Name: 用于循环作用电位记录的多井微电极阵列上的人类 iPSC 衍生心肌细胞网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解利用多孔微电极阵列培养人诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络的技术，通过可逆电穿孔记录动作电位。该方法结合MATLAB数据分析流程，实现高通量电生理信号处理与药物筛选应用。

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1. 溶液与材料的准备（参见材料列表）
<ol>
	<li>6孔组织培养板基质包被
	<ol>
		<li>在冰上或4 °C条件下解冻包被基质。</li>
		<li>用冷的DMEM/F12培养基将包被基质按1:100比例稀释。通过缓慢移液混匀溶液。</li>
		<li>向6孔组织培养板的每孔中加入2 mL包被基质溶液（步骤1.1.2）。</li>
		<li>立即把包被好的组织培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中孵育至少7小时，并在7天内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hiPSC-CM培养基
	<ol>
		<li>将4 °C解冻的10 mL CM培养基添加剂加入500 mL CM基础培养基中。4 °C保存，可保存最多2周。</li>
		<li>按当日所需量分装培养基，使用前恢复至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hiPSC-CM解冻培养基：使用前将hiPSC-CM培养基（步骤1.2）与10%胎牛血清（FBS）新鲜混合配制，并将培养基升至室温，用于心肌细胞的悬浮解冻。</li>
	<li>纤维连接蛋白1 mg/mL储存液：将200 µL分装至1.5 mL无菌微量离心管中，4 °C保存以备后续使用。工作液浓度为50 µg/mL，使用时在冰上新鲜配制。</li>
	<li>多孔板清洗液：将0.5 g酶解型洗涤剂溶于50 mL无菌双蒸水（ddH2O）中，涡旋振荡混匀。过滤后4 °C保存，最多可保存一周。</li>
</ol>
2. 冷冻保存的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CM）的预铺板成熟培养（图1）
注意：本部分适用于采用无饲养层单层法分化、在分化后第10天以每管100万至200万个细胞的密度在液氮中冷冻保存的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）的解冻与培养3,16。每管细胞接种至经基质包被的6孔细胞培养板中的两个孔内。心肌细胞易沉降至离心管底部，因此在预接种时轻柔混匀对于确保各孔间细胞密度均匀至关重要。
<ol>
	<li>将每瓶待解冻的 hiPSC-CMs 对应 2 mL FBS 分装至 15 mL 锥形管中，并置于室温。</li>
	<li>将冻存的 hiPSC-CMs 冻存管放入 37 °C 水浴中解冻，轻轻摇动以确保均匀解冻，时间不超过 3 分钟。</li>
	<li>立即把冻存管中的内容物转移至含有 FBS 的离心管中（见步骤 2.1），轻轻摇动混匀，然后在 200 × g 下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀用每瓶 1 mL 的 hiPSC-CM 解冻培养基（见步骤 1.3）重悬。使用移液管通过轻柔吹打使沉淀重悬，并评估细胞活力。</li>
	<li>在步骤 2.4 中每解冻一管 hiPSC-CM，加入额外的 3 mL 解冻培养基，使用移液管轻轻吹打，进一步分散细胞团块。</li>
	<li>将 2 mL 细胞悬液轻柔地分装至已包被基质的 6 孔板的每个孔中（见步骤 1.1）。置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养孵箱中培养。</li>
	<li>24 小时后更换为新鲜的 hiPSC-CM 培养基，之后每周更换三次，持续 20 天。 
	注意：细胞应在 24 小时内贴附于基质涂层，并在接种后 48 小时内开始自发搏动（见 视频 1 和 视频 2）。</li>
</ol>
3. 多孔微电极阵列板的灭菌与包被（图2和图3）
注意：此处所述方案适用于制备24孔MEA板，每孔含12个玻璃基底上的微金电极，电极表面涂覆PEDOT，用于hiPSC-CM的接种。请避免触碰板底，以免损坏电极。
<ol>
	<li>在细胞铺板前两天，向每个孔中加入 0.5 mL hiPSC-CM 培养基（见步骤 1.2），并进行基线记录，以验证信噪比，从而对 MEA 进行质量检查。</li>
	<li>吸除培养基，用无菌 ddH2O 冲洗，并在超净工作台内用紫外灯灭菌过夜。</li>
