 
	注意：每次使用前应对每一批次的胶原酶进行测试，因为不同批次间的酶活性可能存在差异。</li>
	<li>每份样品准备 10 mL 第二消化溶液：细胞分离培养基中含 100 单位/mL 胶原酶 II 型溶液和 2 单位/mL 新鲜称重的中性蛋白酶 II（dispase II）。使用前现配。</li>
	<li>准备 500 mL 肿瘤细胞培养基：DMEM 高糖培养基添加 20% FBS 和 1% 青霉素/链霉素（pen/strep）。</li>
	<li>准备 500 mL FACS 缓冲液：1x PBS 添加 2.5% v/v 正常山羊血清和 1 mM EDTA。</li>
	<li>准备 500 mL 肿瘤球培养基：DMEM/F12 培养基添加 1% 青霉素/链霉素（pen/strep）。使用前立即加入以下生长因子：1% N2 添加剂、10 ng/mL EGF 和 10 ng/mL β-FGF。</li>
</ol>
2. 细胞分离与培养
<ol>
	<li>准备一个含有5 mL细胞分离培养基的10 cm培养皿（每个肿瘤样本对应一个培养皿），并将其置于37 °C培养箱中，待肿瘤组织收获时使用。</li>
	<li>RMS 据报道可在杜氏肌营养不良症的小鼠模型（如约18月龄的B10 mdx小鼠和9月龄的B6 mdx/mTR小鼠）中自发产生，且在雄性和雌性小鼠中均有发生22,23用异氟烷麻醉患有RMS肿瘤的小鼠，并通过颈椎脱位或根据机构IACUC指南处死动物。使用剪刀在肿瘤所在区域的皮肤上做切口，并用镊子将皮肤从目标区域剥离。使用刀片将肿瘤从动物体内切除。</li>
	<li>称取500–1,000 mg肿瘤组织，置于步骤2.1中准备好的培养皿中图1A). 
	注意：组织量过大会对消化步骤产生不利影响，并降低总体得率。若收获的肿瘤组织超过1000 mg，应将其分割成若干部分，并进行随机取样，直至达到目标重量。为评估组织异质性，必须进行随机取样。</li>
	<li>将含有肿瘤组织的培养皿置于无菌细胞培养操作台中，用剃刀片将其切碎。横纹肌肉瘤（RMS）的肿瘤组织具有异质性，因此不同区域对切割的阻力可能不同。应确保切碎后的组织块大小均匀，以保证最佳的消化效果。 
	注意：横纹肌肉瘤（RMS）由多种不同组织类型（主要为纤维化组织、血管化组织和脂肪组织）混合构成，这些组织类型在每个肿瘤中均可识别。为实现以下两个目标：1）准确分离出能真实反映原始肿瘤组成的异质性细胞群体；2）避免对分离过程引入偏差，应对收获的组织进行随机取样。应平行消化并检测来自肿瘤不同区域的细胞。 体外 在第3节所述的实验中</li>
	<li>将剪碎的组织和细胞分离培养基转移至15 mL离心管中，用4 mL细胞分离培养基洗涤培养板，并将其加入该离心管中。</li>
	<li>加入胶原酶溶液至终浓度为700单位/毫升，以消化组织，并在37 °C振荡水浴中孵育1.5小时。</li>
	<li>孵育后，以300 x g离心收集组织 g 室温下静置5分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀物，将沉淀物重悬于10 mL第二消化液（dispase）中，于37 °C振荡水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>第二次消化完成后，用移液器轻轻吹打细胞悬液，并通过置于50 mL离心管上的70 μm尼龙滤网过滤。随后加入10 mL细胞分离培养基冲洗滤网并稀释消化液，于300 x g离心沉淀组织。 g 以及室温孵育5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀重悬于20 mL肿瘤细胞培养基中。随后将细胞悬液转移至15 cm细胞培养皿中，于37 °C培养箱中孵育过夜。此培养皿标记为P0。</li>
	<li>分离后的第二天更换培养基。此步骤对于清除可能对细胞存活产生不利影响的碎片和死细胞十分必要。</li>
	<li>更换培养基后评估细胞汇合度，其范围为30%–60%，具体取决于起始材料的量和细胞大小。将细胞继续置于培养箱中培养，直至汇合度达到90%。每天监测细胞状态，每2天更换一次培养基。肿瘤细胞达到汇合所需的时间因多种参数而异，包括肿瘤侵袭性、肿瘤基因型、小鼠年龄以及组织异质性。</li>
	<li>进行细胞传代时，请按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>将细胞解离溶液和肿瘤细胞培养基在37 °C水浴中预热。</li>
