Name: 慢性CDK9抑制的基于小鼠细胞系的模型，研究癌症中普遍存在的非遗传转录伸长缺陷（TE肯定） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 了解慢性CDK9抑制建立小鼠癌细胞系模型，用于研究转录延伸缺陷及其对肿瘤免疫逃逸的影响。该方法可应用于人类癌细胞系，为开发新型癌症治疗策略提供重要研究工具。

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本工作部分得到了美国国家癌症研究所（NCI，项目号CA193549）和辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）研究创新试点奖对Kakajan Komurov的资助，以及美国国防部（项目号BC150484）对Navneet Singh的资助。本内容完全由作者负责，不代表美国国家癌症研究所或美国国防部的官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

辛辛那提儿童研究基金会的机构动物护理和使用委员会以及机构生物安全委员会已批准所有动物实验程序（IACUC方案编号#2017-0061和IBC方案编号#IBC2016-0016），这些实验均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》中所述标准进行。
1. 通过flavopiridol处理对RNA聚合酶II进行慢性抑制——基本策略
<ol>
	<li>在10 cm培养皿中，用相应的培养基（Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]、10%胎牛血清[FBS]、1%青霉素-链霉素[Pen/Strep]），以低密度（0.2 × 106）接种B16/F10小鼠黑色素瘤细胞，并在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入含亚致死剂量（估计为25&#8201;nM）flavopiridol的新鲜培养基——该药物为RNA聚合酶II延伸因子p-TEFb（cyclin T/CDK9）的抑制剂——持续处理一周，期间不再进行传代培养。</li>
	<li>经一周flavopiridol处理后，进行验证性检测，以评估该模型是否能够重现TEdeff癌症中所见的多种转录延伸缺陷特征。</li>
</ol>
2. 确认性免疫印迹实验，用于评估所构建的小鼠TEdeff模型中RNA聚合酶II功能缺陷以及干扰素（IFN）通路和肿瘤坏死因子（TNF）通路信号传导的受损情况
<ol>
	<li>在两组不同的12孔板中（一组用于RNA聚合酶II功能表征，另一组用于细胞因子刺激实验），分别接种等量（105）的经flavopiridol处理的B16/F10小鼠黑色素瘤细胞和亲本B16/F10小鼠黑色素瘤细胞，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养过夜。</li>
	<li>次日，对细胞因子刺激组的细胞分别加入小鼠IFN-γ、IFN-α（5&#8201;ng/mL）或TNF-α（5&#8201;ng/mL），在37 °C下处理45&#8201;分钟。</li>
	<li>随后，采用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液，按以下步骤从细胞因子刺激组和RNA聚合酶II功能表征组的细胞中提取蛋白：
	<ol>
		<li>用1× PBS洗涤细胞，每孔加入50 µL裂解缓冲液进行裂解。刮取细胞后，在4 °C、21,130 × g条件下离心收集裂解物。</li>
		<li>使用标准比色法测定经去垢剂溶解后的细胞裂解液上清中蛋白浓度（如Bradford法或类似方法）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将各样品中测定得到的等量蛋白（15 µg）上样，于4%−18%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水-吐温20（TBST）溶液封闭PVDF膜1&#8201;小时，随后在4 °C下与一抗（RNA Pol II 1:1000；p-SER2 RNA Pol II 1:1000；p-SER5 RNA Pol II 1:1000；H3K36me3 1:2000；总H3 1:2000；STAT1 1:1000；p-STAT1 1:1000；NFκB 1:1000；p-NFκB 1:1000；β-Actin 1:5000）在5%牛血清白蛋白溶液中孵育过夜。</li>
	<li>次日，将PVDF膜在室温下用1× TBST洗涤15分钟，然后在室温下与相应的二抗（RNA Pol II、p-SER2 RNA Pol II和p-SER5 RNA Pol II使用抗大鼠抗体[1:5000]；H3K36me3、总H3、STAT1、p-STAT1、NFκB和p-NFκB使用抗兔抗体[1:5000]）孵育50分钟。使用市售的辣根过氧化物酶（HRP）增强化学发光底物检测蛋白信号。 
	注：所用β-Actin一抗为HRP偶联抗体，因此无需二抗即可显色。</li>
</ol>
3. 在构建的小鼠 TEdeff 模型中评估 mRNA 加工缺陷的确认性检测
<ol>
	<li>接种相同数量的细胞（0.2 × 10⁶）6) 在37 °C、5% CO₂条件下，将经flavopiridol处理的B16/F10小鼠黑色素瘤细胞与亲本B16/F10小鼠黑色素瘤细胞接种于6孔板中2 加湿培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>从60%汇合度的培养细胞中提取总RNA，使用RNA提取试剂或试剂盒（材料表).</li>
	<li>以下列方式从提取的总RNA中去除rRNA： 
	注意：采用一种商业试剂盒的低起始量建库方案进行核糖体RNA（rRNA）去除
	<ol>
		<li>将一个水浴锅或加热块设定为 70−75 °C，另一个水浴锅或加热块设定为 37 °C。</li>
		<li>将总RNA（100−500 ng，溶于2 µL无核酸酶水中）与1 µL特异性rRNA去除探针及30 µL杂交缓冲液加入微量离心管中，轻轻涡旋混匀，于70−75 °C孵育5 min。</li>
		<li>现在，将试管转移至37 °C水浴或加热块中，让样品在30分钟内冷却至37 °C。</li>
		<li>通过涡旋振荡重悬选择性rRNA去除探针磁珠，并将75 µL磁珠分装至1.5 mL无RNase的微量离心管中。</li>
		<li>将珠子悬浮液置于磁力架上静置1分钟，待珠子完全沉降后，轻轻吸除并弃去上清液。加入75 µL无核酸酶水，通过磁力分离再次洗涤珠子一次，随后弃去上清液。</li>
		<li>将洗涤后的磁珠重悬于75 µL杂交缓冲液中，取25 µL分装至另一管，于37 °C保存以备后续使用。</li>
		<li>将剩余的50 µL磁珠置于磁力架上1分钟，弃去上清液。用20 µL杂交缓冲液重悬磁珠，于37 °C保存备用。</li>
		<li>将RNA/选择性rRNA去除探针混合物在37 °C孵育30分钟后冷却，短暂离心管子，使样品沉降至管底。</li>
		<li>将33 µL RNA/选择性rRNA去除探针混合液转移至步骤3.3.7中制备好的磁珠中。用低速涡旋振荡混匀。</li>