	<li>在细胞铺板前一天，向每个孔中加入 0.1 mL FBS，以对 MEA 表面进行亲水处理。室温孵育 30 分钟。此步骤对细胞贴附至关重要。</li>
	<li>吸除 FBS，并用 0.5 mL 无菌 ddH2O 每孔冲洗一次，重复一次。</li>
	<li>将培养板置于超净工作台内过夜晾干。</li>
	<li>从储备液中用冷的 DMEM/F12 培养基配制 50 µg/mL 的纤连蛋白工作液（见步骤 1.4）。将溶液置于冰上保存。</li>
	<li>用移液器吸取 5 µL 纤连蛋白工作液（见步骤 3.6），小心地将液滴加至每个孔的中心，确保覆盖全部 12 个电极。需迅速完成全部 24 个孔的操作，以防液滴干燥。</li>
	<li>立即将包被纤连蛋白的多孔 MEA 板放置于加湿 chamber 内的抬高表面上，加湿 chamber 内应含有无菌 ddH2O，以覆盖整个培养皿表面。将加湿 chamber 连同多孔 MEA 板一起置于细胞培养箱中孵育 3 小时。 
	注意：将 24 孔 MEA 板置于加湿 chamber 中至关重要，可防止孵育期间纤连蛋白液滴干燥。</li>
</ol>
4. 多孔MEA板上hiPSC-CM的解离与接种（图3）
注意：在 MEA 纤连蛋白孵育完成前约 1 小时开始此步骤。确保细胞解离溶液处于 37 °C，iPSC-CM 解冻培养基处于室温。解离方法已针对在基质包被的 6 孔板上培养至分化后第 30 天的 hiPSC-CM 进行优化（见步骤 2），以获得约 90% 活性的心肌细胞用于 MEA 接种。吹打过程中应避免引入气泡，以防细胞死亡。
<ol>
	<li>从6孔组织培养板的每个孔中吸除培养30天后的hiPSC-CM分化培养液（见步骤2.7），并用2 mL无菌D-PBS每孔洗涤一次。</li>
	<li>每孔加入1 mL预热的细胞解离液（见材料表），在37 °C孵育4分钟。使用移液管轻轻吹打以松解细胞促进解离。若大部分细胞仍贴壁，于37 °C再孵育3分钟并再次吹打。此额外孵育有助于最大程度回收细胞。总孵育时间不得超过7分钟，否则可能导致细胞活力降低。</li>
	<li>使用移液管将所有解离的细胞收集至一个锥形管中，管内已含有hiPSC-CM复苏培养基（见步骤1.3）。建议将细胞悬浮于至少两倍体积的培养基中（每孔收获细胞对应2 mL培养基），以中和细胞解离液的活性。</li>
	<li>在200 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，因细胞沉淀与管壁结合较松散，然后用0.1 mL hiPSC-CM复苏培养基重悬细胞。使用移液管通过轻柔吹打数次使沉淀充分重悬。</li>
	<li>取2 µL解离后的细胞悬液，加入18 µL培养基稀释于1.5 mL微量离心管中。加入20 µL台盼蓝染液，混匀后进行细胞计数和活力评估。</li>
	<li>根据需要加入适量hiPSC-CM复苏培养基，将细胞密度调整至6,000个细胞/µL。通过轻轻弹击管壁数次使沉淀重悬。hiPSC-CM容易从玻璃表面脱落，尤其是在高密度接种时。我们已优化接种密度和铺板条件，以实现持续15天的电生理记录。</li>
	<li>准备就绪后，将多孔MEA板移入超净工作台进行细胞接种。以下两个步骤必须逐孔操作，以防止纤连蛋白干燥。
	<ol>
		<li>使用P10移液器小心吸除纤连蛋白液滴，避免触碰电极。</li>
		<li>立即向MEA板每孔中心加入5 µL细胞悬液（含30,000个细胞），覆盖全部12个电极。重复此操作直至完成24个孔的接种。建议在接种过程中间歇性轻弹混匀细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将多孔MEA板放回松盖的保湿培养盒中，置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育3小时，以促进细胞贴附。</li>
	<li>使用P200移液器小心向每孔加入200 µL hiPSC-CM复苏培养基，避免扰动细胞&#160;。将培养基逐滴加至孔壁侧面。</li>
	<li>将多孔MEA板重新放回细胞培养箱中继续培养。</li>
	<li>接种24小时后更换新鲜的hiPSC-CM培养基。此时可观察到心肌细胞的自发搏动（见视频3）。</li>
	<li>每隔2天更换一次培养基，直至实验结束。</li>
</ol>
5. hiPSC-CM 电穿孔与信号采集（图 4 – 6）
注意：本方案适用于高通量电极信号的同时记录（每个24孔中的12个记录位点）。使用24孔多孔MEA系统配合数据采集软件（见材料表）进行实验。所有MEA记录均在37 °C下进行。
<ol>
	<li>打开接口板并启动采集软件。等待多孔MEA探头温度升至37 °C（见图4中的箭头1）。</li>
	<li>将步骤4中的多孔MEA板插入多孔MEA探头，将其盖好后放置于记录平台，并点击插入按钮（见图4中的箭头2）。在开始记录前，确保温度已稳定。</li>