		<li>用1×无菌PBS洗涤细胞，然后在37 °C下用10 mL预热的细胞解离液孵育5–10分钟。</li>
		<li>当所有细胞从培养板上脱落后，加入10 mL预热的肿瘤细胞培养基，将溶液转移至50 mL离心管中，在300 x g条件下离心沉淀细胞 g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>根据沉淀物的大小，用5–10 mL肿瘤细胞培养基重悬细胞，并使用台盼蓝（1:5稀释）计数活细胞以排除死细胞。</li>
		<li>10号培养皿5 10 cm 培养皿中的细胞或 3 × 105 15 cm 培养皿中的细胞。细胞倍增时间因步骤 2.10 中所述因素而异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肿瘤球的制备
<ol>
	<li>使用第 P1 或 P2 代的肿瘤细胞，以避免因多次传代导致的细胞筛选（图 1B）。为使细胞从培养皿上脱离，首先用 1× PBS 洗涤培养皿，注意不要扰动细胞，然后加入细胞解离液（10 cm 培养皿加 5 mL，15 cm 培养皿加 10 mL），并将培养皿置于培养箱中孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>在明场显微镜下观察确认细胞已脱离，加入等体积的肿瘤细胞培养基（细胞解离液:肿瘤细胞培养基），将细胞悬液转移至离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>根据铺板方法，将细胞重悬于 FACS 缓冲液（第 3.4 节）或肿瘤球培养基（第 3.5 节）中。</li>
	<li>通过流式细胞仪铺板
	<ol>
		<li>将细胞重悬于 FACS 缓冲液中（体积根据细胞沉淀大小决定），使用台盼蓝染色法手动计数活细胞。确保最终细胞浓度为 107 个细胞/mL（每 106 个细胞加入 100 μL FACS 缓冲液）。每 106 个细胞加入 1 μL Fx Cycle Violet 染料，以便在细胞分选过程中区分活细胞与死细胞。同时制备一份未染色对照样本，即不添加 Fx Cycle Violet 染料。 
		注：该浓度已优化，以确保分选过程中的染色效率和速度。细胞浓度过低将延长分选时间，而过高则会影响染色效果。</li>
		<li>利用未染色对照样本设置 FACS 门控，区分活细胞（Fx Cycle Violet-）与死细胞（Fx Cycle Violet+）。随后使用荧光激活细胞分选技术（采用 450/50 滤光片通带）分离并计数活/死细胞，并将所需数量的活细胞铺入 96 孔低吸附培养板的每个孔中。在开始分选前，每个孔需预先加入 200 μL 肿瘤球培养基。 
		注：鉴于肿瘤起始细胞（TPCs）在整体肿瘤细胞中属于稀有亚群，建议通过将小鼠 RMS 细胞以 100 个/孔的密度铺板，以观察悬浮培养中肿瘤球的形成。具体每孔细胞数量应根据所测试肿瘤的特性进行调整。</li>
		<li>将细胞放入培养箱中培养至实验结束。尽量避免扰动培养板，除非必要。对于为期 30 天的实验，每周需更换一次培养基并补充适当比例的生长因子（培养基易蒸发，且生长因子在 1 周后失效）。</li>
		<li>实验结束后，在明场显微镜下手动观察培养板以识别肿瘤球（见第 3.6 步）。 
		注：30 天的时间点已优化，可清晰检测到直径范围为 50–300 μm 的小鼠 RMS 肿瘤球。具体观察时间点应根据所测试肿瘤的侵袭性和增殖速率进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动铺板
	<ol>
		<li>将细胞重悬于肿瘤球培养基中（体积根据细胞沉淀大小决定），使用台盼蓝（1:10 稀释）手动计数活细胞。计算管中细胞浓度，并将适量细胞铺入 96 孔低吸附培养板中。将细胞放入培养箱中培养至实验结束。除更换培养基和生长因子外，尽量避免扰动培养板，具体操作参见第 3.4.3 步。</li>
		<li>实验结束后，在明场显微镜下手动观察培养板以识别肿瘤球，或使用 Celigo 软件进行分析，方法如 Kessel 等人24 所述。详见下文第 3.6 步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>需注意，本实验可获得两种独立的检测结果：形成的肿瘤球数量及其大小。 
