Name: RNA足迹的识别:通过RNA免疫沉淀在串联中的蛋白质复合物,然后测序(RIPiT-Seq) (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习RIPiT-Seq技术用于识别RNA结合蛋白的RNA结合位点，该技术通过两次免疫沉淀富集特定RNA-蛋白复合物，无需紫外交联，适用于研究神经病变和癌症等疾病相关的RNA结合蛋白功能。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM120209（GS）支持。作者感谢俄亥俄州立大学综合癌症中心（OSUCCC）基因组共享资源中心提供的服务（癌症中心支持基金 NCI P30 CA16058）。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文讨论了成功进行RIPiT实验的一些关键考虑因素。首先，必须对每个免疫沉淀（IP）步骤进行优化，以在每一步骤中实现尽可能高的效率。对于本文所述的细胞输入量，所使用的FLAG琼脂糖微珠的量已在我们测试的多种蛋白质中被证明具有良好的稳健性。由于只有少量的相互作用蛋白能够与FLAG蛋白共免疫沉淀，因此第二次免疫沉淀所需的抗体用量通常较低（少于10 µg）。在放大实验规模之前，从小规模RIPiT实验（来自一个10 cm培养皿）出发，并在两次免疫沉淀过程中通过蛋白质印迹法检测各组分中的目标蛋白，对于评估实验的效率和特异性极为有用。在最终洗脱组分中，应能检测到目标蛋白以及复合物中任何其他预期的相互作用蛋白。同时，检测耗竭裂解液（即未结合到FLAG-琼脂糖或磁珠上的组分）中的蛋白也有助于准确评估免疫沉淀的效率以及形成复合物的蛋白比例。此外，该分析还可判断RNase消化条件是否充分，以区分核糖核蛋白（RNP）中的RNA依赖性相互作用与非RNA依赖性相互作用。因此，设置阴性对照同样至关重要，理想情况下应选择一个与目标RNP无关的RNA结合蛋白（RBP）作为对照。例如，在图3A<...

在细胞内，RNA 与蛋白质形成复杂的结合，构成 RNA:蛋白质复合物（RNPs）。RNPs 以 RNA 结合蛋白（RBPs，即直接结合 RNA 的蛋白质）为核心进行组装，但也包含非 RBPs（即结合 RBPs 而不直接结合 RNA 的蛋白质），且通常具有动态特性。RBPs 及其辅助因子在 RNPs 内协同发挥作用，执行调控功能。例如，在无义介导的 mRNA 降解（NMD）通路中，UPF 蛋白（UPF1、UPF2 和 UPF3b）可识别提前终止的核糖体。每个 UPF 蛋白均能结合 RNA，但只有当它们共同组装时，才开始形成具有活性的 NMD 复合物。在此复合物中，非 RBP 的 SMG1 通过磷酸化进一步激活 UPF1，而 UPF1 的激活最终导致 mRNA 降解诱导因子的募集1,2。在此例中，RBPs 需要非 RBP 辅助因子的参与，以实现触发 NMD 的 RNP 复合物的募集与激活。RNPs 的另一特性是其组成上的异质性。以剪接体为例，其可存在于不同的 E、A、B 或 C 复合物形式中。不同的剪接体复合物含有部分重叠但又各具特征的蛋白质组分3。为了研究 RNPs 的功能，阐明某种 RBP 及其相关蛋白所结合的 RNA 至关重要。目前已有多种方法可用于实现这一目标，每种方法均有其独特的优势与局限性4,5,6,7。
目前广泛使用的方法是通过交联后免疫沉淀（CLIP）及其多种变体来鉴定RBP结合位点——&#160;该方法依赖于紫外光（UV）将RBP与RNA交联8。然而，这种方法对于核糖核蛋白复合物（RNP）中不直接接触RNA的非RBP蛋白并不有效。本文中，我们描述了一种适用于RBP和非RBP的替代方法，可用于分离并鉴定其RNA结合位点。该方法称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT），包含两个免疫沉淀步骤，与单次纯化相比，可实现更高的特异性（图1）9,10。由于各个免疫沉淀（IP）步骤可在比CLIP更低的严格条件下进行，RIPiT不依赖于能够在免疫沉淀过程中耐受强去污剂存在的抗体。RIPiT最独特的优势在于可在两个纯化步骤中靶向两种不同的蛋白质；这为从其他相似复合物中富集出组成上独特的RNP复合物提供了有力手段11。
对RIPiT实验流程进行微小调整可进一步提高核糖核蛋白（RNP）的富集效果。例如，某些RNP内的RNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用是瞬时的，因此可能难以有效纯化此类复合物的足迹。为稳定这些相互作用，可在细胞裂解和RIPiT操作之前，使用甲醛对细胞内的RNP进行交联。例如，我们观察到，外显子连接复合体（EJC）核心因子EIF4AIII与EJC解聚因子PYM12&#160;之间的弱相互作用可通过甲醛处理得以稳定，从而富集到更多的RNA足迹（数据未显示）。在收集细胞并进行RIPiT之前，还可使用药物处理细胞，以稳定或富集处于特定状态的RNP。例如，在研究在翻译过程中从mRNA上解离的蛋白质时（如EJC13、UPF114），使用嘌呤霉素、环己酰亚胺或哈灵顿宁等翻译抑制剂处理，可增加蛋白质在RNA上的占据程度。
从RIPiT中回收的RNA量通常较低（0.5–10 pmol，即假设RNA平均长度为75 nt时，相当于10–250 ng RNA）。其主要原因是，特定蛋白中仅有很小一部分以核糖核蛋白复合物（RNP）形式与其他蛋白结合存在（第一步免疫沉淀中捕获的任何&#34;游离”蛋白在第二步免疫沉淀过程中都会丢失）。为了利用如此微量的RNA构建RNA-Seq文库，本文还概述了一种适用于低RNA投入量的、基于先前发表方案的改进方法15,16&#160;（图2），可在3天内获得适用于高通量测序的样品。