	<li>调整采集和电穿孔设置
	<ol>
		<li>点击定义实验流程图标（见图4中的箭头3），将记录时间设置为2分钟或按需设定。</li>
		<li>点击数据采集设置图标（见图4中的箭头4），将采样率设为20 kHz，高通滤波器设为0.1 Hz，低通滤波器设为3500 Hz。</li>
		<li>点击刺激器设置图标（见图5）。在刺激定义选项卡下，将刺激定义为1 mV、1 ms、1 Hz的双相对称电压脉冲。在刺激电极选项卡下，通过高亮所有相关电极来选择电穿孔位点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击探索按钮，以在所有孔中可视化信号。验证信号质量和稳态条件。记录输出FP信号在mV范围内的电极信息。再次点击该按钮以停止探索。此时尚未记录任何数据。</li>
	<li>点击开始！按钮开始记录。每个孔中的电极将在原始数据窗口中显示FP信号（图6）。记录30秒后，点击刺激按钮，使选定位置进行30秒的电穿孔；然后再次点击该按钮停止刺激，并继续记录剩余的60秒。 
	注意：可通过在“应用”下拉菜单中切换至“回放模式”来回放所记录的文件。</li>
</ol>
6. 多孔微电极阵列板的清洁以重复使用
<ol>
	<li>完成最终实验后，通过从每个孔中吸出所有培养基内容物来清洁多孔板中的所有孔，并注意避免触碰电极表面。</li>
	<li>每孔加入 1 mL 无菌 ddH2O。吸出后重复一次。</li>
	<li>每孔加入 0.3 mL 多孔板清洗液（见步骤 1.5）。室温孵育过夜，以去除细胞和碎片。</li>
	<li>次日早晨，吸出溶液，并用 1 mL 无菌 ddH2O 冲洗。孵育 5 - 7 分钟后吸出。重复此步骤 5 次。</li>
	<li>每孔加入 0.5 mL 无菌 ddH2O。记录清洁后多孔板的基线值，用于清洁后微电极阵列的质量检查（图 7）。</li>
	<li>4 °C 保存，待使用时取出。</li>
</ol>
7. 数据文件转换与导出
注意：每次记录将生成四个数据文件：MWR、MWC、MWD 和 MWS 文件。使用转换软件，可将 MWD 文件转换为 H5 文件，以便使用自定义脚本进行后续分析（参见补充文件 1）。
<ol>
	<li>启动转换软件（参见材料表）。</li>
	<li>从文件菜单中选择设置输入路径，然后选择包含目标数据文件的文件夹。</li>
	<li>从文件菜单中选择设置输出路径，然后选择用于保存转换后文件的文件夹。</li>
	<li>高亮选中目标 MWD 文件。</li>
	<li>点击导出为 HDF5按钮。</li>
</ol>
8. 数据分割与分析（图8-10）
注意：使用基于 Matlab 的自定义软件来分割并提取各种荧光蛋白（FP）和动作电位（AP）数据参数。该软件可根据需求提供。
<ol>
	<li>使用 Matlab 运行Waveform Analysis代码（参见图8中GUI主窗口的界面）。</li>
	<li>点击File，然后选择Process .h5。</li>
	<li>查找并选择根据上述第7步创建的mwd.h5文件。</li>
	<li>点击Save Directory按钮，以更改输出文件的存储位置。</li>
	<li>通过选择感兴趣的电极/孔位组合，然后点击Queue按钮，创建一个信号处理队列。重复此步骤，可向队列中添加更多待处理的电极/孔位组合。</li>
	<li>如果细胞经过药物处理，可直接点击Med Name / Med Concentration来编辑队列信息（图8）。</li>
	<li>队列确定后，点击Initialize Waveforms按钮。系统将开始初步处理，识别并提取用于分割的信号。</li>
	<li>点击Zoom In按钮，使用光标选择感兴趣的动作电位区域（图9）。</li>
	<li>点击Keep按钮并查看各面板。每个波形的峰值（红色“x”）和谷值（黄色圆圈）将被检测，归一化后动作电位将叠加显示。再次点击Keep按钮，进入队列中的下一个记录轨迹（图10）。</li>
	<li>对队列中其余的电极/孔位组合信号重复执行步骤8.8–8.9。 
	注意：.csv文件将被生成，其中包含每个波形测得的动作电位时程（APD）参数。同时，每个.h5文件还将保存一个对应的.mat文件，以便对已分割的数据进行进一步处理。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