	注：当每孔中铺入多个细胞时，可能形成肿瘤球或细胞簇（图 1C，第三和第四图）。细胞簇是在悬浮培养中形成的小型细胞聚集体，有助于提高细胞存活率，其形态不规则。而肿瘤球体积较大，结构更致密，呈球形，来源于单个具有锚定非依赖性生存能力并能高速增殖的细胞25。流式细胞仪铺板与手动铺板可互换使用，具体取决于实验室条件。此外，也可使用不同于 96 孔的低吸附培养板，具体选择取决于实验目的。例如，评估肿瘤球频率时应使用 96 孔低吸附板，而初步筛选细胞致瘤潜能时，使用 6 孔低吸附板可获得更快且更可靠的结果。</li>
</ol>
4. 用重组蛋白处理肿瘤球
<ol>
	<li>重复步骤 3.1 和 3.2。</li>
	<li>如果设置重组蛋白处理实验，首先根据第 4.3 节确定最佳使用浓度；若已有文献报道最优浓度，则直接跳至第 4.4 节。</li>
	<li>确定重组蛋白处理浓度。
	<ol>
		<li>用肿瘤球培养基重悬细胞（体积根据沉淀大小决定），使用台盼蓝染色排除法手动计数活细胞。计算离心管中的细胞浓度，并将 100,000 个细胞接种至 6 孔低吸附培养板中。每种测试浓度设两个孔，未处理对照组也设两个孔（图 2）。待测蛋白浓度应基于文献检索结果确定。</li>
		<li>用不同浓度的重组蛋白分别处理各孔悬浮细胞，将细胞放入培养箱中培养 48 小时（该时间足以评估处理对细胞活力及下游靶基因表达的影响）。随后评估以下参数：
		<ol>
			<li>细胞存活情况：使用明场显微镜观察，并与未处理对照组进行比较，检查细胞形态。健康细胞在显微镜下呈明亮且具反光性，而大量细胞死亡会导致培养基中出现碎片堆积。为定量测定细胞死亡，可采用台盼蓝染色排除法、结晶紫染色、MTT 法或 TUNEL 检测（若进行定量分析，需在原始接种基础上增加一孔）。</li>
			<li>重组蛋白对下游信号通路的影响：通过 PubMed 检索文献，确定已知受该重组蛋白影响的下游基因。设计目标基因的 qRT-PCR 引物，对处理后细胞提取的 RNA 进行 qRT-PCR 分析（图 2）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行重组蛋白处理。
	<ol>
		<li>用肿瘤球培养基重悬细胞（体积根据沉淀大小决定），使用台盼蓝染色排除法手动计数活细胞。根据所需实验的总细胞数（每 96 孔低吸附培养板每孔 100 个细胞）计算所需细胞总数，并用适量的肿瘤球培养基稀释。若进行多种处理，应分别准备不同的细胞管。</li>
		<li>向每根细胞管中加入相应浓度的重组蛋白，然后将细胞接种至 96 孔低吸附培养板的不同孔中。根据重组蛋白的半衰期，在整个实验周期内（直至第 30 天终点）重复处理各孔。</li>
		<li>实验结束时，按照步骤 3.4.4 和 3.6 进行数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用过表达质粒处理肿瘤球
<ol>
	<li>重复步骤 3.1 和 3.2。</li>
	<li>若在一种新的肿瘤类型上建立处理方案，首先根据第 5.3 节确定所用质粒的最佳浓度；若已知最优 DNA 浓度，则直接跳至第 5.4 节。</li>
	<li>确定最佳质粒浓度。
	<ol>
		<li>用肿瘤细胞培养基重悬细胞（体积取决于沉淀大小），并使用台盼蓝染色法手动计数活细胞。将计数后的细胞接种，使其融合度达到 70%–90%（细胞数量高度依赖于细胞大小和形态）。采用 GFP 质粒，按照转染试剂制造商提供的贴壁细胞转染方案检测转染效率。同时平行设置未处理对照组（图 3A）。在 24 孔板中进行转染效率测试。 
		注意：使用贴壁细胞以提高转染效率，因为在悬浮细胞中进行转染效率较低，且对细胞活力有负面影响。</li>
		<li>转染后 48 小时，评估以下参数：
		<ol>
			<li>细胞存活率：使用明场显微镜，比较各孔中细胞数量，并与未处理孔的细胞数量进行比较。</li>
			<li>GFP 表达：计算每孔中 GFP 阳性细胞占总细胞数的百分比（图 3B）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过表达质粒处理
	<ol>
		<li>用肿瘤细胞培养基重悬细胞（体积取决于沉淀大小），并使用台盼蓝染色法手动计数活细胞。将 200,000 个细胞接种至 6 孔板的每一孔中。每个孔用于一次独立的转染实验。每孔均采用针对特定肿瘤类型优化的转染条件进行转染（图 3A）。</li>
