Name: 活联甘蔗，用于亲和色谱树脂的快速发展 - 抗体捕获作为案例研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解基于DsRed荧光蛋白的新型亲和层析树脂技术，用于从植物提取物中高效捕获单克隆抗体。该方法可降低生物制药生产成本，实现近100%回收率与优异的可重复使用性。

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我们感谢 Ibrahim Al Amedi 培育转基因烟草植株，感谢 Thomas M. Rademacher 博士提供烟草表达载体。作者谨此感谢 Richard M. Twyman 博士在编辑方面提供的帮助，以及 Markus Sack 就 DFE 亲和配体结构所进行的富有成效的讨论。本研究部分由弗劳恩霍夫协会内部项目（资助编号：Attract 125-600164）以及北莱茵-威斯特法伦州“网络化自适应生产”卓越中心项目（资助编号：423）资助。本研究还得到了德国研究基金会（DFG）在研究培训组“靶向肿瘤的药物递送”项目（资助编号：331065168）框架内的支持。GE 医疗集团支持了本文的开放获取出版。

1. 培养转基因烟草植株
注意：DFE 融合蛋白的设计及转基因植物的构建已在其他文献中描述5,17。
<ol>
	<li>将转基因烟草幼苗在土壤中萌发。用 1.0 g·L-1 的肥料溶液浇灌植株。当植株生长至直径约 0.04 m 时，将其移栽至单独的 100 mm × 100 mm × 60 mm（长、宽、高）花盆中。</li>
	<li>在温室中培养转基因烟草植株，光照周期为 16 小时（光/暗温度为 25/22 °C），相对湿度保持在 70%，并每小时自动施用 1.0 g·L-1 肥料溶液 15 分钟。</li>
	<li>7 周后，收获除植株茎基部四片子叶以外的所有叶片。立即按以下所述方法处理收获的叶片。</li>
</ol>
2. 宿主细胞蛋白的热沉淀
<ol>
	<li>在不锈钢加热容器（0.3 m × 0.3 m × 0.3 m）中设置一个工作体积为 20 L 的水浴。开始时，在水浴中放置一个磁力泵，以 5 L min-1 的流速持续搅拌液体。在水浴上安装可调式恒温器以控制温度（见步骤 2.4 和 2.8）。 
	注意：从本步骤至步骤 2.10 的所有操作均涉及高温液体处理。请穿戴适当的个人防护装备，包括隔热手套和护目镜。</li>
	<li>向水浴中加入 15 L 去离子水，并将液体加热至 70 °C。</li>
	<li>将一个装有 5 L 去离子水的 10 L 桶置于磁力搅拌器上。加入磷酸钠，使其终浓度为 120 mM。使用 10 M 盐酸调节 pH 至 8.14。待所有组分完全溶解后，将所得的浓缩漂烫缓冲液（5 L）加入步骤 2.2 中的水浴中。</li>
	<li>持续搅拌水浴，直至温度达到 70 °C。如有必要，使用 10 M 盐酸调节 pH 至 8.14。在达到目标温度和 pH 后，继续搅拌至少 15 分钟，以确保整个系统达到热平衡。</li>
	<li>准备一个 20 L 的桶（0.3 m × 0.3 m × 0.3 m），其中装入约 17 °C 的去离子水（用于步骤 2.9）。</li>
	<li>将步骤 1.3 中收获的烟草叶片分成每份 400 g 的等分试样。取一份试样放入穿孔篮中（0.2 m × 0.2 m × 0.2 m；孔径至少为 0.02 m × 0.02 m）。避免篮子装填过满或叶片堆积过紧，以防组织受损。</li>
	<li>将穿孔篮完全浸入步骤 2.4 中的热漂烫缓冲液中，并确保所有叶片均保持在液面以下。如有需要，可使用耐高温硅胶勺将叶片压入液面下。</li>
	<li>在磁力泵持续搅拌条件下，将烟草叶片在漂烫液中孵育 1.5 分钟。在整个孵育过程中监测液体温度。避免烟草叶片堵塞泵的进液口。</li>
	<li>将装有烟草叶片的篮子从漂烫缓冲液中取出，沥去叶片上残留的缓冲液 30 秒。随后将篮子转移至装有冷水的桶中（来自步骤 2.5），将叶片浸入冷水中 30 秒。取出篮子后再次沥去残留水分 30 秒，然后进行匀浆处理（步骤 3）。</li>
