Name: 通过追踪阿拉伯植物双重受精中的精子核形态对受精国的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: 学习通过精子核形态评估Arabidopsis双重受精状态的方法。该技术利用落射荧光显微镜快速判断受精表型，为研究未知受精调控因子提供可靠的实验框架。

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本工作得到了日本学术振兴会科学研究费助成项目（JSPS KAKENHI 拨款 JP17H05832 至 T. I.）以及千叶大学（日本）植物化学物质植物分子科学战略性优先研究推进计划经费的资助。

1. 人工授粉
注意：开始操作前，需要准备一把5号镊子。
<ol>
	<li>培养 A. thaliana 在生长培养箱中，22 °C 条件下，16 小时光照/8 小时黑暗循环培养（Col-0）。 
	注意： 用剪刀剪除最先发育的花茎，以促进腋芽的发育。生长旺盛的植株（剪除第一花茎后2-3周，株高约25 cm）适合用于分析。</li>
	<li>去雄时，去除萼片（图1B），花瓣（图1C）和雄蕊（图1D11阶段花蕾的）8 (图1A使用5号镊子操作，以顶部带有少量花瓣的花蕾为最佳。 
	注意： 使用合适的雌配子标记品系。在本方案中，我们以野生型植株作为母本。</li>
	<li>去雄后15至18小时，取一朵花的雄蕊 DMP9KD/HTR10-mRFP 13期花8 用镊子夹住灯丝。</li>
	<li>授粉时，用开裂的花药轻轻拍打去雄的雌蕊柱头数次。</li>
</ol>
2. 观察用胚珠的制备
注意：需要以下物品：贴有双面胶的载玻片、5号镊子、27 G注射针头和解剖显微镜。
<ol>
	<li>授粉后7至8小时（HAP），取下雌蕊并将其放置在双面胶带上，然后用镊子轻轻按压，使雌蕊固定在胶带上（图2A，A’）。 
	注意：大多数胚珠在授粉后10小时（10 HAP）时已接收到至少一条花粉管9。如果第一条花粉管中的两个或任一精细胞未能完成受精，由于受精恢复系统的作用，胚珠会吸引第二条花粉管10。为分析第一条花粉管中精细胞核的形态，建议最迟在10 HAP前完成胚珠的制备。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用注射针切除子房的上下两端（图2B，B’）。</li>
	<li>用注射针针尖沿中轴胎座两侧切开子房壁（图2C，C’）。 
	注意：插入注射针时应浅层操作，以防止胚珠从中轴分离。</li>
	<li>用注射针将子房壁向外翻转（图2D，D’）。</li>
	<li>用镊子夹住连接胚珠的中轴基部，并小心提起（图2E）。</li>
	<li>将胚珠转移至载玻片上的一滴水中，轻轻盖上盖玻片，用于荧光显微镜下观察（图2E，E’）。</li>
</ol>
3. 显微镜检查
注意： 在本实验方案中，我们使用了一台配备荧光滤光片组（见材料表）、数码相机及配套软件的落射荧光显微镜。
<ol>
	<li>使用20倍或40倍物镜及配套的数码相机，获取带有mRFP标记的精子细胞核的胚珠图像。</li>
	<li>确认胚囊中mRFP标记的精子细胞核的数量。 
	注意：含有两个mRFP标记的精子细胞核的胚珠可纳入统计分析的样本量中。</li>
	<li>确认胚囊中每个mRFP标记的精子细胞核的形态和位置。 
	注意：例如，精子细胞从花粉管释放后，一对浓缩态的mRFP标记的精子细胞核通常位于卵细胞与中央细胞之间；若检测到去浓缩态的mRFP标记的精子细胞核位于合点端一侧，则表明中央细胞已受精。通过使用合适的雌性配子体膜标记品系（如补充 图1所示），可清晰地监测精子细胞是否正在进行胞质融合（即膜融合后、核融合前阶段）。</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

