体外实验研究肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用

肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中有重要作用。了解肿瘤细胞中不同基因突变如何影响巨噬细胞的募集，对于为癌症患者设计个体化治疗方案至关重要。该实验提供了一种简便且可靠的方法，用于在体外评估肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用。

该实验可进行修改，以体外评估肿瘤细胞与其他免疫细胞之间的相互作用。开始此操作前，将无血清干细胞培养基置于37摄氏度水浴中温育20分钟。用70%乙醇喷洒组织培养超净台表面，并用纸巾擦拭已喷洒区域。

接着用70%乙醇喷洒培养基和细胞解离液的瓶子，并用纸巾擦拭干净。将已消毒的瓶子转移至组织培养罩内。取出肿瘤细胞，并将其转移至组织培养罩内。

吸弃培养基，并用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。然后向培养瓶中加入 2 毫升细胞解离液。将培养瓶置于生物安全柜中，每隔 1 分钟检查一次，观察肿瘤细胞是否已变圆。

当肿瘤细胞变圆后，轻轻敲击培养瓶侧面以帮助细胞脱落。随后，向培养瓶中加入8 mL无血清细胞培养基，轻轻吹打3次以混匀。将该细胞悬液转移至15 mL离心管中，在4°C条件下以200 × g离心5分钟。

吸去上清液。然后用10毫升PBS重悬细胞，确保上下吹打三至五次以充分混匀。在4°C条件下，以200 × g离心5分钟。

吸去上清液，将细胞重悬于10毫升无血清培养基中。上下吹打3至5次以混匀。取10微升该细胞悬液与10微升台盼蓝溶液混合。

将10微升台盼蓝与细胞混合液用移液器加入计数板中，使用自动细胞计数仪定量活细胞数量。用无血清细胞培养基将细胞密度调整至每毫升2.5 × 10⁵个细胞。随后将2毫升细胞悬液接种至6孔培养板的每个孔中。

同时，准备六个仅含两毫升无血清干细胞培养基的孔。随后，将六孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。首先，用70%乙醇喷洒组织培养罩表面，并用纸巾擦拭已喷洒的表面。

接着用70%乙醇喷洒培养基和细胞解离液的瓶子，并用纸巾擦拭干净。将已消毒的瓶子转移至组织培养罩内。随后，从培养箱中取出六孔板。

小心地将条件培养基用移液器转移至15毫升无菌离心管中，并将离心管置于冰上。向六孔板的每孔中加入0.5毫升细胞解离溶液，每隔一分钟检查一次肿瘤细胞是否已变圆。一旦肿瘤细胞变圆，轻轻敲击培养板侧面以帮助细胞脱落。

接下来，用移液器将2.5毫升肿瘤细胞维持培养基加入孔中，并上下吹打三次以混匀。将细胞转移至15毫升无菌离心管中。取10微升细胞与10微升台盼蓝溶液混合，再将10微升该混合液转移至计数载玻片中。

使用自动细胞计数仪定量活细胞数量，并使用在37摄氏度孵育过夜的无血清干细胞培养基，根据细胞数量调整条件培养基的体积。通过0.45微米滤器过滤条件培养基，并将条件培养基置于冰上。首先，将IMDM培养基在37摄氏度水浴中预热20分钟。

用70%乙醇清洁组织培养罩，并如前所述清洁培养基瓶，然后将其移入罩内。接着将MV-4-11细胞培养瓶转移至培养罩中。用移液器将10毫升细胞悬液转移至15毫升离心管中。

使用台盼蓝和自动细胞计数仪定量活细胞数量，方法如前所述。随后在4°C条件下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，并用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。

再次在200 × g、4 °C条件下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于IMDM培养基中，最终细胞密度为每毫升100万个细胞。首先将所需材料恢复至室温。

向每个小室中加入250微升制备好的MV-4-11细胞。随后，向24孔板的下室中加入400微升的条件培养基或仅培养基，确保每个样本设置三个重复。在37°C、5%二氧化碳条件下孵育4小时。

然后轻轻将插入物在同一个孔的内壁上轻触几下，随后弃去插入物。轻柔地将孔中的细胞吹打混匀3次。将225微升该细胞悬液转移至适用于荧光检测的黑色壁96孔板的孔中。

此后，将CyQUANT染料与4倍裂解缓冲液按1:75的比例稀释。短暂涡旋振荡后离心溶液。将75微升该溶液转移至96孔板的每个孔中，在室温下孵育15分钟。

使用荧光酶标仪读取荧光信号，并按照文本方案中所述分析数据。在本研究中，采用体外实验来研究肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用。荧光值较高的样本表明，条件培养基具有较强的巨噬细胞趋化能力。

根据实验需求，可包含其他对照。例如，可使用中和抗体处理条件培养基以消除巨噬细胞的趋化作用，并以相同方式操作。也可向条件培养基中添加额外的趋化因子，作为阳性对照。

对于该检测，控制细胞数量差异非常重要，因为不同类型的细胞可能具有不同的生长速度。体外实验结果的体内验证至关重要。可以通过将肿瘤细胞注射到小鼠体内，并利用流式细胞术、免疫染色和质谱流式细胞术（CyTOF）对肿瘤进行分析，以验证实验结果。