		<li>将离心管在 37 °C 下孵育 15 分钟。孵育期间，偶尔轻轻混匀管内物质。随后短暂离心，使样品沉降至管底。</li>
		<li>将试管置于磁力架上1分钟，使rRNA-探针复合物沉淀。此次不要弃去上清液，上清液中含有rRNA耗竭的RNA。</li>
		<li>将3.3.6步骤中含25 μL磁珠的离心管置于磁力分离器上1分钟。吸除并弃去上清液。将3.3.11步骤中获得的上清液加入新的磁珠离心管中，低速涡旋混匀。</li>
		<li>在37 °C下孵育试管15分钟。孵育期间，偶尔轻轻混匀管内物质。短暂离心试管，使样品沉降至管底。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上1分钟，使rRNA-探针复合物沉淀。不要弃去上清液。将含有rRNA耗竭RNA的上清液（约53 μL）转移至新的离心管中。</li>
		<li>使用分光光度计测定RNA得率的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一半的rRNA耗竭样品用作输入，加入含寡聚(dT)25的磁珠以富集polyA+&#8201;RNA 以如下方式： 
	注意：本实验方案中利用结合于磁珠表面的寡聚dT序列分离带多聚A尾信使RNA的方法，源自一种 commercially available kit（市售试剂盒）。材料表).
	<ol>
		<li>通过短暂涡旋振荡重新悬浮小瓶中的寡聚dT磁珠 &#62;30秒后，转移200 µL的寡聚dT磁珠至一离心管中。加入等体积（200 µL）的结合缓冲液，重悬磁珠。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上1分钟，弃去上清液。随后将离心管从磁力架上取下，用100 µL结合缓冲液重悬洗涤后的寡聚dT磁珠。</li>
		<li>用 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）将 rRNA 耗尽的总 RNA 样品体积调至 100 μL。随后加入 100 μL 结合缓冲液。</li>
		<li>65 °C 加热 2 分钟以破坏RNA二级结构。随后立即置于冰上。</li>
		<li>将200 μL总RNA加入100 μL洗涤后的磁珠中，充分混匀，并在室温下于旋转仪上持续旋转5分钟，使RNA与磁珠充分结合。</li>
		<li>将试管置于磁架上1-2分钟，小心吸除所有上清液，并彻底去除全部上清液。</li>
		<li>从磁铁上取下离心管，加入 200 μL 洗涤缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定提取的polyA的纯度和浓度+ 使用分光光度计测定RNA。 
	注意：所有RNA样本的A260/280比值在1.90−2.00之间，A260/230比值在2.00−2.20之间视为合格。</li>
	<li>使用第3.3节中剩余的另一半rRNA耗竭样品作为蛋白A柱（RNA免疫沉淀[RIP]试剂盒中提供）的输入样品， 材料表）使用单克隆7-甲基鸟苷抗体通过以下方法免疫沉淀5'端加帽的RNA： 
	注意：本实验方案采用 commercially available 的 RNA 免疫沉淀试剂盒分离 m7G 加帽的信使 RNA，已对此进行了借鉴并进一步改良。
	<ol>
		<li>根据RIP试剂盒制造商的说明书洗涤蛋白A磁珠，以将抗体预先结合到磁珠上。</li>
		<li>将3 µg的7-甲基鸟苷酸抗体（可使用试剂盒中提供的兔IgG作为阴性对照）转移至含有100 µL试剂盒洗涤缓冲液的微量离心管中的珠粒悬浮液中。</li>
		<li>室温下低速旋转孵育30分钟。短暂离心后，将试管置于磁力分离器上，移除并弃去上清液。</li>
		<li>取出离心管，加入500 µL试剂盒中的洗涤缓冲液，短暂涡旋振荡。短暂离心后再次进行磁性分离，移除并弃去上清液。</li>
		<li>再次重复步骤 3.6.4。</li>
		<li>将约 120 ng 的 rRNA 耗竭样本（来自步骤 3.3）加入预先洗涤的 7-甲基鸟苷抗体结合磁珠中。加入 1 µL RNase 抑制剂。室温下轻度振荡孵育 1–1.5 小时。</li>
		<li>以 300 x 转速离心磁珠 g 10秒后，将含有未加帽（非7-甲基鸟苷）mRNA的上清液转移至新的微量离心管中。</li>
		<li>加入100 µL洗涤缓冲液，以相同方式再洗涤两次。将收集的上清液合并至同一管已标记为未加帽（非7-甲基鸟苷）mRNA的微量离心管中。置于冰上保存。</li>
		<li>用含有7 M尿素、2% SDS、0.35 M NaCl、10 mM EDTA和10 mM Tris（pH 7.5）的300 µL尿素裂解缓冲液（ULB），在65 °C加热2−3分钟，从磁珠中洗脱带有帽子结构（7-甲基鸟苷）的mRNA。</li>
		<li>将300 µL洗脱样品（带帽和去帽的mRNA）与300 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1；市售）（4 °C保存）混合。颠倒充分混匀，静置约10分钟，然后再次轻轻混匀。</li>
		<li>在 18,928 x g 下离心 g 2 分钟后，小心地将上层液体用移液器转移至新离心管中，弃去下层液体。</li>
		<li>加入 300 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1；4 °C 保存）至样品中。颠倒充分混匀，然后在 18,928 x g 1 分钟后，小心地将上层液体用移液器转移至新离心管中，弃去下层液体。</li>
		<li>向已盖盖和未盖盖的 RNA 中加入 300 µL 异丙醇和 30 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）。轻轻颠倒混匀数次，置于 -20 °C 下 20 小时。</li>
		<li>现在，将样品在18,928 x g 4 °C下离心10分钟。小心弃去上清液，加入500 µL 70%乙醇。</li>
		<li>再次以 18,928 x g 4 °C下离心10分钟。小心弃去上清液，在室温下干燥沉淀物不超过5分钟。将沉淀物重悬于无核酸酶的水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分光光度计测定RNA得率的纯度和浓度。所有RNA样品的260/280比值应在1.90−2.00范围内，260/230比值应在2.00−2.20范围内。</li>
</ol>
4. 验证性实验以评估小鼠TEdeff模型对FasL介导的细胞死亡的反应
<ol>
	<li>在96孔培养板中，分别将经flavopiridol处理的B16/F10小鼠黑色素瘤细胞和亲本B16/F10小鼠黑色素瘤细胞以相同数量（30,000个细胞）接种于相应的培养基（DMEM）中，并在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>在培养罩中用不同浓度的hhis6FasL（0.1−1000&#8201;ng/mL）处理细胞，同时加入10 μg/mL抗His抗体，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育24&#8201;h。</li>