多年来，微电极阵列（MEA）的应用局限于对可兴奋细胞进行场电位（FP）测量，以研究其电生理特性36,37,38,39。仅有少数研究团队利用定制的基于MEA的技术报道过来自电活性细胞的动作电位（AP）轨迹18,29,30。然而，这些方法尚未被用于对同一批样品进行重复记录。我们开发了一种创新且精确的方法，可同时在多个hiPSC-CM网络中对同一细胞位点进行持续数天的动作电位研究3。在我们已发表的研究中，采用了一种多孔微金微电极阵列平台，以1 µs的时间分辨率，从多批次hiPSC-CM培养物中高精度地生成动作电位波形数据库。本文所述方案详细说明了在阵列表面接种hiPSC-CM，以高效构建合胞体心肌细胞（CM）网络，实现高通量动作电位记录。该方案中的多个关键步骤包括：1）制备多批次高纯度、经质量控制的心肌细胞用于冷冻保存建库；2）获得高复苏活力的心肌细胞用于预接种和成熟；3）对多孔MEA板进行处理以利于心肌细胞接种；4）在分化后第30天对hiPSC-CM培养物进行解离，用于MEA接种；5）对MEA平台进行恢复处理，以实现多次重复使用。
需要注意的是，hiPSC分化过程中批次间的差异可能影响实验结果。本实验室已对单层分化法进行了优化，可高效生成心肌细胞3,40。我们培养物中MLC2v和TNNT2标志物的FACS分析显示，具有≥90%的类似心室表型3。这些经过质量控制的细胞培养物已被冷冻保存，用于后续实验研究。目前的分化方法所获得的细胞为包含类似结状、心房和心室细胞的混合群体3,16,17,41。因此，采用针对心肌细胞亚型富集的策略可进一步提高培养物的特异性。此外，可采用组织工程方法促进细胞的成熟。本文提出的方法也可便捷地应用于其他来源的心肌细胞。
使用MEA记录的AP波形与通过光学标测技术从心肌细胞网络中记录的波形相似42,43，基于互补金属氧化物半导体的多电极阵列18,21，以及使用膜电位记录模拟的动作电位20. 通过微电极阵列研究动作电位测量机制的Hai与Spira方法25 证明了电穿孔-电极界面可模拟已建立的尖锐玻璃微电极技术。然而，由于MEA系统中的电穿孔-电极界面尚未校准，且信号幅值依赖于该技术的灵敏度与分辨率，本研究无法确定静息膜电位和真实的动作电位幅值。在动作电位幅值方面，本方法与光学标测技术具有类似的局限性。
本文报道的基于多孔微电极阵列（MEA）的场电位/动作电位（FP/AP）检测方法为药物安全性评估开辟了新的可能性。尽管具有自发性，这些人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）单层仍以稳定频率搏动。对多个网络中动作电位时程（APD）参数的分析可揭示电生理异质性（图13）。然而，全面的APD恢复分析必须纳入前一个舒张期间期。此外，连续96小时在相同细胞位点记录到的高质量动作电位波形（图11B）是首次实现对膜电动力学随时间变化的追踪，这一成果在发育与疾病研究中具有重要价值。
本文所述的AP参数定量方案可用于生成测试化合物的剂量-反应曲线。正如Edwards等人最近报道的那样3，去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和E 4031在不同复极化时相的APD剂量反应已被绘制出来。已发表的研究证明了该方法在实时识别AP波形剂量依赖性细微变化方面的准确性和可靠性。该技术可轻松扩展应用于其他化合物或小分子文库，以理解各种电生理反应。
本研究中基于MEA的AP测量方法不仅会引起电生理学家的兴趣，也会引起细胞生物学家和in-silico建模人员的关注。此外，对hiPSC-CMs同一细胞位点进行FP/AP同步记录，将使研究人员能够在短时间内生成涵盖多种可兴奋细胞网络的生物电数据文库。这些资源的可及性将对药物发现和疾病建模具有重要价值。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为越来越多实验室的金标准1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。跳动的类胚体11,12,13 和单层培养3,7,10,11,12,13,14,15,16,17 分化是心肌细胞生成的首选方法，而多电极阵列（MEA）已成为监测这些细胞网络电动力学的常用手段18,19,20。虽然可以从场电位（FP）中提取诸如搏动频率、振幅、持续时间和RR间期等参数，这些参数反映了自发搏动单层细胞的基础电生理反应18,21,22,23，但这些细胞外FP信号所对应的动作电位（AP）组分难以推断24。我们近期发表的研究揭示了MEA在直接重复记录动作电位方面的应用，提供了方法学证明，展示了在多批次hiPSC来源心肌细胞网络中不同复极化阶段的详细波形分析，实现了典型的细胞内AP读数3。在该研究中，我们证明了向hiPSC来源心肌细胞网络施加电穿孔脉冲可实现细胞内记录动作电位的通路。这些瞬时的AP记录依赖于通过损伤部位观察到的跨膜电位恢复过程3,25,26。本研究中通过MEA和膜片钳记录的波形显示出相似的AP形态，从而验证了该方法的可靠性3。
少数实验室曾报道使用自行构建的多电极阵列（MEA）从各种电活性细胞中记录动作电位（AP）18,21,26,27,28,29,30，但尚未评估利用MEA进行稳定、可重复的AP测量的可靠性。目前，作为金标准的膜片钳技术仅限于终末记录7,31，而基于MEA的AP测量具有非侵入性，因此可在同一细胞上多次进行。我们还证明，研究人员可轻松记录到毫伏范围内的高质量AP信号，且所需滤波极少。因此，研究人员不仅可在相同样本上开展急性药物研究，还可进行慢性药物研究。此外，该技术可在短时间内实现场电位（FP）与动作电位（AP）的同步测量，从而构建电生理-生物信息学数据库。鉴于目前对心律失常预测及药物相关心脏毒性的关注度日益增加24,32,33,34,35，整合AP测量方法将有助于提升药物安全性与有效性的评估水平。
