通过追踪精子核形态评估受精状态 拟南芥 双受精

本方案提供了一种评估特定因子在拟南芥双受精过程中作用的方法。通过观察精子细胞核的形态可快速判断受精状态，从而能够迅速获得用于统计分析的数据。该方法专用于拟南芥受精表型的评估。

即使在拟南芥中，仍存在一些未知的受精调控因子。该方法将有助于未来对未知受精因子的功能分析。熟练掌握快速且完整地处理胚珠的技术，对于成功开展此类分析至关重要。

首先，在生长室中于22摄氏度条件下，以16小时光照和8小时黑暗的光周期培养拟南芥（Arabidopsis thaliana）。使用剪刀剪除最先发育出的花序茎，以促进腋芽的发育。剪除第一花序茎后2至3周，测量植株高度。

株高超过25厘米的植株被视为生长旺盛的植株，适合用于分析。去雄时，寻找处于第11阶段、顶部可见少量花瓣的花蕾。使用5号镊子去除花蕾的萼片、花瓣和雄蕊。

去雄后15至18小时，用镊子夹住花丝，取处于13期、背景为HTR10-mRFP且DMP9基因表达被敲低的植株的雄蕊。授粉时，用开裂的花药轻轻拍打已去雄的雌蕊柱头数次。授粉后7至8小时，采集雌蕊并将其置于双面胶带上。

然后，用镊子轻轻按压，将雌蕊固定在胶带上。在解剖显微镜下，使用注射针切除子房的上端和下端。将注射针的尖端移至子房壁两侧，沿中缝将子房壁切开。

小心切割，避免分离脐带和传导束。将子房壁外翻。捏住胚珠所连接的隔膜基部，用镊子小心提起。

将胚珠转移至载玻片上的一滴水中，轻轻盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察。使用配备荧光滤光片组的落射荧光显微镜，将物镜调整至20x或40x。采集带有mRFP标记的精子细胞核的胚珠图像。

确认胚囊中mRFP标记的精子细胞核的数量。确认胚囊中每个mRFP标记的精子细胞核的形态和位置。本研究中，受精表型通过胚珠中精子细胞核信号的形态来判断。

大多数胚珠在卵细胞的珠孔端和中央细胞的合点端均含有两个去凝集的mRFP标记的精子细胞核，表明发生了成功的双受精。此外，还观察到部分胚珠的中央细胞核内含有一个去凝集的mRFP标记的精子细胞核，而在卵细胞外存在一个凝集的mRFP标记的精子细胞核，表明发生了单受精。

在双受精失败的情况下，可在卵细胞与中央细胞的交界处观察到两个浓缩的mRFP标记的精子细胞核。在利用DMP9基因敲低系并以HTR10-mRFP花粉为背景的分析中，含有单个浓缩的mRFP标记精子细胞核或三个及以上mRFP标记精子细胞核的胚珠极少被观察到。结合雌性标记品系的使用，可对受精状态进行更精确的分析。

例如，可以判断配子融合后、核融合前的受精状态。是的，受精过程分为多个步骤。通过这种改进的方法，可以明确各个受精调控因子分别参与了哪些步骤。

这将有助于深入理解该植物的有性繁殖过程。