<table><tbody><tr><td>Anti-FLAG 亲和凝胶</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&amp;gamma;-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A250UC</td><td></td></tr><tr><td>BD 一次性带鲁尔锁扣针头注射器（200 支）</td><td>Fisher</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>甜菜碱 5M</td><td>Sigma</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>生物素-dATP</td><td>TriLink</td><td>N-5002</td><td></td></tr><tr><td>生物素-dCTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL540001EA</td><td></td></tr><tr><td>Branson 超声破碎仪，型号 SSE-1</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CircLigase I</td><td>VWR</td><td>76081-606</td><td>单链 DNA 连接酶 I</td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>ThermoFisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA 上样缓冲液</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A 磁珠</td><td>LifeTech</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In-T-REx 293 细胞系</td><td>ThermoFisher</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 低分子量 DNA Marker</td><td>ThermoScientific</td><td>FERSM1203</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE 凝胶（10 孔）</td><td>Bio-Rad</td><td>4565013</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE-尿素凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4566033</td><td></td></tr><tr><td>miRCAT-33 接头 5&amp;prime;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>Mirus transIT-X2 转染试剂</td><td>Mirus</td><td>MIR 6004</td><td></td></tr><tr><td>Mth RNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>E2610S</td><td></td></tr><tr><td>PE1.0 5&amp;prime;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT&lt;br/&gt; CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>PE2.0 5&amp;prime;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC&lt;br/&gt; GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，pH 6.7，100 mL）</td><td>Fisher</td><td>BP1752I-100</td><td></td></tr><tr><td>紫色凝胶上样染料（6×）</td><td>NEB</td><td>NEB #7025</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0491S/L</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶 I，&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;，1,000 U</td><td>Eppicenter</td><td>N6901K</td><td></td></tr><tr><td>SPIN-X 柱</td><td>Corning</td><td>CLS8160-24EA</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>ThermoFisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III（SSIII）</td><td>ThermoScientific</td><td>18080044</td><td>逆转录酶</td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td>金黄色核酸凝胶染料</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶-2500U</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;RNL2 Tr. K227Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>耐热 5&amp;acute; App DNA/RNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0319S</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq_SE1 5&amp;prime;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA&lt;br/&gt; GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC&lt;br/&gt; TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE10 5&amp;prime;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG&lt;br/&gt; AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT&lt;br/&gt; TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE11 5&amp;prime;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAAG&lt;br/&gt; AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC&lt;br/&gt; TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE12 5&amp;prime;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA&lt;br/&gt; GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC&lt;br/&gt; TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE2 5&amp;prime;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG&lt;br/&gt; CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT&lt;br/&gt; TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE35&amp;prime;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG&lt;br/&gt; AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT&lt;br/&gt; TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE4 5&amp;prime;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA&lt;br/&gt; GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC&lt;br/&gt; TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE5 5&amp;prime;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA&lt;br/&gt; GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC&lt;br/&gt; TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE6 5&amp;prime;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG&lt;br/&gt; CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC&lt;br/&gt; CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE7 5&amp;prime;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG&lt;br/&gt; AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT&lt;br/&gt; TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE8 5&amp;prime;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG&lt;br/&gt; CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT&lt;br/&gt; CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>TruSeq_SE9 5&amp;prime;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG&lt;br/&gt; CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC&lt;br/&gt; CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&amp;prime;</td><td>Any</td><td></td><td>本方案仅适用于 Illumina 测序平台</td></tr><tr><td>Typhoon 5 生物分子成像仪</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>29187191</td><td></td></tr></tbody></table>

