用于循环作用电位记录的多井微电极阵列上的人类 iPSC 衍生心肌细胞网络

以下协议描述了多井 MEA 板上人类诱导多能干细胞衍生肌细胞网络的发展，可逆地电分细胞膜进行作用潜力测量。然后，可以使用作用电位参数生成这些响应曲线，以测试电生理学的化合物。Multiwell MEA 编码和电池电镀是需要特别注意的最具挑战性的步骤。

必须努力和迅速地执行这些步骤，以防止液滴扩散和干燥。通过实践，这很容易克服。我们开发了用于单段、质量保证和参数提取的自定义图形用户界面。

我们强大的 MATLAB 工作流旨在将大量原始实验数据快速简化为行动潜在波形的公正分组。首先根据手稿方向解冻人类诱导的多能干细胞衍生心血肌。使用转移移液器轻轻挂起细胞，以分离细胞团。

然后小心地将两毫升细胞悬浮液放入涂有基板的六井板的每个井中，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下将电池培养培养箱中放置该板。细胞应坚持在凝胶片24小时，并在镀后48小时自发跳动。电镀前两天，将0.5毫升的人类 iPSC 心肌细胞培养基添加到 24 井多电极阵列或 MEA 板的每个井中，并执行基线记录以验证信噪比，作为 MEA 的质量检查。

然后，吸气介质，用无菌水冲洗水井，并在紫外光下在层流罩中消毒过夜。第二天，在每一个井中加入0.1毫升FBS，用于水性处理 MEA 表面，并在室温下孵育板30分钟。然后吸气FBS，然后用0.5毫升的无菌水冲洗每口井两次。

将板留在层流罩中干燥过夜。第二天，移液器将5微升的工作纤维素稀释，并小心地将液滴分散在每一个井的中心，以覆盖所有12个电极。立即将板放在加湿室的凸起表面上，内含足够的无菌水，以覆盖整个盘面。

将带板的腔室放在细胞培养箱中三个小时，然后继续进行细胞电镀。当准备好对心肌细胞进行镀盘时，通过在人类 iPSC 心肌细胞解冻介质中稀释细胞密度，将细胞密度调整为每微升 6，000 个细胞。使用轻柔的轻拂来防止细胞沉淀。

将 MEA 板放入层流罩中，用 P10 移液器小心地取出纤维素掉落，无需接触电极。立即将五微升电池液滴分配到井的中心，确保覆盖所有 12 个电极。一次做好这个，防止纤维素干燥。

电镀完成后，将 MEA 板放回松散覆盖的加湿室中，并返回到细胞培养培养箱三小时。孵育后，使用P200移液器仔细添加200微升的人类 iPSC 心肌细胞解冻介质到每一个井，而不会干扰细胞。将 MEA 板放回细胞培养箱中，并在电镀后 24 小时更换培养培养。

当准备从心肌细胞获取信号时，启动采集软件，然后根据手稿指示插入 MEA 板。单击"浏览"按钮，在所有油井中可视化信号，并在稳定状态条件下验证信号质量。在毫伏范围内具有场电位或 FP 信号的电极上做笔记。

然后单击同一按钮以停止浏览。到此点之前，尚未记录任何数据。单击"转到"按钮开始录制。

每个井中的电极将在原始数据窗口中显示 FP 信号。录制 30 秒后，单击"刺激"按钮，允许在选定站点上进行电穿孔 30 秒。然后单击同一按钮停止模拟并继续录制 60 秒。

使用基于 MATLAB 的自定义软件对各种字段潜在和操作潜在数据参数进行分段和提取。首先，运行波形分析代码并单击"文件"并选择 Process.h5。查找并选择以前创建的 mwd。

h5 文件。单击"保存目录"按钮可更改输出文件的存储位置。然后通过选择电极和感兴趣的井组合，然后单击"队列"按钮来创建信号处理队列。

重复此步骤可向队列添加更多电极和井组合。如果细胞用药物治疗，可以通过直接单击 Med 名称，Med 浓度来编辑队列。队列完成后，单击初始化波形按钮，该按钮将开始初始处理，其中识别信号并提取用于分段。

处理完成后，单击"放大"按钮，然后选择操作潜力或 AP 感兴趣区域。单击"保留"按钮，并查看面板。检测到每个波形的波峰和波谷，并叠加规范化的 AP。

完成后，单击"保持"按钮以转到队列中的下一个跟踪，然后对电极的其余部分和井组合信号重复此过程。解冻后心肌细胞的生存能力和电镀密度对于多井 MEA 培养至关重要。适当的电镀导致健康的单层培养，在48小时内自发跳动，而细胞生存能力差导致非菌群比例高的培养物。

细胞液滴分散影响培养密度，甚至可能导致细胞死亡，因此精确的细胞放置非常重要。在 MEA 上培养的电池在电镀后 48 小时接受电气活动质量检查。如果网络内 50% 的电极和 70% 的总网络不产生 FP 信号，则培养率不理想。

电穿孔中位AP录音可以在 MEA 电镀后 48 小时内获得多次。零、24、48、72 和 96 小时同一单元站点的多次电穿孔对 AP 形状随着时间的推移没有显著影响。此外，未观察到来自同一细胞位点的FP和电穿孔后AP振幅之间的相关性。

此方法的一个重要优点是多井 MEA 板可以重复使用多次。为了演示此阵列的可靠性，从三个还原批次中提取了 3，815 个 AP 波形，并提取 AP 持续时间数据以检查结果的可重复性。当有兴趣时，可以进行额外的检测，如基因表达、钙瞬态测量和贴片夹，以调查特定离子电流的行为。

这项技术为研究人员提高电生理成熟度以及筛选对心肌细胞的慢性剂量影响铺平了道路。