		<li>转染后 24 小时，用 1× PBS 洗涤每孔，然后加入温热的细胞解离液（足以覆盖孔底）孵育细胞。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 5–10 分钟，具体时间取决于第 2.15 节中详述的因素。</li>
		<li>当细胞完全解离后，使用台盼蓝染色法分别计数来自每个单独孔的细胞。将 100,000 个细胞接种至 6 孔低吸附培养板的每一孔中，确保不混合来自不同孔的细胞。将培养板置于 37 °C 培养箱中，静置培养一周。 
		注意：本实验持续时间为 7 天，足以允许肿瘤球形成，同时避免肿瘤球融合。肿瘤球融合是指当 100,000 个或更多细胞在悬浮状态下共同培养超过一周时出现的现象，可能干扰对肿瘤球形成能力的准确评估。若实验需要更长的孵育时间，应调整细胞密度或使用聚合物支架以避免肿瘤球融合26。</li>
		<li>实验结束后，按照步骤 3.5.2 和 3.6 分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 异体移植用肿瘤球制备
<ol>
	<li>将细胞外基质（ECM）溶液（每份异体移植物50 μL）和肿瘤细胞培养基（每份异体移植物50 μL）置于冰上。</li>
	<li>肿瘤球可用于同种异体移植。将从特定细胞类型或处理条件下获得的所有肿瘤球收集到一个15 mL或50 mL离心管中（根据培养基总体积确定）图1D). 以 300 x g 离心肿瘤球 g 室温下孵育5分钟。移除肿瘤球上方的上清液，并用10 mL无菌1×PBS洗涤。</li>
	<li>再次以 300 x g 室温孵育5分钟，吸除1×PBS，于细胞沉淀上加入500 μL至1 mL细胞解离液，启动解离过程。将肿瘤球置于消化液中，在37 °C摇动水浴中孵育，每10分钟检查一次消化进展。为促进肿瘤球解离为单细胞悬液，可用移液器反复吹打细胞以实现机械性破碎。消化过程可能持续长达30分钟。 
	注意：尽管不同原代横纹肌肉瘤细胞来源的肿瘤球在培养时间上存在较大差异，但从未观察到细胞活力与消化时间之间存在显著相关性下降。</li>
	<li>当获得单细胞悬液后，加入等体积的肿瘤细胞培养基（1:1，细胞解离溶液：肿瘤细胞培养基），在300 x g条件下离心沉淀 g 4 °C下离心5分钟。 
	注意：从此步骤开始，所有操作均需在冰上进行。离心后，肿瘤球不会像单细胞悬液那样形成稳定的沉淀。为避免扰动或吸走肿瘤球，应使用1 mL移液器轻柔地吸取上清液；当剩余液体约为1 mL时，改用200 μL移液器继续操作。</li>
	<li>将细胞重悬于预冷的肿瘤细胞培养基中（体积根据沉淀量确定），将细胞置于冰上，并用台盼蓝染色法计数活细胞。确定异种移植所需的细胞数量后，将细胞重悬于50 μL预冷的肿瘤细胞培养基中。将移液器吸头浸入预冷的肿瘤细胞培养基中进行冷却。吸头冷却后，吸取50 μL ECM溶液，加入含有细胞的离心管中。此操作过程中不得将离心管从冰上移开。 
	注意：移植所用细胞数量应根据所测试的肿瘤类型及实验目的确定：移植的细胞数量越多，肿瘤形成时间越短（已有研究表明，将20,000个来自小鼠RMS肿瘤球的细胞移植后，6周即可形成肿瘤）。为了能够比较不同细胞系或不同处理之间的差异，必须从相同数量的细胞开始实验。</li>
	<li>由于细胞现已准备好用于移植，需保持在冰上直至注射。将一支带有29 G针头的0.5 mL胰岛素注射器（带针帽）置于冰上，以防止抽吸时细胞溶液凝固。</li>
	<li>打开流量计，调节氧气流速至200 mL/min，并将异氟烷挥发罐调至2.5%。将一只2月龄雄性NOD/SCID小鼠放入诱导室中进行麻醉。等待2–3分钟，直至小鼠意识丧失且呼吸变慢。在开始操作前，先通过足部夹捏确认小鼠已进入麻醉状态，然后在其眼部涂抹兽用眼膏。剃除小鼠右侧体表毛发，用预冷的注射器吸取细胞悬液，并将其皮下注射至剃毛区域。若注射操作正确，皮肤下将形成可见的隆起。 
	注意：细胞异体移植可在与移植细胞相同的小鼠品系中进行。例如，如果纹状体下区（RMS）细胞最初来源于C57BL/6小鼠，则异体移植可于C57BL/6小鼠中实施。若供体与受体品系不同，则应使用免疫缺陷型受体小鼠以避免排斥反应。受体小鼠的年龄也可根据实验目的进行调整。</li>
	<li>每周监测一次小鼠的肿瘤形成情况。 
	注意：为了验证异体移植来源肿瘤的身份，应将其与分离细胞所用的原始肿瘤进行比较。为此，可进行组织学分析以评估形态学特征和成肌标志物的表达，以及更全面的RNA测序分析。</li>
</ol>

