一种基于小鼠细胞系的慢性CDK9抑制模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录延伸缺陷（TE^deff）

鉴于TEdeff型癌症是免疫治疗面临的重要障碍，我们的药理学模型具有显著优势，因为它能够恰当地模拟此类癌症中广泛存在的转录和表观遗传缺陷，从而有助于研究这些非遗传性异常，以获得新的认知、发现现有药物的新用途，或开发针对此类癌症的新策略。该模型易于建立且具有普适性，可用于研究癌症中的转录延伸缺陷，支持在体外和体内开展肿瘤-免疫相互作用的研究。该方法也可应用于人类癌细胞系。

我们已在T47D和CAL51细胞系中进行了短期测试，结果均呈现出类似的TEdeff样特征。本文所述方案为慢性抑制CDK9以产生TEdeff样特征的关键已知变量提供了基本的优化框架。然而，对于其他小鼠细胞系，必须谨慎优化黄酮吡咯（flavopiridol）的确切亚致死剂量。

细胞接种密度、培养条件以及细胞因子刺激条件的差异对不同小鼠细胞系的影响可能有所不同。首先，使用寡核苷酸dT磁珠从之前已去除核糖体RNA的样品中的一半提取polyA阳性RNA。将磁珠在小瓶中涡旋振荡30秒以重悬，然后将200 µL磁珠转移至一个离心管中。

加入等体积的结合缓冲液，并混匀管内物质。将管子置于磁力架上静置一分钟，弃去上清液。随后将管子从磁力架上取下，用100 µL结合缓冲液重悬洗涤后的磁珠。

用 pH 7.5 的 10 毫摩尔 Tris-HCl 将核糖体 RNA 耗尽的样品体积调至 100 微升。向样品中加入 100 微升结合缓冲液。将混合物在 65 摄氏度加热 2 分钟以破坏 RNA 的二级结构，然后立即置于冰上。

将200微升总RNA加入100微升洗涤后的磁珠中，在旋转仪上充分混匀5分钟。将离心管置于磁力架上1至2分钟，小心移除全部上清液，然后将离心管从磁力架上取下，加入200微升洗涤缓冲液。用移液器轻轻吹打数次以充分混匀样品，再将离心管放回磁力架静置1分钟，随后移除上清液。

然后，使用分光光度计测定分离得到的磁珠结合mRNA的纯度和浓度。将剩余一半的核糖体RNA耗竭样本作为输入，加入蛋白A柱中，利用单克隆7-甲基鸟苷抗体免疫沉淀5'端加帽的RNA。根据试剂盒制造商的方案，用洗液缓冲液洗涤RIP试剂盒中的蛋白A磁珠，以将7-甲基鸟苷抗体预结合到悬浮于100微升洗液缓冲液中的磁珠上。

将混合物在室温下孵育30分钟，同时低速旋转。然后短暂离心试管，并将其置于磁力分离器上。移除并弃去上清液，随后将试管从磁力分离器上取下，用500 µL洗涤缓冲液重悬磁珠。

涡旋混匀各管，短暂离心后重新置于磁力架上，再次弃去上清液。随后，向抗体结合的磁珠中加入120纳克核糖体RNA去除后的RNA以及1微升RNase抑制剂，在室温下轻轻振荡孵育60至90分钟。孵育结束后，在300 × g条件下离心10秒，将含有未加帽mRNA的上清液转移至新的微量离心管中。

用 100 微升洗涤缓冲液再重复洗涤两次，并收集合并上清液。通过加入 300 微升根据文稿说明配制的尿素裂解缓冲液，并将混合物加热至 65 摄氏度持续 2 至 3 分钟，从磁珠上洗脱带帽的 mRNA。取 300 微升洗脱样品与 300 微升苯酚：氯仿：异戊醇混合，颠倒混匀，静置 10 分钟。

再次轻轻混匀样品，然后离心两分钟。小心吸取上层液体至新的离心管中，弃去下层液体。向样品中加入 300 µL 异丙醇和 30 µL 3 mol/L 醋酸钠溶液，轻轻颠倒数次，置于 -20 °C 环境中静置 20 小时。