	<li>用1× PBS缓冲液洗涤以去除死细胞。在室温下用4%多聚甲醛固定贴壁细胞20分钟。弃去4%多聚甲醛溶液（无需洗涤），然后加入结晶紫染色液（含20%甲醇、0.5%结晶紫的1× PBS溶液）染色30&#8201;分钟。</li>
	<li>用自来水轻轻冲洗培养板以去除多余的染料。将培养板置于室温下干燥。</li>
	<li>将结晶紫溶解于100 µL含非离子型表面活性剂的1× PBS溶液中，使用酶标仪在570&#8201;nm处测定吸光度，以评估细胞密度。</li>
</ol>
5. 探索性实验以评估小鼠TEdeff模型对特异性抗原细胞毒性T细胞攻击的反应
<ol>
	<li>OT-I CD8+ 细胞毒性T细胞（CTL）的分离与激活
	<ol>
		<li>使用小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒，通过磁性细胞分选法从OT-I TCR Tg RAG-1−/−小鼠的脾脏中纯化CD8+细胞，步骤如下：
		<ol>
			<li>在完全RPMI培养基中收获两只OT-I TCR Tg RAG-1−/−小鼠的脾脏。</li>
			<li>使用注射器的推杆将脾脏在置于装有20 mL RPMI的50 mL离心管上的70 µm滤膜上研磨，直至滤膜上仅剩脂肪组织。</li>
			<li>以 220 x g 离心流穿液 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
			<li>向上一步离心得到的脾脏沉淀物中加入1 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液，吹打混合1分钟。</li>
			<li>通过加入最多10 mL RPMI中和溶液。</li>
			<li>以 220 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，加入10 mL RPMI重悬。</li>
			<li>取少量等分试样进行计数。将剩余样品在220 x g下离心 g 4 °C下离心5分钟。</li>
			<li>每计数一百万个细胞，将细胞沉淀重悬于1 mL市售磁分离系统缓冲液（Mojo缓冲液或类似缓冲液）中。</li>
			<li>在步骤5.1.1.8中，每1 mL细胞沉淀物配制100 µL抗体混合液。该抗体混合液包含：biotin anti-CD4、CD105、CD45R/B220、CD11c、CD49b、TER-119、CD19、CD11b、TCR γ/δ 和 CD44。</li>
			<li>将该混合液加入1 mL已离心的细胞沉淀中，冰上孵育15分钟。</li>
			<li>向每100 µL抗体混合物中加入100 µL磁珠（链霉亲和素），并将该混合物加入1 mL重悬的脾细胞沉淀中。冰上孵育15分钟。</li>
			<li>加入7 mL市售磁分离系统缓冲液。将约3−4 mL混合液分装至新的离心管中。充分混匀后，置于磁力架上静置5分钟。</li>
			<li>将液体（含CD8+细胞）倾倒入置于冰上的新离心管中。随后，将步骤5.1.1.12中剩余的3−4 mL混合液分装至该管中，并置于磁架上静置5分钟。将上清液（第二次分离的CD8+细胞）倾倒入另一管中，与置于冰上保存的首批CD8+细胞合并。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>种子工程化贴壁成纤维细胞抗原呈递细胞&#173;在24孔板中，每孔接种75,000个(MEC.B7.SigOVA)细胞，于37 °C、5% CO₂条件下培养，使其表达特定的卵清蛋白（OVA）来源的、H-2Kb限制性肽段表位OVA257-264（SIINFEKL）以及共刺激分子B7.12 湿润培养箱 
		注意：所使用的贴壁成纤维细胞由辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC）Edith Janssen 博士实验室惠赠。该细胞系最初由拉霍亚过敏与免疫学研究所 Stephen P. Schoenberger 博士实验室建立。6.</li>
		<li>24 小时后&#8201;h，用市售含HEPES缓冲液、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和高浓度葡萄糖的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）洗涤APC单层细胞一次，并加入0.5&#8201;x&#8201;106 幼稚型 OT-I CD8+ 细胞（来自步骤 5.1.1.13）在 2&#8201;mL 的 IMDM，添加 50&#8201;mM β-ME，2&#8201;mL EDTA，4&#8201;mM L-谷氨酰胺和HEPES，以及10% FBS。</li>
		<li>20分钟后&#8201;h，轻柔收集非贴壁的OT-I细胞（通过收集培养皿中含有悬浮OT-I细胞的培养基，并在191 × g 2 分钟；计数存活的 OT-I 细胞，并将其转移至共培养体系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CD8+ 细胞与 B16/F10-OVA 细胞的共培养
	<ol>
		<li>以1:1的比例（每种细胞各300,000个）将OT-I来源的CD8+细胞与B16/F10细胞（缺乏卵清蛋白抗原）、未经处理的B16/F10-OVA细胞以及经flavopiridol（25 nM）预处理1周的B16/F10-OVA细胞共同培养，置于6孔板中，使用完全DMEM培养基培养20小时&#8201;h，于37 °C、5% CO₂条件下培养2 湿润培养箱</li>
		<li>20小时后，收集培养皿中的培养基以去除OT-I来源的CD8+细胞（含悬浮的OT-I来源CD8+细胞）。用1×PBS洗涤贴壁的B16/F10-OVA细胞。</li>
		<li>用含0.05% EDTA的胰蛋白酶消化三组贴壁的B16/F10-OVA细胞，持续5分钟。在191 x g条件下离心收集消化后的细胞。 g 5 分钟。</li>
		<li>将收获的B16/F10-OVA细胞在冷PBS（含0.5% FBS和0.05%叠氮化钠）中与活力染料及相应的标记抗体（可固定活力染料e780、AF647标记的小鼠CD8抗体和BV421标记的小鼠CD45抗体）共同孵育，进行染色。</li>
		<li>通过流式细胞术分析三组B16/F10-OVA细胞的存活率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+modifies+the+activity+of+CDK9+to+phosphorylate+serine+5+of+the+RNA+polymerase+II+carboxyl-terminal+domain+during+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).</li>
<li>Palancade, B., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+RNA+polymerase+II+carboxyl%E2%80%90terminal+domain+%28CTD%29+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