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<li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li>
<li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li>
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<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已采用多种方法从肿瘤异质性细胞群体中分离和鉴定肿瘤起始细胞（TPCs）：肿瘤克隆形成实验、荧光激活细胞分选（FACS）分离以及肿瘤球形成实验。肿瘤克隆形成实验最早于1971年被描述，最初用于干细胞研究，之后才逐渐应用于癌症生物学29,30。该方法基于肿瘤干细胞在软琼脂培养中不受限制地增殖的内在特性31。自建立以来，该方法已广泛应用于癌症研究的多个领域，包括肿瘤细胞异质性研究、激素治疗对细胞生长的影响以及肿瘤耐药性研究31。迄今为止，该实验仍被用于多种类型癌症的肿瘤起始细胞鉴定32。
FACS 分离依赖于对目标细胞表面存在的分子标志物的先验知识。该方法已被广泛用于从液体和实体肿瘤中分离肿瘤起始细胞（TPC）。例如，人类急性髓系白血病（AML）起始细胞的首次鉴定是由 Dr. Dick 的研究团队完成的，他们利用 FACS 分选和...

癌症是一种具有异质性的疾病；此外，同一种肿瘤在不同患者中可能呈现不同的基因突变，而在单个患者体内，肿瘤也由多种细胞群体组成1。这种异质性为识别引发和推动癌症发展的细胞带来了挑战，但对这些细胞的特征进行表征对于开发有效的治疗手段至关重要。肿瘤传播细胞（tumor propagating cells, TPC）是一类稀有细胞群体，能够促进肿瘤的发展，这一概念此前已有广泛综述2。尽管TPCs已在多种癌症类型中被鉴定，但对于许多肿瘤类型而言，仍难以找到可用于可靠分离TPCs的分子标志物3,4,5,6,7,8,9。因此，一种不依赖于分子标志物、而是基于TPC功能特性（如高自我更新能力以及在低黏附条件下生长的能力）的方法——即肿瘤球形成实验（tumorsphere formation assay）——可广泛应用于大多数肿瘤中TPCs的鉴定。重要的是，该方法还可用于TPCs的扩增，从而直接应用于抗癌药物筛选及癌症耐药性研究1,10。
横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma, RMS）是一种罕见的软组织肉瘤，最常见于幼儿11。尽管可通过检测成肌标志物的表达在组织学上识别RMS，但由于存在多种肿瘤亚型以及肿瘤发育刺激的高度异质性，RMS的起源细胞尚未被明确界定。事实上，近期研究引发了广泛的科学讨论，探讨RMS究竟起源于成肌细胞还是非成肌细胞，提示RMS可能在不同背景下来源于不同类型的细胞12,13,14,15,16,17。已有大量针对RMS细胞系的研究采用肿瘤球形成实验，以鉴定参与肿瘤发育的信号通路，并表征与高度自我更新能力细胞群体相关的标志物18,19,20,21。
然而，尽管肿瘤球形成实验在鉴定横纹肌肉瘤（RMS）起源细胞方面具有潜力，但目前尚未报道可用于原代RMS细胞的可靠方法。在此背景下，我们团队最近的一项研究采用了一种优化的肿瘤球形成实验，用于在杜氏肌营养不良症（DMD）小鼠模型中鉴定RMS的起源细胞22。从肌肉组织中分离出的多种前肿瘤性细胞类型在低贴附条件下培养，以检测其增殖能力，从而在肌营养不良背景下鉴定出肌肉干细胞为RMS的起源细胞。本文描述了一种可重复且可靠的肿瘤球形成实验方案（图1），该方案已成功用于鉴定极稀有的、负责小鼠RMS发育的细胞群体。