	<li>使用步骤 2.6 中的新鲜等分试样重复步骤 2.6 至 2.9，直至全部收获的生物量处理完毕。在整个过程中持续监测并调节水浴中漂烫缓冲液的 pH 和温度。 
	注意：若需进行多次漂烫循环处理全部生物量，漂烫后的植物材料可在冰上保存最多 30 分钟。漂烫后的叶片也可在真空密封袋中于 –80 °C 保存至少 3 周。但建议立即进行后续处理，因为长期储存可能会降低 DFE 产率。</li>
</ol>
3. 蛋白质提取与澄清
注意：以下步骤涉及带有旋转刀片的搅拌机。在搅拌机通电或安装在电机单元上时，切勿在搅拌机容器内操作。
<ol>
	<li>将150 g（湿重）漂烫过的烟草叶片（步骤2.9）放入搅拌器容器中，加入450 mL提取缓冲液（50 mM磷酸钠，500 mM氯化钠，10 mM连二亚硫酸钠，pH 7.5）。拧紧搅拌器盖子，防止植物材料或缓冲液溢出。</li>
	<li>以每次30秒、间隔30秒的方式对叶片进行3次匀浆处理。确保所有叶片均被充分匀浆，且无叶片粘附在搅拌器容器顶部。如有必要，可在间隔期间打开搅拌器，使用洁净的硅胶勺将粘附在容器上部的叶片压下。</li>
	<li>匀浆完成后，取1.0 mL匀浆液样品用于后续分析（步骤7）。</li>
	<li>将匀浆液收集至适当大小的容器中（例如，若处理总生物量为1.0 kg，则使用容量至少为5 L的容器）。重复步骤3.1至3.3，直至所有漂烫后的生物量均完成匀浆。</li>
	<li>将滤袋安装至滤袋支架上，并在装置下方放置另一个适当大小的容器（见步骤3.4）。以约0.15 L min-1的流速将匀浆液加入滤袋中。每过滤1升后取样滤液用于后续分析（步骤7），并使用浊度计或类似设备测定滤液池的浊度（以提取缓冲液稀释10倍后测定）。</li>
	<li>使用每升滤液池需0.02 m2的K700（上层）与KS50（下层）深层滤材组合进一步澄清滤液池。以3.0 L min-1·m-2的流速进行过滤，最大压力不超过0.2 MPa。随后，如前所述5，将澄清后的滤液通过0.2 µm无菌滤膜以去除残留颗粒。</li>
</ol>
4. DFE 亲和配体的纯化
<ol>
	<li>通过使用洗脱缓冲液（10 mM 磷酸钠，300 mM 咪唑，pH 7.4）、洗涤缓冲液（10 mM 磷酸钠，pH 7.4）和平衡缓冲液（20 mM 磷酸钠，500 mM 氯化钠，pH 7.4）冲洗，准备快速蛋白液相色谱系统。每公斤叶生物量（约 2.5 L 深层滤液）安装一个含有约 50 mL 螯合交联琼脂糖树脂的色谱柱。</li>
	<li>通过加入 5 个柱体积（CV）的 200 mM 硫酸镍溶液对色谱柱进行镍离子负载，并用 5 个柱体积的洗脱缓冲液洗涤。所有后续色谱步骤均使用 50 cm h-1 的流速，并监测 260、280 和 558 nm 处的紫外信号。</li>
	<li>用 10 个柱体积的平衡缓冲液对色谱柱进行平衡。然后将 50 个柱体积的澄清植物提取物（来自步骤 3.6）上样至已平衡的色谱柱中。</li>
	<li>用 10 个柱体积的洗涤缓冲液洗涤色谱柱。用 5 个柱体积的洗脱缓冲液洗脱 DFE 融合蛋白，并在 280 nm 和 558 nm 处的紫外信号较基线升高超过 5 mAU 时开始收集含产物的组分。</li>
	<li>从洗脱组分中取 0.2 mL 样品，用于测定总可溶性蛋白（TSP）浓度（步骤 7.1）、DFE 浓度（步骤 7.2 和 7.3）以及 DFE 纯度（步骤 7.4）。</li>
	<li>在色谱系统上安装一个含有约 50 mL 交联葡聚糖树脂的色谱柱。用 5 个柱体积的偶联缓冲液（200 mM HEPES，500 mM 氯化钠，pH 8.5）对色谱柱进行平衡。注入 10 mL DFE 洗脱组分（步骤 4.4）以进行缓冲液置换，并监测 280 nm 和 558 nm 处的紫外吸光度。</li>
	<li>当 280 nm 和 558 nm 处的紫外信号较基线升高超过 5 mAU 时，收集含 DFE 的组分。取 0.2 mL 样品，测定 TSP 浓度、DFE 浓度和 DFE 纯度（步骤 7）。</li>
	<li>使用离心浓缩管，在 4 °C、3,000 x g 条件下离心 30 分钟，将纯化的 DFE 样品（来自步骤 4.7）浓缩至 15 g L-1。随后进行偶联反应（步骤 5）。 