RNA Pol II 延伸调控已成为调节刺激响应性基因表达的关键机制，从而有利于恶性细胞的生存5,7,8。从启动子近端暂停状态进入延伸阶段并实现后续的 mRNA 生成，依赖于 P-TEFb 的激酶活性9,10,11。本模型采用黄酮吡咯（flavopiridol，25 nM）——一种对关键的周期蛋白依赖性激酶 CDK9 具有抑制作用的化合物——来模拟 TEdeff 癌症中 Pol II 延伸过程中所观察到的缺陷；该表型此前由本研究团队首次发现3。
CDK9激酶活性长期以来被认为对Pol II大亚基CTD上丝氨酸2位点的磷酸化至关重要。关键的是，我...

几乎所有活性基因表达中的一个关键限速步骤是RNA聚合酶II（RNA Pol II）从启动子近端暂停转变为 productive 延伸1,2。鉴于转录延伸的表观遗传失调在多种被定义为TEdeff的人类恶性肿瘤进展中起促进作用，导致促炎反应通路信号传导不足，从而对免疫治疗产生较差的响应和不良预后3，本方案的总体目标是建立一种有用的体外模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录异常。基于此，长期药理学抑制CDK9是一种有效的策略，可用于构建具有普适性的非遗传性广泛转录延伸障碍及mRNA加工缺陷模型。采用长期CDK9抑制的理论依据在于，其可阻断RNA Pol II羧基末端重复结构域（CTD）上丝氨酸2位点的磷酸化，从而抑制RNA Pol II进入 productive 转录延伸阶段。此外，我们课题组先前描述的TEdeff癌症3并未归类于任何特定的体细胞突变类型。因此，非遗传性（药理学）模型具有优势，能够最佳模拟这些癌症中观察到的广泛转录和表观遗传缺陷。本文详细阐述了小鼠癌细胞长期氟哌啶醇处理模型的建立与表征方法。该方法可显著干扰基因组长度较长、启动子处于待命状态且具有可诱导表达特征（如TNF/NF-κB和干扰素/STAT信号通路）的基因的转录延伸过程，而这些通路的调控主要发生在转录延伸水平3,4,5。总体而言，这一优化的小鼠细胞系转录延伸缺陷模型——据我们所知，是目前唯一可用于研究新近定义的TEdeff肿瘤的模型——可驱动肿瘤对免疫攻击的抵抗，为探索和分析癌症核心转录机制中非遗传性缺陷在免疫介导细胞杀伤背景下的脆弱性提供了有力工具。