<table><tbody><tr><td>Accutase 细胞解离试剂</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>用于解离贴壁细胞和解离肿瘤球</td></tr><tr><td>Celigo</td><td>Nexcelom</td><td>Celigo</td><td>基于微孔板的图像细胞仪，适用于贴壁细胞和悬浮细胞</td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td>组织消化酶</td></tr><tr><td>Dispase II 蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>组织消化酶</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>肿瘤细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>肿瘤球培养基的组分</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>S312500</td><td>FACS 缓冲液的组分</td></tr><tr><td>重组小鼠 EGF 蛋白</td><td>Gibco</td><td>PMG8041</td><td>肿瘤球培养基的组分</td></tr><tr><td>FACSAria II 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>650033</td><td>荧光激活细胞分选仪</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td>肿瘤细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>Fluriso（异氟烷）麻醉剂</td><td>MWI Vet Supply</td><td>502017</td><td>动物用麻醉试剂</td></tr><tr><td>FxCycle Violet 染色剂</td><td>Life Technologies</td><td>F10347</td><td>区分活细胞与死细胞</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Life Technologies</td><td>16210072</td><td>FACS 缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Ham's F10 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11550043</td><td>FACS 缓冲液的组分</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Life Technologies</td><td>16050114</td><td>细胞分离培养基的组分</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>Corning</td><td>CB40234</td><td>为移植细胞提供支持</td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100X）</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>肿瘤球培养基的组分</td></tr><tr><td>新霉素-多粘菌素 B 硫酸盐-杆菌肽锌眼膏</td><td>MWI Vet Supply</td><td>701008</td><td>眼部药膏</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>FACS 缓冲液的组分，用于细胞洗涤</td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Addgene</td><td>6084-1</td><td>GFP 质粒</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140163</td><td>肿瘤球和肿瘤细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>重组人 &amp;beta;FGF-基础型</td><td>Peprotech</td><td>10018B</td><td>肿瘤球培养基的组分</td></tr><tr><td>重组小鼠 Flt-3 配体蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>427-FL-005</td><td>重组蛋白</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>区分活细胞与死细胞</td></tr></tbody></table>