本文介绍了以下实验方案：1）冷冻保存的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）的预铺板以促进其成熟；2）将hiPSC-CMs解离并接种至多孔微电极阵列（MEA）上；3）记录hiPSC-CM网络的场电位（FP）和动作电位（AP）；4）对数据进行分割与提取以用于分析；以及5）阵列的恢复与多次重复使用。每一步均经过优化，并在关键步骤处进行了重点说明。文中讨论了确保细胞贴壁形成搏动同步单层的条件，并详细解释了多孔MEA阵列在重复性电生理研究中的恢复操作流程。最后，介绍了实验室开发的自定义图形用户界面（GUI），用于AP信号的提取、质量控制及分割工作流程，以实现对AP参数的量化与分析。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>Multichannel Systems</td><td>Multiwell-Screen v 1.9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td>CM培养基添加剂</td></tr><tr><td>转换软件</td><td>Multichannel Systems</td><td>MultiChannel DataManager</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007103HI</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>ThermoFisher</td><td>A1413202</td><td>包被基质</td></tr><tr><td>接口板</td><td>Multichannel Systems</td><td>MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board</td><td></td></tr><tr><td>多孔微电极阵列板</td><td>Multichannel Systems</td><td>24W300/30G-288</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>CM基础培养基</td></tr><tr><td>Terg-a-zyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>酶类洗涤剂</td></tr><tr><td>独立包装移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371148</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>超纯无菌水</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养处理板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

心脏安全性筛选对于药物发现和治疗至关重要。因此，迫切需要开发针对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）的新一代高通量电生理学方法，以实现高效的药物测试。尽管多电极阵列（MEAs）常用于可兴奋细胞的场电位测量，Joshi-Mukherjee 及其同事最近发表的一项研究描述并验证了该技术在连续数天内对同一批 hiPSC-CM 进行重复动作电位（AP）记录的应用。本文旨在提供详细的分步操作方法，用于心肌细胞的接种以及通过电穿孔技术以 1 µs 的时间分辨率高精度测量动作电位波形。该方法弥补了现有技术中缺乏简便、可用于高通量动作电位测量并实现细胞内记录的手段，从而支持可靠的电生理研究。文中详细讨论了将 hiPSC-CMs 接种至多孔 MEA 板的工作流程和实验方法，并在关键步骤处予以特别强调。此外，还报告了一种自行开发的 MATLAB 脚本，用于快速处理、提取和分析数据，以全面开展波形分析，量化与心律失常及心脏毒性相关的各种动作电位时程参数在形态上的细微差异。

解冻后 hiPSC-CMs 的存活率和铺板密度对于多孔 MEA 培养至关重要。将每管 100 万至 200 万个 hiPSC-CMs 预先铺板至 6 孔组织培养板中的两个孔，细胞存活率≥50%，可在 48 小时时形成具有自发搏动的健康单层细胞层。若心肌细胞存活率较低，则会导致培养物中非心肌细胞比例较高。此类单层细胞在解离后用于多孔 MEA 铺板时，通常会产生结果不一致和信号质量差的情况，因此应予以弃用。图 1 展示了铺板后 48 小时时理想与次优 hiPSC-CMs 培养状态的示例。将心肌细胞解冻后先接种于基质包被的组织培养板，而非直接接种于多孔 MEA 上，有助于细胞恢复和成熟3。不建议将冻存的心肌细胞直接铺板至电极阵列上，因其会导致结果不稳定。
