基于天然自发荧光的sFLIM技术测量植物切片中荧光探针与木质素的相互作用

在木质纤维素生物质中，由于存在与木质素的非特异性相互作用，降解多糖的酶活性受到限制。FRET 分析是研究纳米尺度变化的一种有效方法。但根据生物质类型的不同，后续获取所有切片可能会具有挑战性。

使用切片机进行切片时请耐心操作，并进行轻柔的洗涤。整合荧光寿命与光谱测量，可实现对木质素与TAG分子之间原位FRET的定量、灵敏且明确的测定。该方法涉及一些较难掌握的技术，如样品切片、多维显微成像及数据分析，但通过可视化演示可易于掌握。

为制备木材、小麦、纤维或碎片等植物样品，使用剃刀刀片切割长约1厘米的样品，注意不破坏材料结构，然后将样品置于真空环境中以去除任何空气。在室温下，将样品依次浸入用水稀释的30%和50%聚乙二醇（PEG）溶液中，轻轻搅拌，每种浓度各浸泡24小时。随后，在70摄氏度下将样品浸入100%浓度的聚乙二醇（PEG）溶液中持续24小时。

在100% PEG浸润后，将样品置于胶囊中，放置于70摄氏度的加热板上，并以每步5摄氏度的降幅逐步降低加热板温度，直至达到室温。当样品冷却后，使用切片机和一次性刀片小心地从每个PEG包埋块上切下30至60微米厚的平整切片。用轻柔的流水洗涤三次，每次五分钟，以去除切片中的PEG。

最后一次洗涤后，将每管最多三个切片与500微升新鲜配制的荧光探针在避光条件下孵育72小时。染色孵育结束后，使用刷子将切片转移至载玻片上，随后将切片置于载玻片与1.5H盖玻片之间进行封片。为确定sFLIM探测器的光谱窗口宽度，将尿素晶体置于带有0.17微米玻璃底的培养盒中，并将该培养盒放置于显微镜样品台上。

选择20倍物镜和波长为900纳米、功率为2%的钛掺杂蓝宝石激光器，并开启扫描。要进行sFLIM测量，请将系统切换至sFLIM模式。为了在sFLIM探测器上采集二次谐波信号，逐步调节激光激发波长从900纳米至980纳米，直至二次谐波信号被收集到第二个光谱通道中。

然后确定光谱窗口长度。切换至非D扫描模式，将荧光光子传送至sFLIM探测器。将sFLIM采集设置为启用模式，以允许单光子计数器进行光子计数。

当仪器准备就绪后，将一段仅含对照天然小麦秸秆的植物样本置于载玻片和盖玻片之间，放置在显微镜载物台上，并将系统设置为连续模式以进行激光扫描。设定30秒的采集时间，检查恒定分数甄别器的数值是否介于1×10⁴至1×10⁶之间。随后在样本上选择测量区域，然后点击开始。

测量结束后，保存 sdt 文件，并对至少另外九个样品重复测量。必须在获得足够光子数以进行光子计数与避免脉冲堆积及光诱导效应（这些效应可能改变荧光寿命）之间取得平衡。为分析所获取的 sFLIM 数据，将原始小麦秸秆单独数据文件导入单光子计数软件，打开“选项”和“模式”，选择“不完全多指数 12.5 纳秒”。

在“选项和首选项”中，选择“自动计算仪器响应”并选择“指数拟合模型”。对每个通道应用该拟合模型，并将拟合参数保存到电子表格中。通过电子表格计算各通道及实验之间的主荧光寿命，以进行比较。

为计算所有通道中至少10个样本的平均寿命，请分析供体通道中的主要荧光寿命，以确定选择光子数最多且对应木质素最大发射波长的特定通道值。为比较对照组天然小麦秸秆样本与实验组样本之间的sFLIM和EFRET值，若EFRET呈正值，且对照组与实验组样本之间的寿命均匀降低，则应将其分析为FRET事件。在此代表性实验中，sFLIM曲线展示了参考样本与两种相互作用情况之间可能产生的一些变化。

确实，可以很容易地观察到与罗丹明发射范围相对应的光谱区域中荧光强度的增加。仔细观察前三个通道的光子衰减曲线，还可以发现，与经罗丹明标记的聚乙二醇（PEG）孵育的天然小麦秸秆相比，经罗丹明标记的糊精孵育的天然小麦秸秆表现出更强的拐点。在对光子衰减曲线进行拟合并计算每个通道的主要荧光寿命后，FRET信号变得更加明显。

例如，对于天然小麦秸秆样品，其荧光寿命在荧光光谱上呈现交替增加和减少的趋势，而将天然小麦秸秆切片与罗丹明标记的聚乙二醇（PEG）或罗丹明标记的糊精共同孵育的样品中，则均观察到明显的FRET信号。在木质纤维素生物质水解的研究背景下，该方法可轻松拓展应用于不同生物质样品中的酶相互作用研究，尤其适用于需要对每种新生物质进行严格表征的情况。由于sFLIM无需固定样品，因而为动态研究酶与木质素的相互作用提供了可能，并有望指导酶的分子改造策略及生物质的预处理方法。

通常情况下，寿命测量需要使用脉冲红外激光源，因此必须采取适当的安全预防措施。