	注意：若无法立即进行浓缩或偶联步骤，需将 DFE 溶液在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
5. 将 DFE 偶联至活化的交联琼脂糖树脂
注意：在连接所需的全部设备和溶液准备就绪之前，不得更换用于保存NHS活化柱的异丙醇。切勿让色谱柱变干。
<ol>
	<li>建立一个实验设计（DoE）模型，以优化DFE与活化树脂的偶联，其中pH、缓冲液组成和DFE浓度作为影响因素。DoE方法的详细信息见其他文献15。</li>
	<li>将亲和配体溶液（来自步骤4.8）配制成0.5–15 g·L-1浓度范围（或根据DoE定义的浓度），并在冰上保存，直至偶联反应准备就绪（步骤5.5）。用DFE溶液填充至少十个2 mL注射器，并准备适配器，将注射器安装到床体积为1.0 mL的NHS活化交联琼脂糖柱上。</li>
	<li>每使用10根用于偶联的柱子，需准备30 mL封闭溶液（0.5 M乙醇胺，0.5 M氯化钠，pH 8.3）、30 mL低pH溶液（0.1 M乙酸钠，0.5 M氯化钠，pH 4.0）和10 mL保存溶液（0.05 M磷酸氢二钠，0.1% (m/v)叠氮化钠，pH 7.0）。</li>
	<li>在离心管中配制20 mL 1 mM盐酸，并在冰上孵育至少20分钟。准备一台精密天平，用于监测偶联反应过程中所有步骤的流出液（步骤5.7）。</li>
	<li>打开密封的NHS活化交联琼脂糖柱，并在柱入口处安装注射器适配器。连接注射器前，在适配器入口处滴加一滴缓冲液，防止空气进入柱中。</li>
	<li>以&#60;1 mL min-1的流速，用6 mL冰浴的1 mM盐酸（来自步骤5.4）洗涤柱子，并立即进入步骤5.7。</li>
	<li>使用2 mL注射器以&#60;1 mL min-1的流速注入1.5 mL DFE溶液（步骤5.2），并在精密天平（步骤5.4）上收集流出液，用于后续分析（步骤7）。密封柱子两端，在22 °C下孵育15–45分钟，具体时间根据DoE设置而定。</li>
	<li>以&#60;1 mL min-1的流速依次注入6 mL封闭溶液和6 mL低pH溶液，以去除树脂上非共价结合的配体。然后注入6 mL封闭溶液，并将柱子孵育15分钟。</li>
	<li>向柱中注入6 mL低pH溶液，随后注入6 mL封闭溶液。然后再向柱中注入6 mL低pH溶液。</li>
	<li>向柱中注入2 mL保存溶液，并在4 °C下保存。</li>
</ol>
6. 从澄清的植物提取物中纯化单克隆抗体的检测
<ol>
	<li>制备含有2F5的100 mL澄清植物提取物5 或来自优选的基于细胞的表达系统的上清液，其中也含有2F5。</li>
	<li>配制平衡缓冲液（20 mM 磷酸钠，500 mM 氯化钠，pH 7.4）、低pH洗脱缓冲液（0.05 M 柠檬酸，0.05 M 氯化钠，pH 4.0–3.25）以及高离子强度洗脱缓冲液（1.0–4.0 M 氯化镁，0.1 M HEPES，pH 8.0）</li>
	<li>用缓冲液冲洗层析系统。将亲和层析柱（来自步骤5.10）安装至层析系统上，以1.0 mL/min的流速用平衡缓冲液平衡5个柱体积。-1监测280 nm处的紫外吸收。 
	注意： 将植物提取物或细胞培养上清液上样至色谱柱时，可能导致反压升高。请设置0.2 MPa的高压警报，以避免对色谱系统或DFE柱造成损坏。</li>
	<li>将80 mL澄清的植物提取物或上清液（步骤6.1）以0.5 mL/min的流速上样至层析柱中-1 确保接触时间为2分钟。将流出液以2 mL为一份收集，用于穿透曲线的重建（步骤7.3）。若无法立即进行样品分析，则将流出液样品储存在4 °C。</li>
	<li>用6个柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。在此步骤的开始、中间和结束时分别收集洗脱液样品。</li>
	<li>用5个柱体积的低pH洗脱缓冲液或高离子强度洗脱缓冲液（0.1 M HEPES，1.25 M 氯化镁，pH 8.0）洗脱单克隆抗体2F5。当紫外280 nm信号上升至基线以上5 mAU时，收集DFE组分。