通过串联rna免疫沉淀测序（ripit-seq）鉴定rna:蛋白质复合物的足迹

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

串联RNA免疫沉淀（RIPiT）是一种用于富集RNA:蛋白质（RNP）复合物中一对蛋白质的RNA足迹的方法。RIPiT包含两个纯化步骤：首先，对带有标签的RNP亚基进行免疫沉淀，随后进行温和的RNase消化和非变性亲和洗脱；接着对另一个RNP亚基进行第二次免疫沉淀，从而实现对特定复合物的富集。在对RNA和蛋白质进行变性洗脱后，将RNA足迹转化为高通量DNA测序文库。与更常用的紫外线（UV）交联后免疫沉淀（CLIP）技术富集RNA结合蛋白（RBP）结合位点的方法不同，RIPiT不依赖于UV交联。因此，RIPiT可应用于RNA互作组中大量不直接接触RNA或难以与RNA发生UV交联，但对RNA调控至关重要的蛋白质。RIPiT的两个纯化步骤还具有额外优势，即能够鉴定目标蛋白与另一个共因子协同作用时的结合位点。双重纯化策略也有助于通过降低背景信号来增强检测信号。本文提供了执行RIPiT实验并从分离的RNA足迹生成高通量测序文库的逐步操作流程，同时概述了RIPiT的优势与应用，并讨论了其部分局限性。

一次成功的 RIPiT 实验将富集到目标蛋白以及其他已知的相互作用蛋白，而不会富集非相互作用蛋白。如图3A所示，在 RIPiT 洗脱液中检测到了 Magoh 和 EIF4AIII，但未检测到 HNRNPA1（第6泳道）。同时，通过放射自显影（图3B）或生物分析仪（图3C）检测与 RNP 复合物共纯化的 RNA 足迹。预期嘌呤霉素处理会增加 EJC 在 RNA 上的占据率，在嘌呤霉素处理的 RIPiT 样品中观察到更强的 RNA 足迹信号（图3B，比较第2和第3泳道）。为进行深度测序而制备样品时，需将接头连接至 RNA，然后使用与接头序列互补的引物将 RNA 逆转录为 DNA。在逆转录步骤中加入生物素标记的核苷酸，以便纯化逆转录产物。逆转录完成后，必须通过尿素-聚丙烯酰...

本文介绍一种从哺乳动物细胞中富集内源性RNA结合位点或RNA:蛋白质（RNP）复合物的&#34;足迹”的实验方案。该方法包括对RNP亚基进行两次免疫沉淀，因此被称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT）。