从小鼠横纹肌肉瘤原代肿瘤细胞中分离肿瘤球并进行处理

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

横纹肌肉瘤（RMS）是儿童中最常见的软组织肉瘤。尽管已有大量研究工作推动了与 RMS 相关的常见突变的鉴定，并实现了不同 RMS 亚型的区分，但在开发新型治疗方法以进一步改善预后方面仍面临重大挑战。尽管 RMS 可通过成肌标志物的表达来识别，但其细胞起源仍不明确，因此关于 RMS 起源于成肌细胞或非成肌细胞仍存在较大争议。本研究提供了一种用于小鼠 RMS 的肿瘤球体实验的可靠方法。该实验基于肿瘤细胞的功能特性，可用于鉴定肿瘤中具有致瘤功能的稀有细胞群体。文中还描述了检测重组蛋白、将转染方案与肿瘤球体实验相结合，以及评估参与肿瘤发生和生长的候选基因的操作流程。此外，还介绍了一种将肿瘤球体异体移植到受体小鼠体内的实验步骤，以在体内验证其致瘤功能。in vivo。总体而言，所述方法可对在不同背景下发生的 RMS 中的稀有致瘤细胞群体进行可靠鉴定与检测。最后，该方案还可作为药物筛选及未来治疗策略开发的平台。

肿瘤球检测 
为获得肿瘤组织中细胞群体的最大异质性，对细胞分离方法进行了优化。首先，由于分离的组织在形态上存在差异区域，为提高分离出均一稀有细胞群体的概率，需从肿瘤的多个区域进行取样（图1A，左侧第一张图）。其次，在机械解离采集的样本时，应保持组织切碎后的大小均一，尽管不同样本之间可能存在不同的组织硬度（图1A，左侧第三和第四张图）。根据起始材料的不同（肿瘤侵袭性、小鼠年龄与基因型、肿瘤位置），细胞在经历分离过程中的机械应力后恢复时间可能有所差异，通常为3–7天（图1A，右侧最后一张图）。为提高细胞存活率和生长能力，应在分离后的第二天更换培养基，之后每2天更换一次。这有助于清除分离过程中积累的碎片和死亡细胞，避免其对细胞活力造成影响。肿瘤球形成实验应在细胞至少传代一次后开始，以确保细胞在悬浮培养条件下具有最佳的活力（<strong class="xfig"...

本方案描述了一种可重复的小鼠横纹肌肉瘤原代细胞分离、肿瘤球形成与处理以及异体移植的方法，起始于肿瘤球培养物。

横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma, RMS）是儿童中最常见的软组织肉瘤。尽管已开展大量研究并实现了对常见……的鉴定

横纹肌肉瘤是一种罕见的软组织肉瘤，其组织学特征为特定的组织形态和成肌标志物的表达。然而，由于这类肿瘤存在不同的亚型，并且其形成受到多种异质性刺激因素的影响，因此确定其起源细胞一直具有很大挑战性。本文介绍了一种可重复且可靠的实验方法，用于鉴定起源于小鼠新鲜获取的肿瘤组织的横纹肌肉瘤的起源细胞，该检测方法即为肿瘤球形成实验。肿瘤球形成实验的主要优势在于，该方法依赖于已知存在于肿瘤起始细胞中的细胞特性，并且还可用于特定细胞群体的扩增与富集。此外，其球形结构能够模拟肿瘤微环境，因此可用于药物筛选研究。该方法有望应用于其他类型的肿瘤，因为它不需要预先了解分子标志物，但可能需要对培养条件进行优化。肿瘤球的形成可能需要一些时间，尤其是当试图鉴定肿瘤中稀有细胞群体时。因此，不建议每天观察亚培养板，因为这可能会对实验结果产生不利影响。首先，在37摄氏度的培养箱中，将含有5毫升分离培养基的10厘米培养皿预热。称取 500 至 1,000 毫克肿瘤组织，置于培养皿中。将含有肿瘤组织的培养皿移至无菌培养操作台，用剃刀片将其切碎。为达到最佳消化效果，请确保切碎的组织块大小均匀。将切碎的组织和细胞分离培养基转移至一个15毫升离心管中。用另外4毫升培养基洗涤培养板，并将洗液加入该离心管中。向管中加入700单位/毫升的胶原酶溶液，在37摄氏度的摇动水浴中孵育1.5小时。孵育结束后，在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀；然后将沉淀重悬于10毫升第二消化液中，在摇动水浴中继续孵育30分钟。第二次消化完成后，用移液器反复吹打细胞悬液，并通过置于50毫升离心管上的70微米尼龙滤膜过滤。随后用10毫升细胞分离培养基洗涤滤膜，并在300 × g离心5分钟以沉淀组织。吸除上清液，将沉淀物重悬于20毫升肿瘤细胞培养基中。将细胞悬液转移至15厘米培养皿，置于37 °C培养箱中过夜培养。次日更换培养基，以去除可能对细胞存活产生不利影响的碎片和死亡细胞。此时评估细胞融合度，并将细胞置于培养箱中继续培养，直至融合度达到90%。每天监测细胞状态，每两天更换一次培养基。对于肿瘤球的分离培养，应使用第1代（P1）或第2代（P2）的细胞，以避免因多次传代导致的细胞筛选。用 PBS 清洗细胞培养皿，然后加入解离液覆盖细胞。将培养皿放入培养箱中孵育 5 至 10 分钟，随后在明场显微镜下观察培养板以确认细胞是否解离。待细胞完全解离后，向培养板中加入肿瘤细胞培养基，将细胞悬液转移至离心管中。在300 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于肿瘤球培养基中。重悬后，使用台盼蓝计数并计算细胞浓度。将适当数量的细胞接种至96孔低吸附培养板中，置于培养箱内直至实验结束，注意除非更换培养基，否则不要扰动培养板。实验结束后，在明场显微镜下或使用 Celigo 软件手动识别肿瘤球。可通过本实验

