使用点击化学法测定血管平滑肌细胞增殖

增殖是衡量细胞功能的重要指标。本方案使研究人员能够在实验室中建立一种高灵敏度的增殖检测方法，而无需承担商业试剂盒的高昂费用。该技术的主要优势在于避免了对细胞的剧烈处理以及放射性物质的使用。

演示该技术的是我实验室的负责人Vicky Wong。为检测增殖，使用含2%胎牛血清的平滑肌细胞培养基从培养瓶中取出血管平滑肌细胞，并以每毫升20,000个细胞的密度接种于96孔板中的DMEM培养基中。将细胞在37摄氏度下培养过夜。

加入30 纳克/毫升血小板源性生长因子至三至六个孔中，作为刺激增殖的阳性对照；同时向相同数量的孔中加入磷酸盐缓冲液作为阴性对照。孵育72小时。

将先前配制的5 mM EdU储备液稀释至1 mM，然后在72小时培养期的最后24小时，每孔加入2 µL。保留一组不加EdU的平行样本，用于测定背景荧光和发光值。24小时后，吸去培养基固定细胞，每孔加入150 µL 4%多聚甲醛，室温孵育10分钟。

吸去多聚甲醛，每孔加入150 µL 1% TX-100 水溶液，室温孵育30分钟。用PBS洗涤三次，以去除TX-100。为通过荧光检测掺入的EdU，在使用前为每块96孔板配制10 mL标记溶液，按正确顺序将储备液中的试剂加入PBS：20 µL THPTA、20 µL硫酸铜、5 µL荧光素乙炔基叠氮化物（fluorescein picolyl-azide）和100 µL抗坏血酸钠，定容至总体积10 mL。

最关键的步骤是在使用前立即配制标记溶液。从孔中移除 PBS，每孔加入 150 µL 标记溶液，在 37°C 下孵育 30 分钟。为检测所有细胞核，每孔加入 DAPI，并在荧光显微镜或成像板读数仪上进行成像。

为避免手动计数，且在缺乏成像酶标仪的情况下，本方案可修改为使用辣根过氧化物酶叠氮化物（HRP azide）和ELISA底物进行化学发光检测。为通过化学发光检测EdU，首先配制含0.1%吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）。然后向每孔加入150 µL封闭缓冲液，在室温下孵育90分钟。

移除封闭缓冲液后，用 200 微升 PBS 洗涤细胞三次。为检测掺入的 EdU，首先按正确顺序将储备液中的试剂加入 PBS 中，每块 96 孔板配制 10 毫升标记溶液。依次加入 20 微升 THPTA、20 微升硫酸铜、5 微升生物素吡啶基叠氮化物和 100 微升抗坏血酸钠，定容至 10 毫升。

用 200 微升 TBST 振荡洗涤 5 次，每次 3 分钟。加入 150 微升 0.3% 过氧化氢，在室温下孵育 20 分钟以淬灭内源性过氧化物酶活性。去除过氧化氢后，再用 200 微升 TBST 振荡洗涤 5 次，每次 3 分钟。

每孔加入 50 µL 用 TBST 稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶，室温孵育 1 小时。加入 200 µL TBST，振荡洗涤 5 次，每次 3 分钟。每孔加入 50 µL 化学发光 ELISA 底物，立即在能够检测发光信号的酶标仪上读数。

尽管荧光标记的细胞核可通过标准荧光酶标仪检测，但采用化学发光检测方案时，荧光扫描被转化为均一的液相检测信号，通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶与标准ELISA底物反应进行检测。与荧光检测相比，该方法的优势在于信号更加均一，且读板速度更快，例如在此处检测PDGF刺激下血管平滑肌细胞（VSMC）增殖时，可在数秒内完成整块酶标板的读取。其缺点是背景信号高于荧光法，因此阴性对照的信号值通常较高。

为了降低变异性，将结果标准化为初始细胞数量。然而，在另一组实验中发现，该方法的灵敏度不足以检测细胞数量的微小差异。计数EdU阳性细胞和总细胞最高效且准确的方法是使用成像板式读数仪。

如果无法获得此类酶标仪，则手动计数也可获得准确结果。在比较这两种方法时，EdU阳性细胞的手动计数结果与自动计数结果完全一致，未刺激组的总细胞数计数结果也相同。这两种方法的优势在于可直观观察待计数的细胞，提高计数准确性，并且能够识别并避免碎片的非特异性染色。

手动计数方法的主要缺点是耗时。请记得在使用前 freshly 配制标记溶液，并按照书面方案中提供的顺序添加试剂。如果染色强度较弱，可尝试调整螯合剂与铜的比例。

请注意，多聚甲醛具有毒性，应在通风橱中佩戴手套操作。该实验步骤本身并不复杂，但可能需要通过调整标记溶液中螯合剂与铜的比例来优化。

此外，根据细胞类型和具体研究问题，可以调整孵育时间以及 EdU 处理的持续时间。该技术可与细胞表面标记和细胞内染色兼容，从而能够确定分裂细胞与非分裂细胞的特征。尽管该技术通常用于测量细胞增殖，但点击化学也可用于 RNA、蛋白质、脂肪酸和碳水化合物的代谢标记。

如果感兴趣的代谢靶点位于细胞表面，则可以对活细胞进行标记。