通过串联RNA免疫沉淀测序（RIPiT-Seq）鉴定RNA:蛋白质复合物的足迹

串联RNA免疫沉淀（RIPiT）是一种用于富集RNA:蛋白质（RNP）复合物中成对蛋白质的RNA足迹的方法。RIPiT

串联RNA免疫沉淀后测序（RIPiT-Seq）是一种用于鉴定特定成对RNA结合蛋白所结合的RNA区域的方法。RIPiT最独特的优势在于其能够在两次纯化过程中靶向两种不同的蛋白质。这种方法能够有效地从其他复合物中富集出具有特定组成成分的RNA-蛋白质复合物。此外，RIPiT-Seq 不依赖于紫外交联，可应用于多种作用于RNA但不直接与其结合的蛋白质。尽管该方法尚不能直接用于治疗或诊断，但RNA结合蛋白及RNA加工过程已被发现与多种疾病（如神经病变和癌症）相关。RIPiT-Seq为研究疾病相关RNA结合蛋白的功能提供了一种有效工具。RIPiT-Seq 需要一个能够表达带有表位标签蛋白的系统。该技术目前仅在 HEK293 细胞中进行过测试，最适合用于细胞培养。然而，随着我们利用 CRISPR 对蛋白质进行标记的能力不断提升，RIPiT-Seq 可适用于多种现代研究系统。RIPiT 的成功取决于两次高效的免疫沉淀，因此优化所用抗体的免疫沉淀条件至关重要。此外，操作 RNA 时需要采取适当的预防措施，因此在 RNA 提取过程中及之后均应使用无 RNase 的试剂。演示该实验流程的是我实验室的研究生 Lauren Woodward。首先用15毫升预冷的PBS轻轻冲洗15厘米培养皿中的单层细胞。然后将细胞刮入30毫升PBS中，并收集至50毫升锥形管内。在4摄氏度下以400 ×g离心10分钟，沉淀细胞，弃去上清液。加入4毫升预冷的低渗裂解缓冲液，使用P1000移液器重悬细胞。将裂解液转移至5毫升离心管中，冰上孵育10分钟。将裂解液置于冰浴中，按照文章所述条件进行超声处理。然后加入108微升5摩尔的氯化钠，将盐浓度调整至150毫摩尔。接着在4摄氏度下以12,000 ×g离心裂解液10分钟，并收集20微升上清液用于Western印迹分析。根据说明书指示预先洗涤FLAG琼脂糖珠，然后将剩余上清液加入装有750微升珠子的5毫升离心管中。在4°C下，将FLAG琼脂糖珠与细胞提取物轻柔混合孵育一至三小时。孵育结束后，在4°C下以400 ×g离心一分钟，沉淀琼脂糖珠，并收集20 µL上清液用于Western印迹分析。弃去剩余上清液，加入4 mL等渗洗涤缓冲液重悬珠子以洗涤。再次离心收集珠子，并移除上清液。根据手稿说明，将RNase I用750微升iso洗涤缓冲液稀释后加入FLAG琼脂糖珠中。在4摄氏度下轻轻混匀孵育，然后通过离心收集珠子。取20微升上清液用于Western印迹分析，其余部分弃去。随后，按前述方法用iso洗脱缓冲液洗涤磁珠。接着，加入375微升洗脱缓冲液至磁珠中，于4摄氏度轻轻振荡1至2小时，进行亲和洗脱。孵育后，离心收集珠子，并取15 µL洗脱液用于Western印迹分析。在进行亲和洗脱的同时，开始磁珠抗体偶联。首先用1 mL同源洗涤缓冲液洗涤50 µL磁珠。将磁珠重悬于100微升偶联缓冲液中，并加入适量抗体。然后在室温下孵育磁珠至少10分钟。用偶联缓冲液洗涤磁珠两次，再将磁珠重悬于375微升RIPiT稀释缓冲液中。将磁珠置于冰上保存，直至进行免疫沉淀。将FLAG亲和洗脱液加入抗体偶联的磁珠中，在4摄氏度下轻柔混匀孵育一至两小时。用磁铁捕获磁珠，并收集15微升上清液用于Western印迹分析。然后，用等渗洗涤缓冲液洗涤磁珠七次。通过将磁珠重悬于100 µL澄清样品缓冲液中进行变性洗脱，并将悬液置于冰上孵育10分钟。孵育期间，定期轻弹管底以重新混悬磁珠。将磁珠置于磁力架上捕获，并收集15微升洗脱液用于蛋白质印迹分析。将剩余洗脱液转移至新的1.5毫升离心管中。为提取RNA，在RIPiT洗脱液中加入320微升无RNase的水和400微升苯酚-氯仿-异戊醇溶液。涡旋混合物，然后在12,000 g离心5分钟。吸取350微升水相至一个新的离心管中。向收集的样品中加入乙酸钠、氯化镁、糖原和乙醇，混合物在-20摄氏度孵育过夜。第二天，将RNA在4°C条件下以12,000 g离心30分钟，收集沉淀，并用70%乙醇洗涤。乙醇洗涤后，用不含ATP的T4多核苷酸激酶（PNK）处理RNA，然后根据论文中的说明进行苯酚-氯仿纯化。将纯化后的RNA溶于4.5 µL无RN酶的水中。为了定量RNA产量，根据文稿说明，使用PNK和32P标记的ATP对RNA进行放射性标记。采用低分子量DNA Ladder和20至40个核苷酸的合成寡核苷酸作为大小和数量标准。将标记的RNA在26%尿素-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。根据实验方案说明将凝胶干燥，并将凝胶暴露于磷光屏直至检测到足够信号。该技术已用于研究外显子连接复合物（exon junction complex，EJC）的相互作用。对RIPiT实验各主要步骤中纯化的蛋白质进行蛋白质印迹（Western blot）分析表明，纯化的EJC同时含有EIF4A3和MAGOH。阴性对照HNRNPA1在洗脱液中未被检测到。RNA足迹信号的强度与RNA-蛋白质相互作用的量呈正相关。当对经嘌呤霉素处理的细胞进行RIPiT实验时，观察到更强的足迹信号，因为嘌呤霉素可增加EJC在RNA上的占据程度。为了确保 RIPiT 实验有效，必须通过蛋白质印迹法检测免疫沉淀的效率。在进行深度测序之前，还必须评估 RNA 的含量和质量。2018 年，Singh 实验室成功应用该技术纯化了两种组成上不同的外显子连接复合物亚型，并鉴定了其 RNA 结合模式。如果研究人员选择使用放射自显影技术检测RNA足迹，则应遵循所有适当的辐射安全程序和规程。

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