	<ol>
		<li>针对每种表位-抗体组合优化洗脱缓冲液。对于2F5，1.25 M氯化镁在产物回收率与配体稳定性之间实现了最佳平衡。 
		注意： 氯化镁溶液易产生沉淀。因此，先将氯化镁溶于约700 mL水中。另取100 mL水溶解HEPES，并调节pH至8.0。将溶解后的氯化镁溶液加入HEPES溶液中，再加水至终体积1.0 L。溶解氯化镁后不可调节pH，否则会导致沉淀生成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Bradford 法、十二烷基硫酸锂聚丙烯酰胺凝胶电泳（LDS-PAGE）和表面等离子体共振（SPR）光谱法（步骤 7）分析在步骤 6.4–6.6 中采集的所有样品。</li>
</ol>
7. 样品分析
<ol>
	<li>使用 Bradford 法测定总可溶性蛋白（TSP）浓度18,19。
	<ol>
		<li>将每个样品取 2.5 µL，设三个重复，加入 96 孔板的单个孔中。使用八个牛血清白蛋白（BSA）标准品，设三个重复，浓度范围为 0–2,000 mg·L-1。</li>
		<li>向每个孔中加入 200 µL Bradford 试剂，并通过轻柔吹打混匀。保持移液器水平，避免产生气泡，以免干扰后续读数。</li>
		<li>将 96 孔板在 22 °C 下孵育 10 分钟，使用分光光度计在 595 nm 处测定吸光度。根据 BSA 参考点绘制的标准曲线，计算样品中的 TSP 浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光测定法定量 DFE
	<ol>
		<li>将每个样品取 50 µL，设三个重复，加入黑色 96 孔半面积板的单个孔中。设置六个 DsRed 标准品，浓度范围为 0–225 mg·L-1。</li>
		<li>使用分光光度计，以 530 ± 30 nm 激发滤光片和 590 ± 35 nm 发射滤光片，重复测定荧光值两次。根据 DsRed 参考点绘制的标准曲线，计算样品中 DFE 的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 SPR 光谱法测定 2F5 浓度20。
	<ol>
		<li>配制 HBS-EP 运行缓冲液（10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、150 mM 氯化钠、0.005% v/v Tween-20，pH 7.4），并通过 0.2 µm 真空瓶顶滤器过滤除菌。将缓冲液脱气 15 分钟。</li>
		<li>将 HBS-EP 运行缓冲液连接至 SPR 仪器，在固定羧甲基化葡聚糖表面芯片后，使用“引液”功能平衡系统。启动手动运行，流速为 30 μL min-1，通过交替注入 30 mM 盐酸和 25 mM 氢氧化钠（每种各两次），在流速 30 μL min-1 下处理 1 分钟，对流路 1 和 2 的芯片表面进行预处理。</li>
		<li>在 10 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）中配制 300 µL 浓度为 500 mg·L-1 的 Protein A 溶液。解冻含有 0.4 M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和 0.1 M NHS 的试剂瓶，于 16,000 x g 离心 1 分钟，然后混合 70 μL EDC 和 70 μL NHS。</li>
		<li>将 EDC/NHS 混合液和 Protein A 溶液转移至 7 mm 塑料样品瓶中，放入样品架。以 10 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入 EDC/NHS 混合液，持续 10 分钟，以活化羧甲基化葡聚糖芯片表面。</li>
		<li>以 15 μL min-1 的流速向流路 2 注入 Protein A 溶液，持续 15 分钟，使 Protein A 与活化的羧甲基化葡聚糖表面偶联。</li>