HTR10-mRFP 标记父本染色质（即可视化精子细胞核），其在双受精过程中的动态已有报道7。花粉管释放后，HTR10-mRFP 标记的精子核仍处于凝缩状态。然而，在配子膜融合后三至四小时的核融合阶段，每个精子核在与已受精的雌配子核合并时发生去凝缩7。未受精的精子细胞则保持凝缩状态，如在 gcs1 精子细胞因未能受精而在胚囊中停滞所示（图3D）。通常情况下，当可育的 HTR10-mRFP 作为花粉亲本时，在授粉后7-8小时（HAP），一个雌蕊中57.9% ± 17.8%（均值 ± 标准差；n = 16 个雌蕊）的胚珠含有两个 mRFP 标记的精子核信号，且几乎所有信号（97.2%）均呈去凝缩状态，反映出成功的双受精（类似信号模式见于 图3A）。在 DMP9KD/HTR10-mRFP 情况下，含有两个 mRFP 标记精子核的胚珠出...

开花植物通过双受精产生种子，该过程直接受定位于配子质膜上的蛋白质之间相互作用的调控1,2。开花植物的雄性配子为一对精细胞，发育于花粉中。授粉后，花粉管生长并将这对精细胞递送至位于胚囊中的雌性配子——卵细胞和中央细胞。当雄性和雌性配子相遇后，配子表面的蛋白质促进识别、黏附和融合，从而完成双受精过程。在以往的研究中，已鉴定出雄性配子膜蛋白GENERATIVE CELL SPECIFIC 1（GCS1）/HAPLESS2（HAP2）3,4和GAMETE EXPRESSED 2（GEX2）5分别为参与配子融合和黏附的受精调控因子。我们近期鉴定出一种雄性配子特异性的膜蛋白DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9（DMP9），其参与配子相互作用并作为受精调控因子。研究发现，DMP9 表达量的降低会导致A. thaliana双受精过程中卵细胞受精受到显著抑制6。
由于双受精发生在胚囊中，而胚囊嵌于胚珠内，且进一步被子房组织包裹，因此很难直接观察和分析双受精过程的各个状态。正因如此，目前仍存在许多尚未明确的环节，阻碍了对双受精调控机制的全面理解。为了对潜在的受精调控因子进行功能分析，建立可在活体条件下追踪配子行为的观察技术至关重要。近年来的研究已开发出若干标记品系，其配子的亚细胞结构可通过荧光蛋白进行标记。本文介绍一种简单且快速的实验方案，用于观察人工授粉后的雌蕊中所发生的胚囊内双受精过程。利用精子细胞核标记品系 HTR10-mRFP7，可根据精子核信号的形态特征来区分每个雌性配子的受精状态。本方案聚焦于受精过程中精子核的形态变化，能够高效地获取足够数量的数据以进行统计学验证。以携带 HTR10-mRFP 背景的 DMP9 基因敲低品系（DMP9KD/HTR10-mRFP）作为父本植株，可展示出单受精模式。该方案同样适用于其他受精调控因子的功能分析。

<table><tbody><tr><td>BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td>落射荧光显微镜</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Matsunami 玻璃</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;DMP9&lt;sup&gt;KD/HTR10-mRFP&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;拟南芥&lt;/em&gt;, &lt;em&gt;HTR10-mRFP&lt;/em&gt; 背景&lt;br/&gt; Takahashi 等（2018）&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Nichiban</td><td>NW-15S</td><td>15 mm 宽度</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>数码相机</td></tr><tr><td>镊子</td><td>活力</td><td></td><td>任何5号镊子均可使用</td></tr><tr><td>生长室</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;HTR10-mRFP&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;拟南芥&lt;/em&gt;生态型哥伦比亚-0（Col-0）背景&lt;br/&gt; Ingouff 等（2007）&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>注射针</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Matsunami 玻璃</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Olympus</td><td></td><td>解剖显微镜</td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>Olympus</td><td></td><td>荧光滤光立方体（激发：BP535-555，发射：BA570-625，二向色镜：DM565）</td></tr><tr><td>UPlanFL N 40x</td><td>Olympus</td><td></td><td>物镜（数值孔径 1.3），油浸</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>Olympus</td><td></td><td>物镜（NA 0.75），干镜</td></tr></tbody></table>