除了分离心肌细胞（CMs）的质量外，细胞在多孔微电极阵列（MEA）上的贴壁效果在很大程度上依赖于细胞密度和纤连蛋白包被技术。纤连蛋白液滴的大小至关重要，因为心肌细胞将沿纤连蛋白包被区域的边界分布生长。因此，仅 5 µL 将纤维连接蛋白溶液直接滴加到电极阵列区域。为确保液滴不扩散，包被时孔板表面必须完全干燥。 图2 展示了多孔MEA板的布局及逐步预处理示意图，以实现最佳制备效果。此外，为防止纤连蛋白干燥，在孵育期间（不超过3 h）必须将多孔MEA板置于湿化 chamber 中（参见步骤3.8）。孵育结束后，应在心肌细胞铺板前立即移除每个孔中的纤连蛋白液滴，然后方可进行下一孔的铺板操作。快速而谨慎地加样心肌细胞悬液，是实现细胞成功贴附的关键。
分化后第30天的hiPSC-CM培养物采用酶法细胞解离方法进行解离，用于多孔MEA板接种（参见步骤4）。心肌细胞将在接种后3 h内贴附于纤维连接蛋白包被的MEA表面，接种后24 h可观察到覆盖电极阵列的单层细胞（图3）。单层细胞的同步搏动将在接种后24–48 h内出现。细胞悬液滴加不均可能影响培养密度，甚至导致干燥和细胞死亡。将细胞精确地直接接种在阵列表面至关重要，因此必须通过练习掌握最佳接种技术。细胞若黏附至参考电极将干扰电信号的产生。有关心肌细胞最佳接种位置及接种24 h后的培养状态，请参见图3。
接种后48小时，对培养在多孔微电极阵列（MEA）上的心肌细胞（CMs）进行电生理活性质量检测。通常，场电位（FP）信号振幅在约4天内从微伏（µV）级升高至毫伏（mV）级3。若一个网络中50%以上的电极以及全部网络中70%以上的网络未产生FP信号，则认为该网络或培养物质量不达标，应予以弃用。仅通过质量检测的培养物方可用于FP和动作电位（AP）分析。图6展示了优质与不合格FP信号的示例。
在MEA接种后48小时的培养物中，可通过电穿孔介导的方法多次获得动作电位（AP）记录。通过采用电穿孔技术，我们实现了对多个由人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心肌细胞网络的细胞内记录，获得了高分辨率的动作电位。使用低电压脉冲（1 V，1 ms，1 Hz）持续30秒，可实现场电位（FP）向动作电位（AP）的短暂、可逆转化。电穿孔技术可在约75%的电极上成功实现细胞内记录，用于动作电位测量。电信号记录持续2分钟，包括电穿孔前30秒、电穿孔期间30秒以及电穿孔后1分钟。在电穿孔后10秒开始的一段持续10秒的动作电位波形序列，在所有记录位点上进行信号质量评估与分析。任何不符合纯动作电位信号特征的记录轨迹均被剔除。为了探究动作电位振幅是否与场电位信号相关，我们对全部288个位点进行电穿孔，以同步记录波形。来自两个不同电极在同一细胞位点记录的代表性场电位与动作电位信号如图11A所示。我们未观察到同一细胞位点的场电位振幅与电穿孔后记录的动作电位振幅之间存在相关性。此外，在0、24、48、72和96小时对同一细胞位点进行多次电穿孔，对动作电位波形随时间的变化无显著影响（图11B）。
由于该系统具有高通量特性，采用手动方法提取和量化呼吸频率（RR）间期、瞬时频率以及动作电位时程差等感兴趣参数效率低下且耗时。为此，研究团队开发了一套定制的 MATLAB 脚本，可根据请求向科研社区提供，用于以 1 µs 的分辨率进行波形测量。电穿孔时间点将与提取的信号叠加，以识别电穿孔后 10 秒内的动作电位（AP）信号，进而开展信号提取、质量控制和波形分割流程（图 8，图 9，图 10）。用户界面允许使用者参考叠加的电穿孔标记，选择目标信号段。分割后的波形将由子程序进一步处理，以识别单个动作电位波形。该过程通过峰值检测实现，即识别每个周期中的最高和最低电压。完成该步骤后，对振幅进行归一化处理，并对相应的时间向量进行平移，使峰值为 1 时定义为时间零点。通过在各个周期内对交点进行插值，确定动作电位时程（APD）的测量值。因此，动作电位波形分割的部分自动化流程可在短时间内高效分析多个培养批次中的多种 APD 参数。目前，针对场电位（FP）和动作电位（AP）的纳入与排除标准的进一步自动化工作正在进行中，以实现数据的实时分析。
多孔MEA板的一个显著优势是可多次重复使用。这种恢复能力使得能够进行重复的电生理研究，从而以较低成本获得一致的数据。图中展示了同一阵列在经过6次恢复后的动作电位记录。 图12信噪比在多次重复使用中保持相似。为验证该阵列在重复性电生理研究中的可靠性，共汇总了三个恢复批次的3815个动作电位波形，并提取动作电位时程数据以评估结果的可重复性。单个波形动作电位时程（APD）的分布图30，APD80，三角测量（APD80—APD30）以及分数缩短率（（APD80—APD30)/(APD80）显示（图13).