孵育结束后，在4 °C条件下离心样品10分钟。小心弃去上清液，并在室温下干燥沉淀5分钟。将沉淀重悬于无核酸酶的水中，使用分光光度计测定RNA的纯度和浓度。

根据文稿说明分离CD8阳性细胞，然后将细胞重悬于商品化的磁分离系统缓冲液中。每1毫升细胞加入100微升抗体混合液，在冰上孵育细胞15分钟。然后，每100微升抗体混合液加入100微升磁珠，继续将细胞置于冰上孵育15分钟。

孵育后，向细胞中加入 7 mL 磁性分离缓冲液，分装 3 至 4 mL 至新的离心管中，并将离心管置于磁力架上静置 5 分钟。将含有 CD8 阳性细胞的上清液倾入置于冰上的新离心管中。然后，将剩余的 3 至 4 mL 细胞加入磁珠中，再将离心管置于磁力架上静置 5 分钟。

将第二批CD8阳性细胞倒入装有第一批细胞的试管中。将携带共刺激分子的经基因工程改造的贴壁成纤维细胞SAMBOK细胞以每孔75,000个细胞的密度接种于24孔板中，并在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养。24小时后，用Iscove改良Dulbecco培养基洗涤抗原呈递细胞单层一次，并在根据文稿说明添加补充成分的2毫升培养基中加入0.5 × 10⁶个初始细胞。

将细胞培养20小时，然后通过收集培养基，以191 × g离心2分钟，轻柔地收获非贴壁的OT-I细胞。计数细胞，并以1:1的比例将细胞接种，与B16/F10、未经处理的B16/F10-OVA以及经flavopiridol预处理的B16/F10-OVA细胞进行共培养。在37°C、5% CO₂的湿化培养箱中培养20小时，随后去除OT-I CD8阳性细胞，并用PBS洗涤贴壁的B16/F10-OVA细胞。

用含0.5% EDTA的胰蛋白酶消化三组贴壁细胞，持续5分钟，然后以191 × g离心5分钟收集细胞。将收获的B16/F10-OVA细胞在冷PBS中与活率染料及相应的标记抗体孵育，随后通过流式细胞术分析细胞活力。该方案已用于建立转录延伸缺陷细胞模型，该模型显示出RNA聚合酶II羧基末端重复结构域丝氨酸2位点的磷酸化显著丧失，以及H3K36me3水平明显下降，而H3K36me3参与外显子边界界定并抑制失控的隐蔽转录。

随着异常加帽和非多聚腺苷酸化mRNA比例的增加，细胞表现出关键的mRNA加工缺陷。此外，在该细胞模型中可观察到关键炎症反应通路基因的特异性抑制以及FasL介导的细胞死亡。一项探索性检测表明，该细胞模型对细胞毒性T细胞攻击具有抵抗能力，提示慢性氟哌啶醇诱导的转录延伸缺陷可能赋予细胞逃避免疫系统抗肿瘤攻击的能力。

经黄酮吡咯烷（flavopiridol）处理的、稳定过表达OVA基因的B16/F10细胞对CD8阳性细胞毒性T细胞不敏感，而CD8阳性细胞毒性T细胞通常对表达OVA的细胞具有选择性杀伤作用。未经黄酮吡咯烷预处理的细胞则发生显著的细胞死亡，而不表达OVA抗原的亲本B16/F10细胞则存活。需要特别注意的是，在25纳摩尔黄酮吡咯烷处理下，磷酸化丝氨酸2和H3K36三甲基化水平的降低，并不能保证磷酸化STAT1和磷酸化NF-κB水平同时降低。

每种小鼠癌细胞系均具有独特性，而JAK1和CCNT1可能挽救黄酮吡咯的效应。此外，该模型可用于体内监测TEdeff癌症对固有免疫和适应性抗肿瘤免疫应答所产生的耐药性。例如，可使用抗去唾液酸基（anti-asialo）处理来调控NK细胞的活性，并可对携带TEdeff肿瘤的小鼠施用免疫检查点治疗。

肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的数量是免疫治疗成功与否的指标。我们的模型为我们探索TEdeff肿瘤微环境中TIL的活化与耗竭程度——包括免疫治疗前和治疗后——铺平了道路。