通过追踪精子核形态评估受精状态 拟南芥 双受精

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

开花植物具有一种独特的有性生殖系统，称为“双受精”，&#160;其中每个精子细胞精确地与一个卵细胞或一个中央细胞融合，因此几乎同时发生两次独立的受精事件。受精后的卵细胞和中央细胞分别发育为合子和胚乳。因此，对双受精过程的精确调控对于后续的种子发育至关重要。双受精发生在雌配子体（胚囊）中，而雌配子体深藏于厚实的胚珠和子房组织内部。这种雌蕊组织结构使得对双受精的观察与分析极为困难，导致目前关于双受精机制的许多问题仍未得到解答。对于潜在受精调控因子的功能评估，受精表型的分析至关重要。在判断拟南芥（Arabidopsis thaliana）中受精是否完成时，通常以标记精子细胞核的荧光信号形态作为指标。未能成功受精的精子细胞表现为在雌配子体外出现凝聚的荧光信号，而成功受精的精子细胞则因与雌配子体细胞核发生核融合而呈现去凝聚的荧光信号。本文所述方法提供了一种在活体条件下判断受精成功或失败的有效工具。

在授粉后7-8小时采集了用DMP9KD/HTR10-mRFP授粉的雌蕊中的胚珠并进行观察。
大多数胚珠在卵细胞（珠孔端）和中央细胞（合点端）的细胞核位置分别含有两个去凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3A），表明双受精成功。此外，还观察到一些胚珠中中央细胞核位置含有一个去凝集的mRFP标记的精子细胞核，而在卵细胞外存在一个凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3B），表明发生了单受精。在双受精失败的情况下，在卵细胞与中央细胞交界处可观察到两个凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3C），这与gcs1突变体精子细胞的表型一致（图3D）...

我们展示了一种基于精子细胞核形态来判断受精成功或失败的方法 拟南芥 使用落射荧光显微镜观察双受精过程。

开花植物具有一种独特的有性生殖系统，称为“双受精”，其中每个精细胞都精确地与……融合

本方案提供了一种评估特定因子在拟南芥双受精过程中作用的方法。通过观察精子细胞核的形态可快速判断受精状态，从而能够迅速获得用于统计分析的数据。该方法专用于拟南芥受精表型的评估。即使在拟南芥中，仍存在一些未知的受精调控因子。该方法将有助于未来对未知受精因子的功能分析。熟练掌握快速且完整地处理胚珠的技术，对于成功开展此类分析至关重要。首先，在生长室中于22摄氏度条件下，以16小时光照和8小时黑暗的光周期培养拟南芥（Arabidopsis thaliana）。使用剪刀剪除最先发育出的花序茎，以促进腋芽的发育。剪除第一花序茎后2至3周，测量植株高度。株高超过25厘米的植株被视为生长旺盛的植株，适合用于分析。去雄时，寻找处于第11阶段、顶部可见少量花瓣的花蕾。使用5号镊子去除花蕾的萼片、花瓣和雄蕊。去雄后15至18小时，用镊子夹住花丝，取处于13期、背景为HTR10-mRFP且DMP9基因表达被敲低的植株的雄蕊。授粉时，用开裂的花药轻轻拍打已去雄的雌蕊柱头数次。授粉后7至8小时，采集雌蕊并将其置于双面胶带上。然后，用镊子轻轻按压，将雌蕊固定在胶带上。在解剖显微镜下，使用注射针切除子房的上端和下端。将注射针的尖端移至子房壁两侧，沿中缝将子房壁切开。小心切割，避免分离脐带和传导束。将子房壁外翻。捏住胚珠所连接的隔膜基部，用镊子小心提起。将胚珠转移至载玻片上的一滴水中，轻轻盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察。使用配备荧光滤光片组的落射荧光显微镜，将物镜调整至20x或40x。采集带有mRFP标记的精子细胞核的胚珠图像。确认胚囊中mRFP标记的精子细胞核的数量。确认胚囊中每个mRFP标记的精子细胞核的形态和位置。本研究中，受精表型通过胚珠中精子细胞核信号的形态来判断。大多数胚珠在卵细胞的珠孔端和中央细胞的合点端均含有两个去凝集的mRFP标记的精子细胞核，表明发生了成功的双受精。此外，还观察到部分胚珠的中央细胞核内含有一个去凝集的mRFP标记的精子细胞核，而在卵细胞外存在一个凝集的mRFP标记的精子细胞核，表明发生了单受精。在双受精失败的情况下，可在卵细胞与中央细胞的交界处观察到两个浓缩的mRFP标记的精子细胞核。在利用DMP9基因敲低系并以HTR10-mRFP花粉为背景的分析中，含有单个浓缩的mRFP标记精子细胞核或三个及以上mRFP标记精子细胞核的胚珠极少被观察到。结合雌性标记品系的使用，可对受精状态进行更精确的分析。例如，可以判断配子融合后、核融合前的受精状态。是的，受精过程分为多个步骤。通过这种改进的方法，可以明确各个受精调控因子分别参与了哪些步骤。这将有助于深入理解该植物的有性繁殖过程。