		<li>在 Protein A 偶联过程中，解冻一瓶 1.0 M 盐酸乙醇胺（pH 8.5），于 16,000 x g 离心 1 分钟。将 150 µL 转移至 7 mm 塑料样品瓶并放入仪器。当步骤 7.3.5 完成后，以 10 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入盐酸乙醇胺溶液，持续 7 分钟，以封闭芯片表面。</li>
		<li>通过交替注入 30 mM 盐酸和 25 mM 氢氧化钠（每种各两次），在 30 μL min-1 流速下处理 0.5 分钟，对流路 1 和 2 的芯片表面进行再次预处理。</li>
		<li>在 HBS-EP 运行缓冲液中配制浓度为 500 µg·L-1 的 2F5 抗体标准品，并将含 2F5 的样品用 HBS-EP 缓冲液稀释至终浓度为 20–1,000 µg·L-1。以 30 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入样品和标准品，持续 3 分钟。每检测 15 个样品后注入一次 2F5 标准品。</li>
		<li>对每个样品，将流路 2（检测池）的响应单位（RU）信号减去流路 1（参比池）的信号，根据 2F5 标准品注入的 RU 信号计算抗体浓度。</li>
		<li>每次样品或标准品注入后，以 30 μL min-1 的流速向流路 1 和 2 注入 30 mM 盐酸 0.5 分钟，以再生芯片表面。</li>
		<li>将步骤 6.4 中每个穿流样品的 2F5 浓度对穿流体积作图，获得 2F5 突破曲线。计算当穿流中 2F5 浓度达到上样浓度 10% 时所注入的 2F5 量，以获得 10% 动态结合容量（DBC）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 LDS-PAGE 分析蛋白质样品。
	<ol>
		<li>打开一块即用型 4–12% BisTris LDS 聚丙烯酰胺凝胶，放入电泳模块中。将 800 mL 运行缓冲液（50 mM MES、50 mM Tris 碱、0.1% (m/v) SDS、1 mM EDTA，pH 7.3）加入模块，并添加 0.5 mL 抗氧化剂溶液。</li>
		<li>在 1.5 mL 离心管中，将 10 µL 上样缓冲液与 4 µL 还原剂和 26 µL 蛋白质样品混合。在 80 °C 的金属浴中孵育 10 分钟。于 500 x g 离心 30 秒。</li>
		<li>上样 LDS 聚丙烯酰胺凝胶（每道 10 µL 样品），另设一道上样 5 µL 预染蛋白标准品（10–180 kDa）。</li>
		<li>关闭电泳槽并连接电源。电泳运行 40 分钟，恒压 200 V。</li>
		<li>从电泳槽中取出凝胶。打开凝胶夹板，将凝胶置于摇床上，用去离子水洗涤 15 分钟（19 rpm）。随后在摇床上用染色液染色 1 小时（19 rpm）。</li>
		<li>在摇床上用去离子水脱色 1 小时（19 rpm）。使用胶片扫描仪扫描凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

新型亲和树脂的应用
我们已证明，通过将含有针对单克隆抗体（mAb）特异性表位的配体固定于NHS活化的交联琼脂糖上，可制备用于捕获单克隆抗体的定制亲和层析树脂。设计此类树脂需知晓表位序列，并使用线性表位。所获得的树脂在单克隆抗体捕获方面具有优势，因其有望替代昂贵的Protein A亲和层析步骤。在本案例研究中，2F5与DFE之间的相互作用由表位–互补位结合介导，因此我们的配体相较于结合大多数鼠源和人源IgG Fc区的Protein A应具有更高的选择性。由于每种单克隆抗体均需单独的配体，该方法初看可能仅适用于大规模生产的抗体。然而，若将本方法与快速的基于植物的瞬时蛋白表达技术相结合，可在不到两周的时间内以极少的工作量制备出新的亲和配体2728。因此，该方法也适用于小规模单克隆抗体的纯化。
亲和配体的生产及其潜在改进