<table><tbody><tr><td>hhis6FasL</td><td>Cell Signaling</td><td>5452</td><td></td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>20% 甲醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;ndash;18% SDS 聚丙烯酰胺凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>5% 脱脂奶粉</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>7-甲基鸟苷抗体</td><td>BioVision</td><td>6655-30T</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Cellstar</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AF647 标记的小鼠 CD8</td><td>Biolegend</td><td>100727</td><td></td></tr><tr><td>抗生素和抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>抗 His 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2366&amp;thinsp;P</td><td></td></tr><tr><td>抗兔</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td>稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>抗大鼠</td><td>Cell Signaling</td><td>7077S</td><td>稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>Bradford 蛋白定量试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>5000121</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ACROS Organics</td><td>24040-0100</td><td></td></tr><tr><td>BV421 标记的小鼠 CD45</td><td>Biolegend</td><td>109831</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Oligo (dT)25</td><td>Ambion</td><td>61002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>45015</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活/死细胞染色染料 e780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>黄酮吡咯</td><td>Selleckchem</td><td>S1230</td><td></td></tr><tr><td>H3k36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td>稀释比例 1:2000</td></tr><tr><td>IFN-&amp;alpha;</td><td>R&amp;D systems</td><td>12100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>R&amp;D systems</td><td>485-MI-100</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western 化学发光 HRP 底物</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>MojoSort 小鼠 CD8 T 细胞分离试剂盒</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td></td></tr><tr><td>NF-&amp;kappa;B</td><td>Cell Signaling</td><td>8242s</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>p-NF-&amp;kappa;B</td><td>Cell Signaling</td><td>3033s</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>p-Ser2-RNAPII</td><td>Active Motif</td><td>61083</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>p-Ser5-RNAPII</td><td>Active Motif</td><td>61085</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>p-STAT1</td><td>Cell Signaling</td><td>7649s</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>RiboMinu 真核生物试剂盒</td><td>Ambion</td><td>A10837-08</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>RNAPII</td><td>Active Motif</td><td>61667</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>STAT1</td><td>Cell Signaling</td><td>9175s</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>R&amp;D systems</td><td>410-MT-010</td><td></td></tr><tr><td>总 H3</td><td>Cell Signaling</td><td>4499</td><td>稀释比例 1:2000</td></tr><tr><td>Trizol 试剂</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>吐温</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AA Hoefer</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白</td><td>Cell Signaling</td><td>12620S</td><td>稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>G Biosciences</td><td>BC98</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于小鼠细胞系的慢性cdk9抑制模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录延伸缺陷（tedeff）