tumorsphere-derivation-treatment-from-primary-tumor-cells-isolated

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

从小鼠横纹肌瘤分离的原发性肿瘤细胞的肿瘤球衍生和治疗

本方案描述了从小鼠异位激活Sonic...

髓母细胞瘤干细胞的分离、富集与维持

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。...

建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

本视频方案演示了利用神经球培养法从手术切除的人源多形性胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤组织中分离并扩增类干细胞的操作流程。...

利用神经球实验分离与扩增人脑胶质母细胞瘤多形性肿瘤细胞

最近研究发现，骨肉瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）与其发病机制相关。本文介绍了从常规骨肉瘤（OS）患者活检组织获得的原代细胞培养物中分离CSCs的方法，该方法基于CSCs在非黏附条件下生长的能力。...

建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

以下实验方案重点介绍建立患者来源的软组织肉瘤（STS）原代培养的方法。该模型有助于我们更深入地理解这些罕见恶性肿瘤的分子基础和药物反应特征，并可为后续改善STS治疗策略的研究提供起点。...

建立患者来源软组织肉瘤的原代培养

我们描述了一种通过荧光激活细胞分选法从人源异种移植性肉瘤组织中分离肿瘤起始细胞的详细方案，该方法以人白细胞抗原-1（HLA-1）作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的肿瘤起始细胞进行验证和表征。...

从肉瘤患者来源的异种移植瘤中分离与表征肿瘤起始细胞

本方法的目的是通过成球实验，结合功能分析以及流式细胞术和蛋白质印迹法进行表型鉴定，以可靠地鉴定癌细胞系和原代人肿瘤样本中的肿瘤干细胞（CSC）。...

从妇科及乳腺癌肿瘤中获取肿瘤干细胞球

在本方案中，我们描述了一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全手术切除的小鼠模型。...

一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全切除小鼠模型

骨转移模型的转移发生并不均匀，且发生率并非100%。直接骨内注射肿瘤细胞可能导致肺栓塞。我们提出一种通过将实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移的技术，该方法可实现可重复的移植物植入与肿瘤生长。...

利用实体瘤移植物骨内植入建立原发性骨肿瘤与骨转移模型

本文介绍了一种利用磁共振引导的高强度聚焦超声产生可控性高热，以在横纹肌肉瘤小鼠模型中触发温度敏感脂质体药物释放的实验方案。...

磁共振引导高强度聚焦超声产生的热疗：小鼠横纹肌肉瘤模型中的一种可行治疗方法

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

学习从小鼠横纹肌瘤分离原代细胞并进行肿瘤球培养与治疗的方法。该技术可模拟肿瘤微环境，为药物筛选和肿瘤起源细胞研究提供可靠平台。

从小鼠横纹肌肉瘤原代肿瘤细胞中分离肿瘤球并进行处理

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