植物为亲和配体（如本案例研究中所述的DFE融合蛋白）提供了一种快速且安全的生产平台5,29,30。对植物材料进行热烫处理可显著减少宿主细胞蛋白的含量，仅需一步即可完成，并且易于整合到标准的澄清流程中。然而，在当前的实验条件下，配体的回收率较低，这可能是由于其热稳定性中等，以及部分非特异性结合至滤膜层所致，其他产品也已有类似报道31,32,33。因此，通过蛋白质工程手段提高载体的热稳定性，未来可能有助于提升配体的产率，这一点已在疟疾疫苗候选分子CCT、抗肿瘤酶PpADI或一种中温型β-葡萄糖苷酶的研究中得到证实34,35,36。深度过滤步骤同样如此，通过蛋白质工程优化可能有助于降低蛋白与滤材之间的非特异性结合37。此外，通过使用絮凝剂或滤材添加剂来提高整体澄清效率，也有望降低DFE及类似配体的生产成本38,39。
当使用DsRed作为载体时，它会形成四聚体复合物。这一特性具有优势，因为它增加了每个配体上的表位数量，但也可能使配体在亲和层析过程中更容易发生解聚或变性。因此，使用如mCherry这样的单体载体蛋白可能更为理想，因为mCherry在低pH条件下稳定40，且通过引入表位的串联重复序列可提高配体的结合强度，从而增加树脂的载量5,26,41。对于结构简单的载体-表位蛋白（即不含二硫键或翻译后修饰的蛋白），采用微生物表达系统可降低生产成本，使这类配体在成本上更接近Protein A。例如，绿色荧光蛋白已在细菌细胞中成功表达，产量约为~1 g·kg-1生物量，这将显著降低配体的生产成本42。
无论采用何种表达宿主，在偶联过程中都需要使用经纯化的亲和配体，以最大限度减少宿主细胞蛋白或培养基成分的固定化，否则会降低树脂的选择性和载量。在IMAC纯化中引入多聚组氨酸标签可在单步操作中将纯度提高至约90%，从而实现快速且低成本的配体生产5,43,44。然而，融合标签的位置至关重要，因为它可能在空间位阻上影响表位结合，或导致标签或表位从载体上发生裂解45,46。
亲和配体在NHS活化层析柱上的固定化
固定化操作可手动进行，也可使用层析系统完成。由于每根层析柱所需的缓冲液体积较小，手动操作似乎更具优势（例如可产生最少的废液体积）。然而，当需要多个或更大规格的层析柱时，层析系统更易于控制偶联条件（如调节流速），因此在动态结合载量（DBC）方面更有可能获得可重复的结果。我们的数据表明，偶联缓冲液及其pH值对偶联效率和整体柱成本具有重要影响。因此，筛选影响偶联反应的因素，并针对每种载体蛋白（甚至每种载体-配体融合物）优化这些条件，可提高偶联效率和树脂性能，我们推荐采用这一策略。
使用DFE亲和树脂检测2F5的分离
树脂的产率和纯度是其性能的重要指标，在DFE的情况下，我们实现了105 ± 11%（±标准差，n=3）的产率和97 ± 3%（±标准差，n=3）的纯度，这与基准Protein A树脂的性能相当25,26。对于一般树脂（尤其是基于亲和配体的树脂）而言，另一个关键性能指标是产品穿透10%时的动态载量（DBC），因为该参数会影响特定工艺所需树脂的用量，从而影响成本。DFE配体的初始DBC约为4 g·L-1树脂，这一数值在相似条件下（仅2分钟接触时间）约为Protein A相应值的13%25,47，但与使用相同2分钟停留时间的其他定制亲和树脂（如抗FSH免疫亲和配体）相比，约高出15倍48。经过25次结合-洗脱循环后，DFE的DBC下降至初始值的15%，而商用Protein A树脂在相同DBC损失下则需要超过50次循环49。然而，需要指出的是，我们的载体尚未像Protein A那样经过充分优化，后者在过去四十年中已得到系统研究和持续改进8。
迄今为止，我们通过将低pH洗脱缓冲液改为高浓度氯化镁，提高了树脂的稳定性和产物回收率（图3），该方法此前已有研究推荐13。在经历25次结合-洗脱循环后，亲和配体特有的红色并未显著褪去，因此我们推测，澄清植物提取物中的内源性植物蛋白酶31可能截断了配体的表位，从而使其失活。因此，设计抗蛋白酶降解的连接臂以连接载体与表位，可能有助于在更多循环中维持初始的动态结合载量（DBC）。鉴于DFE配体表达与纯化的快速简便性、其与商用层析树脂的简单偶联过程，以及其优异的产物得率和纯度，我们认为，该方法可作为Protein A的合适替代方案，用于纯化不能与Protein A结合的单克隆抗体及其抗体衍生物，特别是当载体和连接臂的优化能够进一步提升DBC和配体稳定性时。这一假设得到了DFE纯化与Protein A纯化的2F5抗体解离常数差异较小的支持5，表明我们的新型亲和配体能够回收高质量的单克隆抗体。