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

我们先前报道过，一部分癌症的特征是全局性转录失调，并伴有广泛的mRNA转录延伸（TE）缺陷——我们将此类癌症称为TEdeff值得注意的是，TEdeff 癌症的特征在于大量基因（如干扰素/JAK/STAT 和 TNF/NF-κB 信号通路相关基因）中出现异常转录和错误的 mRNA 加工，从而导致这些通路受到抑制。TEdeff 肾细胞癌和转移性黑色素瘤患者中肿瘤的亚型与免疫治疗的不良反应和预后显著相关. 鉴于研究转座元件（TE）的重要性deff 癌症——因其预示着免疫治疗面临重大障碍——本方案的目标是建立一种体外TEdeff 小鼠模型用于研究这些普遍存在的非遗传性转录异常在癌症中的作用，以获得新的见解、现有药物的新用途，或针对此类癌症找到新的治疗策略。我们详细描述了通过长期使用flavopiridol介导的CDK9抑制，阻断RNA聚合酶II（RNA Pol II）羧基末端重复结构域（CTD）上丝氨酸2残基的磷酸化，从而抑制RNA Pol II进入有效的转录延伸阶段。鉴于转录延伸（TE）deff 癌症并未根据特定的体细胞突变进行分类，因此采用药理学模型具有优势，能够最好地模拟在这些癌症中广泛存在的转录和表观遗传缺陷。使用优化的亚致死剂量的flavopiridol是目前唯一有效的策略，可建立一种可推广的非遗传性广泛转录延伸及mRNA加工缺陷模型，紧密模拟临床观察到的转录延伸（TE）缺陷deff 特征。因此，该TE模型deff 可用于解析使细胞自主抵抗免疫介导攻击的内在因素。

在此，我们提供一个详细的方案（图1以建立一种组织工程（TE）方法deff 由慢性亚致死剂量诱导获得的细胞模型（图2) 使用25 nM的flavopiridol处理。在 图3，经三天黄酮吡咯（flavopiridol）处理后，B16 OVA 细胞表现出部分 TE 特征deff 但在治疗一周后，B16/F10 OVA细胞显示出RNA聚合酶II羧基末端结构域（CTD）丝氨酸2位点磷酸化水平显著降低，同时H3K36me3也明显减少——H3K36me3是一种参与界定外显子边界的组蛋白修饰，可抑制失控的隐匿性转录。因此，TEdeff 细胞模型显示出关键的mRNA加工缺陷，表现为异常加帽和非多聚腺苷酸化mRNA的比例显著升高（图4A，B）。此外，还观察...

本方案详细描述了一种非遗传性转录延伸缺陷的小鼠癌变体外模型。在此模型中，通过持续抑制CDK9来阻抑RNA聚合酶II在促炎反应基因上的有效延伸过程，从而模拟并研究临床上观察到的TEdeff现象，该现象存在于约20%的人类癌症类型中。

一种基于小鼠细胞系的慢性CDK9抑制模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录延伸缺陷（TEdeff）