<img alt="hiPSC-CM 解冻过程示意图及细胞培养结果的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：冷冻保存的hiPSC-CM用于成熟前的预包被。（A）预包被一管分化后10天冷冻保存的hiPSC-CM的细胞处理流程。（B）成功（左）与失败（右）的hiPSC培养的相差显微图像。比例尺：275 µm。请参见视频1和视频2，了解分化后14天和24天成功培养的示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于亲水性处理研究的电极阵列示意图，包含灭菌和处理步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：多孔微电极阵列（MEA）板的设置与准备。（A）多孔 MEA 板示意图：该板包含 24 个孔（A1 至 D6），每个孔内有 12 个微电极阵列和 4 个外周参考电极。电极直径：30 µm；电极间距：300 µm。可同时从 288 个电极获取记录信号。（B）在接种人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）之前需进行的灭菌和亲水性处理步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MEA 流程图；纤连蛋白包被、hiPSC-CM 接种、场电位/动作电位记录；显微成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：hiPSC-CM 在多孔 MEA 板上的解离与接种。（A）每孔 hiPSC-CM 在 MEA 上接种步骤的示意图。（B）显微图像，显示细胞液滴正确覆盖全部 12 个记录电极，且未扩散至 4 个参考电极。（C）接种后 24 小时，MEA 上典型（左）与次优（右）hiPSC-CM 接种情况的相差显微图像。比例尺 = 275 µm。成功 MEA 接种示例见视频 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验流程软件界面；设置记录阶段时长、分析、滤波选项。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：多孔板记录采集软件。 图中箭头指示文中所述关键功能的位置：温度控制（1）面板可实现实验全过程的实时温度监测。插入/弹出（2）按钮用于装载和释放多孔微电极阵列板。定义实验流程（3）功能允许用户设置记录时长。数据采集设置（4）功能允许用户设置采样率和采集滤波参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="模拟软件界面；脉冲图；板网格布局；用于数据分析的实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：hiPSC-CM电穿孔与信号采集。“刺激定义”选项卡允许用户设定电穿孔脉冲参数。“刺激电极”选项卡允许用户选择用于电穿孔的电极，可任意选择288个电极中的组合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电生理学数据图，显示电压随时间变化，附带高亮区域的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：多孔微电极阵列（Multiwell MEAs）电活动的质量检测。多孔-屏幕 采集软件显示原始数据窗口，包含代表性最佳示例（A）和次标准（BFP 信号。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多步清洗流程图与数据分析图；实验方案可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 7"> 
图 7：新阵列与修复后阵列的 FP 和 AP 信号。 多孔微电极阵列（MEA）酶法清洗步骤（A）。新阵列的基线信号显示出极低的信噪比（B），FP 信号反映了神经网络的电活动（C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="数据显示分析软件界面，展示电生理学研究中的波形处理设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig8.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：数据分割与分析。 GUI 主窗口视图 波形分析. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示电极信号随时间变化的电生理数据图，包含波形分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig9.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 9"> 
图 9：数据分割与分析。初始化波形 按钮用于识别并提取动作电位波形以进行分割，并通过放大并选择感兴趣的动作电位区域，启动初步处理。红色圆圈为电穿孔指示标志。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理波形分析，显示图形和数据图中随时间变化的电压变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig10.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 10"> 
图 10：数据分割与分析。 对每个波形检测其峰值（红色“x”）和谷值（黄色圆圈），并将归一化后的动作电位叠加，以对波形进行质量检查。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的动作电位膜电位图；电生理实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig11.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图11"> 
图11：同一细胞位点多次记录中动作电位（AP）幅度对场电位（FP）信号的依赖性。 从两个独立电极记录的场电位（FP）幅度，分别以 µV 范围（A，左上图）或 mV 范围（A，右上图）显示，对应的动作电位（AP）幅度以 mV 范围呈现（A，左下和右下图），结果显示 FP 幅度与电穿孔后 AP 幅度之间无相关性。每次记录的标准化 AP 波形如图所示进行叠加。在 0 至 96 小时内对同一细胞位点进行多次电穿孔，均获得高质量的 AP 波形，可用于追踪膜电动力学变化（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心电图多通道数据分析，以网格图表布局显示重复波形。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig12.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图12"> 