该方法的优势与当前局限性
将亲和配体作为与载体蛋白的基因融合体进行表达，可提高其在水性缓冲液中的溶解度，从而更好地适用于典型的配体偶联条件。相比之下，由固相多肽合成获得的空白多肽在这些条件下可能因序列本身50而溶解度有限，且该序列无法改变，因为它由待纯化单克隆抗体所识别的表位氨基酸序列决定。因此，其他研究者已采用在树脂上直接合成多肽配体的方法51。所获得树脂的静态结合容量较高（约80 g·L-1），但树脂制备过程耗时较长，未报道动态结合容量，且所得纯度和回收率低于本方法。在实验室规模下，融合蛋白配体的另一个优势在于，配体及其变体可通过一种易于使用的高效表达系统快速地进行表达、纯化和测试，所需工作量极小52。
本方法目前存在的两个局限性是动态结合载量较低，仅为 3 g·L-1，以及在连续进行 25 次结合-洗脱循环后，其载量下降 90%5。未来可通过采用较温和的上样条件，并以经工程化改造的、更稳定的 DsRed 载体替代当前的 DsRed 载体，分别解决上述问题。例如，将目前的接触时间从 2 分钟延长至 4 分钟，有望使动态结合载量翻倍，这一点已在某些 Protein A 介质中得到证实26。
故障排除
下表列出了在本实验方案中可能遇到的潜在问题，并提供了相应的解决建议（表1）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">表1：可能遇到的问题及相应的解决方法。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>实验步骤</td>
			<td>问题</td>
			<td>原因</td>
			<td>解决方法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>植物未生长</td>
			<td>生长条件不佳</td>
			<td>检查肥料的pH值和电导率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>检查温度和光照条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 和 3</td>
			<td>提取后存在大量宿主细胞蛋白</td>
			<td>沉淀不完全</td>
			<td>检查烫漂过程中的温度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>检查烫漂浴中的搅拌情况</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 和 3</td>
			<td>在植物提取物中未检测到目标产物</td>
			<td>烫漂温度过高</td>
			<td>检查烫漂过程中的温度和pH值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>烫漂缓冲液pH值过低</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>提取后仍有大量茎或叶碎片残留</td>
			<td>搅拌机混合不充分</td>
			<td>确保植物材料在搅拌机中未形成堵塞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>深层过滤过程中压力迅速升高</td>
			<td>滤器选择或安装方向错误</td>
			<td>检查滤器类型和安装方向</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>洗脱时融合蛋白量少 / 大量融合蛋白出现在穿流液中</td>
			<td>IMAC树脂未正确负载金属离子</td>
			<td>检查IMAC树脂是否已正确负载金属离子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>融合蛋白丢失了亲和标签</td>