我们先前报道过，一部分癌症的特征是全局性转录失调，并伴有广泛的mRNA转录缺陷……

鉴于TEdeff型癌症是免疫治疗面临的重要障碍，我们的药理学模型具有显著优势，因为它能够恰当地模拟此类癌症中广泛存在的转录和表观遗传缺陷，从而有助于研究这些非遗传性异常，以获得新的认知、发现现有药物的新用途，或开发针对此类癌症的新策略。该模型易于建立且具有普适性，可用于研究癌症中的转录延伸缺陷，支持在体外和体内开展肿瘤-免疫相互作用的研究。该方法也可应用于人类癌细胞系。我们已在T47D和CAL51细胞系中进行了短期测试，结果均呈现出类似的TEdeff样特征。本文所述方案为慢性抑制CDK9以产生TEdeff样特征的关键已知变量提供了基本的优化框架。然而，对于其他小鼠细胞系，必须谨慎优化黄酮吡咯（flavopiridol）的确切亚致死剂量。细胞接种密度、培养条件以及细胞因子刺激条件的差异对不同小鼠细胞系的影响可能有所不同。首先，使用寡核苷酸dT磁珠从之前已去除核糖体RNA的样品中的一半提取polyA阳性RNA。将磁珠在小瓶中涡旋振荡30秒以重悬，然后将200 µL磁珠转移至一个离心管中。加入等体积的结合缓冲液，并混匀管内物质。将管子置于磁力架上静置一分钟，弃去上清液。随后将管子从磁力架上取下，用100 µL结合缓冲液重悬洗涤后的磁珠。用 pH 7.5 的 10 毫摩尔 Tris-HCl 将核糖体 RNA 耗尽的样品体积调至 100 微升。向样品中加入 100 微升结合缓冲液。将混合物在 65 摄氏度加热 2 分钟以破坏 RNA 的二级结构，然后立即置于冰上。将200微升总RNA加入100微升洗涤后的磁珠中，在旋转仪上充分混匀5分钟。将离心管置于磁力架上1至2分钟，小心移除全部上清液，然后将离心管从磁力架上取下，加入200微升洗涤缓冲液。用移液器轻轻吹打数次以充分混匀样品，再将离心管放回磁力架静置1分钟，随后移除上清液。然后，使用分光光度计测定分离得到的磁珠结合mRNA的纯度和浓度。将剩余一半的核糖体RNA耗竭样本作为输入，加入蛋白A柱中，利用单克隆7-甲基鸟苷抗体免疫沉淀5'端加帽的RNA。根据试剂盒制造商的方案，用洗液缓冲液洗涤RIP试剂盒中的蛋白A磁珠，以将7-甲基鸟苷抗体预结合到悬浮于100微升洗液缓冲液中的磁珠上。将混合物在室温下孵育30分钟，同时低速旋转。然后短暂离心试管，并将其置于磁力分离器上。移除并弃去上清液，随后将试管从磁力分离器上取下，用500 µL洗涤缓冲液重悬磁珠。涡旋混匀各管，短暂离心后重新置于磁力架上，再次弃去上清液。随后，向抗体结合的磁珠中加入120纳克核糖体RNA去除后的RNA以及1微升RNase抑制剂，在室温下轻轻振荡孵育60至90分钟。孵育结束后，在300 × g条件下离心10秒，将含有未加帽mRNA的上清液转移至新的微量离心管中。用 100 微升洗涤缓冲液再重复洗涤两次，并收集合并上清液。通过加入 300 微升根据文稿说明配制的尿素裂解缓冲液，并将混合物加热至 65 摄氏度持续 2 至 3 分钟，从磁珠上洗脱带帽的 mRNA。取 300 微升洗脱样品与 300 微升苯酚：氯仿：异戊醇混合，颠倒混匀，静置 10 分钟。再次轻轻混匀样品，然后离心两分钟。小心吸取上层液体至新的离心管中，弃去下层液体。向样品中加入 300 µL 异丙醇和 30 µL 3 mol/L 醋酸钠溶液，轻轻颠倒数次，置于 -20 °C 环境中静置 20 小时。孵育结束后，在4 °C条件下离心样品10分钟。小心弃去上清液，并在室温下干燥沉淀5分钟。将沉淀重悬于无核酸酶的水中，使用分光光度计测定RNA的纯度和浓度。根据文稿说明分离CD8阳性细胞，然后将细胞重悬于商品化的磁分离系统缓冲液中。每1毫升细胞加入100微升抗体混合液，在冰上孵育细胞15分钟。然后，每100微升抗体混合液加入100微升磁珠，继续将细胞置于冰上孵育15分钟。孵育后，向细胞中加入 7 mL 磁性分离缓冲液，分装 3 至 4 mL 至新的离心管中，并将离心管置于磁力架上静置 5 分钟。将含有 CD8 阳性细胞的上清液倾入置于冰上的新离心管中。然后，将剩余的 3 至 4 mL 细胞加入磁珠中，再将离心管置于磁力架上静置 5 分钟。将第二批CD8阳性细胞倒入装有第一批细胞的试管中。将携带共刺激分子的经基因工程改造的贴壁成纤维细胞SAMBOK细胞以每孔75,000个细胞的密度接种于24孔板中，并在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养。24小时后，用Iscove改良Dulbecco培养基洗涤抗原呈递细胞单层一次，并在根据文稿说明添加补充成分的2毫升培养基中加入0.5 × 10⁶个初始细胞。将细胞培养20小时，然后通过收集培养基，以191 × g离心2分钟，轻柔地收获非贴壁的OT-I细胞。计数细胞，并以1:1的比例将细胞接种，与B16/F10、未经处理的B16/F10-OVA以及经flavopiridol预处理的B16/F10-OVA细胞进行共培养。在37°C、5% CO₂的湿化培养箱中培养20小时，随后去除OT-I CD8阳性细胞，并用PBS洗涤贴壁的B16/F10-OVA细胞。用含0.5% EDTA的胰蛋白酶消化三组贴壁细胞，持续5分钟，然后以191 × g离心5分钟收集细胞。将收获的B16/F10-OVA细胞在冷PBS中与活率染料及相应的标记抗体孵育，随后通过流式细胞术分析细胞活力。该方案已用于建立转录延伸缺陷细胞模型，该模型显示出RNA聚合酶II羧基末端重复结构域丝氨酸2位点的磷酸化显著丧失，以及H3K36me3水平明显下降，而H3K36me3参与外显子边界界定并抑制失控的隐蔽转录。随着异常加帽和非多聚腺苷酸化mRNA比例的增加，细胞表现出关键的mRNA加工缺陷。此外，在该细胞模型中可观察到关键炎症反应通路基因的特异性抑制以及FasL介导的细胞死亡。一项探索性检测表明，该细胞模型对细胞毒性T细胞攻击具有抵抗能力，提示慢性氟哌啶醇诱导的转录延伸缺陷可能赋予细胞逃避免疫系统抗肿瘤攻击的能力。经黄酮吡咯烷（flavopiridol）处理的、稳定过表达OVA基因的B16/F10细胞对CD8阳性细胞毒性T细胞不敏感，而CD8阳性细胞毒性T细胞通常对表达OVA的细胞具有选择性杀伤作用。未经黄酮吡咯烷预处理的细胞则发生显著的细胞死亡，而不表达OVA抗原的亲本B16/F10细胞则存活。需要特别注意的是，在25纳摩尔黄酮吡咯烷处理下，磷酸化丝氨酸2和H3K36三甲基化水平的降低，并不能保证磷酸化STAT1和磷酸化NF-κB水平同时降低。每种小鼠癌细胞系均具有独特性，而JAK1和CCNT1可能挽救黄酮吡咯的效应。此外，该模型可用于体内监测TEdeff癌症对固有免疫和适应性抗肿瘤免疫应答所产生的耐药性。例如，可使用抗去唾液酸基（anti-asialo）处理来调控NK细胞的活性，并可对携带TEdeff肿瘤的小鼠施用免疫检查点治疗。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的数量是免疫治疗成功与否的指标。我们的模型为我们探索TEdeff肿瘤微环境中TIL的活化与耗竭程度——包括免疫治疗前和治疗后——铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