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发育生物学

通过追踪阿拉伯植物双重受精中的精子核形态对受精国的评价

基因组印记是植物和哺乳动物繁殖过程中的一种现象。DNA甲基化在印记机制中起着重要作用。在拟南芥（Arabidopsis）中分离胚乳并确定印记基因的甲基化状态可能较为困难。本实验方案中，我们描述了如何分离胚乳，并通过亚硫酸氢盐测序法测定甲基化状态。...

拟南芥 胚乳中印记基因DNA甲基化的测定

细胞生物学的一个基本研究目标是阐明构成真核细胞的细胞器身份特征背后的机制。本文提出一种利用荧光显微镜和下一代测序技术鉴定植物细胞器形态与功能完整性的相关基因的方法。...

荧光显微镜筛选与高通量测序：鉴定参与细胞器完整性的基因的有用工具

我们报道一种高效且简便的方法，用于分离发育早期阶段的胚胎 拟南芥 种子。根据下游应用的不同，可在1至4小时内分离出多达40个胚胎。该方法适用于转录组、DNA甲基化、报告基因表达、免疫染色和荧光检测。 原位...

高效快速分离早期胚胎 拟南芥 种子

我们在此提供一种高效且可靠的免疫染色和荧光检测方案 在 原位 杂交，DNA染色后对整体样本进行定量高分辨率成像 拟南芥...

一种用于整体封片胚珠中染色质修饰与细胞核结构的高效定量单细胞分析方法 拟南芥

本方案概述了一种观察胚胎发生的方法 拟南芥...

一种表征胚胎发生的方法 拟南芥

本文描述了一种 体外 一种能够实现活细胞成像的胚珠培养方法 拟南芥...

体外 胚珠培养用于活细胞成像观察拟南芥Arabidopsis thaliana受精卵极性建立与胚胎模式形成

在本实验方案中，我们介绍了正确解剖拟南芥花朵和角果的技术、一些基本的透明化方法，以及用于生殖结构整体观察的特定染色步骤。...

整体透明化与染色 拟南芥 花器官与角果

在此，我们描述了一种对半体外 (SIV) 法用于观察花粉管导向与接收过程 拟南芥, 这会提高胚珠的接受性。高通量SIV 与隔膜...

活体成像 拟南芥 花粉管接收与半体外双受精实验方法体外室间隔 方法

本文介绍了一种改进的拟南芥（Arabidopsis...

高分辨率单颗粒 体内 花粉水合生物测定法 拟南芥

本实验方案描述了拟南芥（Arabidopsis...

发育和成熟胚乳细胞层显微分析用完整组织的制备 拟南芥 种子

减数分裂前期染色体的运动是一种尚不完全清楚的现象，但对孢子形成至关重要。本实验方案描述了一种在拟南芥（Arabidopsis...

活体成像表征雄性减数分裂前期着丝粒的运动 拟南芥

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