基于核磁共振的活性检测方法用于测定核苷核糖水解酶的化合物抑制作用、IC₅₀ 值、人工活性及全细胞活性

基于核磁共振（NMR）的活性检测方法为特定酶的抑制剂筛选、评估与验证提供了有效手段，尤其适用于片段筛选。NMR检测能够耐受弱效抑制剂所需的较高化合物浓度。

此外，由于缺乏报告酶，它们更不容易产生假阳性结果。我们在实验室中使用核磁共振（NMR）检测方法来鉴定和表征阴道毛滴虫中两种酶的抑制剂。这两种酶均为新型抗滴虫药物的潜在新靶点。

核磁共振（NMR）检测方法通常适用于涉及酶的任何研究领域，甚至可用于研究细胞内的酶。该技术最重要的方面是确保准确移取试剂体积，并将反应组分充分混匀。在准备底物和待测化合物时，向四个1.5毫升微量离心管中的每一个加入12微升底物，并向零分钟对照管和30分钟对照管中各加入6微升氘代DMSO。

向第一个实验管中加入6微升测试化合物，向第二个实验管中加入3微升测试化合物和3微升氘代DMSO。接着，向一个含有2.59毫升反应缓冲液的15毫升试管中加入300微升重水，然后加入25微升酶溶液。轻轻倒置试管两次以混匀反应储备液，再向一个含有582微升反应储备液的1.5毫升试管中加入10微升1.5摩尔盐酸。

然后，将全部反应储备液和酸转移至零分钟对照管中，以同时启动并终止零分钟对照反应。以缓慢但有意识的方式吸取并 dispense 样品两次。以交错方式进行其余三个反应的启动和运行，立即将582 µL反应储备液转移至第一个实验管中，并像刚才演示的那样混合样品两次。

仔细地进行吸取和分配，以确保在起始步骤期间充分混匀。每个样品的操作应保持一致，以确保混匀差异不会成为变量。30秒后，将582 µL反应储备液转移至第二个实验管中并混匀，随后在第二个实验管反应开始30秒后，向30分钟对照管中加入另外582 µL反应储备液。

30 分钟后，向第一个实验管中加入 10 微升 1.5 摩尔的盐酸，随后以 30 秒的间隔依次对第二个实验管和 30 分钟对照管进行同样的淬灭操作。所有反应淬灭完成后，从每个反应体系中转移 600 微升溶液至核磁管中。为计算对照谱图中底物的转化率，将样品加载至核磁共振波谱仪，采集核磁共振谱图，并叠加零时和 30 分钟对照样的谱图。

将零分钟对照组的底物信号调整至与30分钟对照组相匹配，并记录此百分比。然后，用100减去该底物信号匹配所得的百分比，计算出底物的转化率百分比。对于含有待测化合物的反应，计算其底物转化率百分比时，需将零分钟对照组与首个含有500微摩尔待测化合物的反应的谱图叠加，并调整零分钟对照组中的底物信号，使其与含待测化合物的谱图相匹配。

记录此百分比，并用其计算如上所示的转化率百分比。然后，将零分钟对照组与含有250微摩尔测试化合物的第一个反应的谱图叠加，并调整零分钟对照组中底物信号的尺度，使其与含有测试化合物的谱图相匹配。记录百分比后，用其计算转化率百分比。

为计算每种受试化合物浓度的反应百分比和抑制百分比，首先将受试化合物的转化率除以对照组的转化率，再乘以100，得到反应百分比。然后用100减去反应百分比，得到抑制百分比。进行去垢剂反筛实验时，向含有2.59毫升反应缓冲液的15毫升离心管中加入300微升氘代水和25微升酶溶液。

轻轻倒置离心管两次以混匀反应储备液，并向20毫升反应缓冲液中加入2微升Triton X-100去垢剂。然后，取含0.01% Triton X-100去垢剂的反应缓冲液2.59毫升，加入一个新的15毫升锥形管中。接着，向该管中加入300微升重水和25微升酶溶液。

轻轻倒置试管两次，以混匀反应储备液。然后，按照刚刚演示的方法，测定100 µM和50 µM测试化合物的抑制率。使用不含去垢剂的反应储备液处理第一组四支试管，使用含去垢剂的反应储备液处理第二组四支试管。

进行跳变稀释时，将468 µL反应缓冲液和60 µL重水转移至一个含有53.8 µL反应缓冲液、5 µL酶溶液和1.2 µL已孵育30分钟的DMSO的试管中。以缓慢但彻底的方式吸取并排液混合物两次。在将468 µL反应缓冲液和60 µL重水转移至另一个含有53.8 µL反应缓冲液、5 µL酶溶液和1.2 µL已孵育30分钟的待测化合物的试管之前，执行上述操作。

按照上述方法将第二个反应混合两倍体积。立即将588 µL溶液从跳跃稀释DMSO对照管转移至含有12 µL底物的试管中，并充分混匀。随后，依次将588 µL溶液从跳跃稀释的待测化合物管、未稀释的DMSO对照管和未稀释的待测化合物管分别转移至三个含有12 µL底物的1.5 mL离心管中，每管转移后均需混匀，并以30秒间隔继续操作。

然后等待30分钟，再淬灭反应，采集核磁共振谱，并计算每种化合物的抑制百分比，方法如前所述。此处展示的是在初步化合物筛选实验中，使用质子核磁共振对两种化合物针对AgNH进行测试的结果。通过观察腺苷在8.48和6.09百万分之一（ppm）处的单峰和双峰共振信号的消失，可最简便地观察和量化酶反应。

在30分钟的对照谱图中观察到8.33百万分之一处出现腺嘌呤单峰信号。本图展示了使用质子核磁共振技术，在去垢剂反筛实验中，以两种浓度测试某化合物对AgNH的作用结果。在两种条件下，底物和产物信号的强度仅存在微小差异，表明所观察到的酶抑制作用并非化合物聚集所致的人工假象。

请注意，测试化合物和去垢剂产生的共振信号不会干扰底物或产物的共振信号。以质子核磁共振（NMR）检测化合物对AGNH的跳跃稀释实验结果表明，在20微摩尔反应中底物信号强度较200微摩尔反应有所降低，表明该抑制作用是可逆的。每次反应启动时以及进行跳跃稀释时，充分的样品混合至关重要。

需要谨慎且一致地进行吸取和分配操作。基于核磁共振（NMR）的检测方法也可用于测量完整细胞中的酶活性，此时用含有悬浮细胞的溶液替代反应缓冲液和酶。我们针对抗毛滴虫药物的研发工作仍持续依赖这些检测方法，以评估新合成化合物对核糖水解酶的抑制效力。

尽管所用盐酸的量非常少，但用于淬灭反应的盐酸具有危险性，应使用适当的个人防护装备进行操作。