慢性CDK9抑制的基于小鼠细胞系的模型，研究癌症中普遍存在的非遗传转录伸长缺陷（TE肯定）

一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。...

建立可稳定表达四环素诱导型（Tet-on）shRNA或cDNA的人源细胞系

通过腺病毒-Cre激活乳腺导管系统中的潜伏突变，可导致具有临床相关性的转移性乳腺癌。引入YFP启动子可实现对远端转移性肿瘤细胞的追踪。该模型可用于研究潜伏性转移、抗肿瘤免疫反应，以及设计治疗乳腺癌的新型免疫疗法。...

通过腺病毒-Cre靶向导管上皮启动转移性乳腺癌：一种新型的乳腺癌转基因小鼠模型

端粒和端粒酶在衰老和肿瘤发生中发挥着关键作用。本实验方案的目标是展示如何构建两种可诱导的小鼠端粒酶敲入等位基因，并说明如何利用这些模型研究组织退化/再生以及癌症。...

利用小鼠可诱导端粒酶等位基因研究组织退变/再生与癌症

本文介绍了一种长期延时显微镜方法，用于纵向追踪单个细胞对抗癌治疗药物的反应。...

透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

在体内生长阶段，人源肿瘤异种移植模型具有血管化特征，并被来源于小鼠的细胞浸润。in vivo...

耗竭人源肿瘤异种移植组织中的小鼠细胞显著改善靶细胞的下游分析

本文提供了一种可用于表征C1498细胞培养的技术流程 体外 以及小鼠注射后诱导的急性白血病。通过流式细胞术、免疫荧光显微镜、细胞化学和May-Grünwald...

详细描述小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的实验方案

本文描述了利用体外和体内遗传学方法以及人源化小鼠模型，对c-Fos和Dusp1作为白血病药物靶点进行遗传学和化学验证的实验方案。该方法可广泛应用于任何靶点的遗传学验证及治疗开发。...

评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

本文介绍了一种显性负性可诱导系统的构建方案，该系统可通过可逆地过表达目标蛋白的显性负性突变体，从而实现对任意蛋白的条件性失活。...

可诱导且可逆的显性负效应（DN）蛋白抑制

miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA...

联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析

为了理解头颈部肿瘤的发生机制，需要建立具有头颈部癌症患者特定基因突变的小鼠模型。本文介绍了一种利用腺相关病毒-Cas9系统在体外转化小鼠原代舌细胞的实验方案，以构建具有特定基因组改变的小鼠头颈部癌细胞系。...

利用腺相关病毒-Cas9系统体外建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系

本方案概述了培养、操作和分析小鼠CAFs的方法，包括 体外/体内...

小鼠乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞作为分子与计算研究的工具

了解慢性CDK9抑制建立小鼠癌细胞系模型，用于研究转录延伸缺陷及其对肿瘤免疫逃逸的影响。该方法可应用于人类癌细胞系，为开发新型癌症治疗策略提供重要研究工具。

一种基于小鼠细胞系的慢性CDK9抑制模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录延伸缺陷（TE^deff）

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