图12：六次恢复后动作电位记录。 显示在同一孔中通过12个电极同步记录的电穿孔后10秒的动作电位波形。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同恢复方法下动作电位时程和缩短分数分析的电生理学直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig13.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 13"> 
图13：来自多次恢复的APD参数直方图。 展示了单个波形的APD30 (A)、APD80 (B)、三角化（APD80—APD30）(C) 和缩短分数（(APD80—APD30)/(APD80)）(D) 的分布图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件。视频 1-3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/Suppl_Files.zip">请点击此处下载该文件。</a>

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。

心脏安全性筛选对于药物发现和治疗至关重要。因此，新型高通量……的开发具有重要意义。

以下方案描述了在多孔MEA板上建立人源诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞网络，并可逆地电穿孔细胞膜以进行动作电位测量。随后可利用动作电位参数生成对测试化合物的反应曲线，用于电生理学研究。多孔MEA的编码与细胞接种是最具挑战性的步骤，需特别注意。必须认真且迅速地执行这些步骤，以防止液滴扩散和干燥。通过练习，这一问题可轻易克服。我们开发了一个自定义的图形用户界面，用于单个分割、质量控制和参数提取。我们采用了一套稳健的 MATLAB 工作流程，可快速将大量原始实验数据归约为无偏倚的动作电位波形分组。首先，根据论文中的说明解冻人诱导多能干细胞来源的心肌细胞。使用移液管轻轻悬浮细胞，以解离细胞团块。然后，将两毫升细胞悬液小心地加入已包被基质的六孔板的每个孔中，并将该板置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养孵育箱中。细胞应在24小时内贴附于凝胶条带上，并在接种后48小时开始自发搏动。接种前两天，向24孔多电极阵列（MEA板）的每孔中加入0.5毫升人iPSC心肌细胞培养基，并进行基线记录，以验证信噪比，作为MEA质量检测的质控步骤。然后，吸除培养基，用无菌水冲洗各孔，并在超净工作台中通过紫外光照射过夜灭菌。次日，向每个孔中加入 0.1 毫升胎牛血清（FBS），以对 MEA 表面进行亲水处理，并将培养板在室温下孵育 30 分钟。随后吸除 FBS，并用 0.5 毫升无菌水冲洗每个孔两次。将培养板置于超净工作台中过夜晾干。次日，用移液器吸取5 µL工作浓度的纤连蛋白稀释液，小心地将液滴加至每个孔的中央，确保覆盖全部12个电极。立即将培养板放置于加湿孵育盒内的抬高表面上，盒中加入足量无菌水以维持整个培养皿表面的湿度。将培养板放入细胞培养孵育箱中孵育三小时，然后进行细胞接种。当准备接种心肌细胞时，用人体iPSC心肌细胞复苏培养基将细胞密度调整至每微升6,000个细胞。轻轻弹动管身以防止细胞沉降。将MEA板放入超净工作台中，用P10移液器小心吸除纤连蛋白液滴，注意不要触碰电极。立即在孔中央加入5 µL细胞悬液，确保覆盖全部12个电极。每次处理一个孔，以防止纤连蛋白干燥。完成铺板后，将MEA板放回松散盖好的保湿培养盒中，并置于细胞培养箱内孵育3小时。孵育结束后，使用P200移液器小心地向每孔加入200 µL人iPSC心肌细胞复苏培养基，避免扰动细胞。将MEA板重新放回细胞培养箱中，并在铺板后24小时更换培养基。当准备采集心肌细胞信号时，启动采集软件，并根据说明书指示插入MEA板。点击“Explore”按钮以查看所有孔中的信号，并在稳态条件下验证信号质量。记录下场电位（FP）信号在毫伏范围内的电极情况。然后点击同一按钮以停止探索。至此尚未记录任何数据。点击“开始”按钮以开始记录。每个孔中的电极将在原始数据窗口中显示场电位信号。记录30秒后，点击“刺激”按钮，对选定位置进行30秒的电穿孔。然后再次点击同一按钮以停止刺激，并继续记录60秒。使用基于 MATLAB 的自定义软件对场电位和动作电位数据进行分割并提取各种参数。首先，运行波形分析代码，点击“文件”（File），选择“处理.h5”（Process.h5）。查找并选择先前创建的 mwd 文件。h5 文件。单击“保存目录”按钮以更改输出文件的存储位置。然后通过选择感兴趣的电极和孔组合，再单击“队列”按钮，创建信号处理队列。重复此步骤，以向队列中添加更多的电极和孔板组合。如果细胞经过药物处理，可通过直接点击药物名称（Med Name）和药物浓度（Med Concentration）来编辑队列。队列确定后，点击“初始化波形”（Initialize Waveforms）按钮，系统将开始初步处理，识别并提取信号以进行分割。处理完成后，点击“放大”按钮，选择动作电位（AP）的目标区域。点击“保留”按钮，并查看面板。系统将检测每个波形的波峰和波谷，并将归一化的动作电位叠加显示。完成后，单击“Keep”按钮进入队列中的下一个信号记录，并对剩余的电极与孔组合信号重复此过程。解冻后心肌细胞的存活率和铺板密度对于多孔MEA培养至关重要。适当的铺板可使细胞在48小时后形成具有自发搏动的健康单层培养，而细胞存活率较差则会导致培养物中非心肌细胞比例较高。细胞液滴分散会影响培养密度，甚至可能导致细胞死亡，因此精确的细胞定位至关重要。接种后48小时，对MEA上培养的细胞进行电活性质量检测。若网络内50%的电极以及总网络数70%的电极未产生场电位（FP）信号，则表明培养状态不理想。通过电穿孔介导的动作电位记录可在MEA铺板后48小时多次获得。在同一细胞位点于0、24、48、72和96小时进行多次电穿孔，对动作电位的波形随时间的变化无显著影响。此外，同一细胞位点的场电位（FP）与电穿孔后动作电位的幅度之间未观察到相关性。该方法的一个显著优势是多孔MEA板可多次重复使用。为验证此阵列的可靠性，从三个恢复批次中提取了3,815个动作电位波形，并提取动作电位持续时间数据以检验结果的可重复性。在有需要时，还可进行其他检测，例如基因表达分析、钙瞬变测量和膜片钳实验，以研究特定离子电流的行为。该技术为研究人员提供了增强心肌细胞电生理成熟性以及筛选慢性剂量效应的新途径。

human-ipsc-derived-cardiomyocyte-networks-on-multiwell-micro

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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