基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

以下方案描述了在多孔MEA板上建立人源诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞网络，并可逆地电穿孔细胞膜以进行动作电位测量。随后可利用动作电位参数生成对测试化合物的反应曲线，用于电生理学研究。多孔MEA的编码与细胞接种是最具挑战性的步骤，需特别注意。

必须认真且迅速地执行这些步骤，以防止液滴扩散和干燥。通过练习，这一问题可轻易克服。我们开发了一个自定义的图形用户界面，用于单个分割、质量控制和参数提取。

我们采用了一套稳健的 MATLAB 工作流程，可快速将大量原始实验数据归约为无偏倚的动作电位波形分组。首先，根据论文中的说明解冻人诱导多能干细胞来源的心肌细胞。使用移液管轻轻悬浮细胞，以解离细胞团块。

然后，将两毫升细胞悬液小心地加入已包被基质的六孔板的每个孔中，并将该板置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养孵育箱中。细胞应在24小时内贴附于凝胶条带上，并在接种后48小时开始自发搏动。接种前两天，向24孔多电极阵列（MEA板）的每孔中加入0.5毫升人iPSC心肌细胞培养基，并进行基线记录，以验证信噪比，作为MEA质量检测的质控步骤。

然后，吸除培养基，用无菌水冲洗各孔，并在超净工作台中通过紫外光照射过夜灭菌。次日，向每个孔中加入 0.1 毫升胎牛血清（FBS），以对 MEA 表面进行亲水处理，并将培养板在室温下孵育 30 分钟。随后吸除 FBS，并用 0.5 毫升无菌水冲洗每个孔两次。

将培养板置于超净工作台中过夜晾干。次日，用移液器吸取5 µL工作浓度的纤连蛋白稀释液，小心地将液滴加至每个孔的中央，确保覆盖全部12个电极。立即将培养板放置于加湿孵育盒内的抬高表面上，盒中加入足量无菌水以维持整个培养皿表面的湿度。

将培养板放入细胞培养孵育箱中孵育三小时，然后进行细胞接种。当准备接种心肌细胞时，用人体iPSC心肌细胞复苏培养基将细胞密度调整至每微升6,000个细胞。轻轻弹动管身以防止细胞沉降。

将MEA板放入超净工作台中，用P10移液器小心吸除纤连蛋白液滴，注意不要触碰电极。立即在孔中央加入5 µL细胞悬液，确保覆盖全部12个电极。每次处理一个孔，以防止纤连蛋白干燥。

完成铺板后，将MEA板放回松散盖好的保湿培养盒中，并置于细胞培养箱内孵育3小时。孵育结束后，使用P200移液器小心地向每孔加入200 µL人iPSC心肌细胞复苏培养基，避免扰动细胞。将MEA板重新放回细胞培养箱中，并在铺板后24小时更换培养基。

当准备采集心肌细胞信号时，启动采集软件，并根据说明书指示插入MEA板。点击“Explore”按钮以查看所有孔中的信号，并在稳态条件下验证信号质量。记录下场电位（FP）信号在毫伏范围内的电极情况。

然后点击同一按钮以停止探索。至此尚未记录任何数据。点击“开始”按钮以开始记录。

每个孔中的电极将在原始数据窗口中显示场电位信号。记录30秒后，点击“刺激”按钮，对选定位置进行30秒的电穿孔。然后再次点击同一按钮以停止刺激，并继续记录60秒。

使用基于 MATLAB 的自定义软件对场电位和动作电位数据进行分割并提取各种参数。首先，运行波形分析代码，点击“文件”（File），选择“处理.h5”（Process.h5）。查找并选择先前创建的 mwd 文件。

h5 文件。单击“保存目录”按钮以更改输出文件的存储位置。然后通过选择感兴趣的电极和孔组合，再单击“队列”按钮，创建信号处理队列。

重复此步骤，以向队列中添加更多的电极和孔板组合。如果细胞经过药物处理，可通过直接点击药物名称（Med Name）和药物浓度（Med Concentration）来编辑队列。队列确定后，点击“初始化波形”（Initialize Waveforms）按钮，系统将开始初步处理，识别并提取信号以进行分割。

处理完成后，点击“放大”按钮，选择动作电位（AP）的目标区域。点击“保留”按钮，并查看面板。系统将检测每个波形的波峰和波谷，并将归一化的动作电位叠加显示。

完成后，单击“Keep”按钮进入队列中的下一个信号记录，并对剩余的电极与孔组合信号重复此过程。解冻后心肌细胞的存活率和铺板密度对于多孔MEA培养至关重要。适当的铺板可使细胞在48小时后形成具有自发搏动的健康单层培养，而细胞存活率较差则会导致培养物中非心肌细胞比例较高。

细胞液滴分散会影响培养密度，甚至可能导致细胞死亡，因此精确的细胞定位至关重要。接种后48小时，对MEA上培养的细胞进行电活性质量检测。若网络内50%的电极以及总网络数70%的电极未产生场电位（FP）信号，则表明培养状态不理想。

通过电穿孔介导的动作电位记录可在MEA铺板后48小时多次获得。在同一细胞位点于0、24、48、72和96小时进行多次电穿孔，对动作电位的波形随时间的变化无显著影响。此外，同一细胞位点的场电位（FP）与电穿孔后动作电位的幅度之间未观察到相关性。

该方法的一个显著优势是多孔MEA板可多次重复使用。为验证此阵列的可靠性，从三个恢复批次中提取了3,815个动作电位波形，并提取动作电位持续时间数据以检验结果的可重复性。在有需要时，还可进行其他检测，例如基因表达分析、钙瞬变测量和膜片钳实验，以研究特定离子电流的行为。

该技术为研究人员提供了增强心肌细胞电生理成熟性以及筛选慢性剂量效应的新途径。