			<td>避免在植物培养过程中暴露于强烈阳光和高温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>浓缩过程中融合蛋白丢失</td>
			<td>融合蛋白结合到膜上</td>
			<td>检查膜的类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>确保浓缩倍数不过高</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>偶联产率低</td>
			<td>偶联试剂添加顺序错误</td>
			<td>检查试剂标签及添加顺序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>偶联前柱子准备不当</td>
			<td>检查柱子准备的条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 和 6</td>
			<td>mAb产率低</td>
			<td>植物生物量中mAb表达水平低</td>
			<td>检测生物量中mAb的表达水平</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>配体密度低</td>
			<td>检查融合蛋白制备物的纯度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Bradford测定中蛋白浓度极低或极高</td>
			<td>移液过程中产生气泡</td>
			<td>检查96孔板中是否存在气泡</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>SPR检测中mAb浓度偏低</td>
			<td>Protein A芯片性能受损</td>
			<td>与已知浓度的标准mAb结果进行比较</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>样品稀释错误</td>
			<td>检查稀释倍数和缓冲液</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：故障排除。

生物制药产品在医学几乎所有分支领域治疗广泛疾病方面具有重要意义1。单克隆抗体（mAbs）主导着生物制药市场，预计2020年全球销售额接近1100亿欧元2。单克隆抗体首选的表达平台是中国仓鼠卵巢细胞系，通常可在培养上清液中产生高达10 g∙L-1的高抗体滴度3,4。然而，由于培养基成本高昂且需要无菌发酵，哺乳动物细胞培养生产单克隆抗体的费用较高5。植物等替代表达平台可能为工业生产提供更快捷、更简单、更经济且更具可扩展性的方法6,7。
除了哺乳动物细胞培养相关的成本外，工业生产单克隆抗体（mAbs）过程中广泛使用 Protein A 亲和层析进行产物捕获，是主要的成本驱动因素。Protein A 天然存在于Staphylococcus aureus细胞表面，可结合某些小鼠和人源抗体的可结晶片段（Fc）区域，从而作为一种逃避体液免疫系统的防御机制8。Protein A 已成为从细胞培养上清液中捕获 mAbs 的行业金标准，同时也被科研界广泛使用，因其具有高度选择性，通常可在单步操作中实现约 95% 的 mAb 纯度8。过去二十年间，Protein A 的销售额与 mAbs 的销售额高度同步，这并不令人意外8。根据生产规模的不同，Protein A 的成本可能占总工艺成本的 25% 以上，从而影响治疗性 mAbs 的市场价格，后者可高达 €2,000 g-1 5,9。因此，开发具有类似纯化性能的替代层析树脂有望显著降低生产成本，使基于抗体的疗法惠及更多患者10,11,12。此类替代方法还可能规避 Protein A 层析的若干缺点，例如在低 pH（通常 &lt;3.5）条件下进行洗脱，可能导致 mAbs 发生构象变化并促进聚集13。值得注意的是，Protein A 仅对某些 IgG 亚类的 Fc 区域具有选择性，因此具有截短结合域的非功能性分子可能与完整产物共同纯化5，而单链可变区片段等 mAb 衍生物则完全不与 Protein A 结合。
本文描述了一种用于捕获HIV中和性单克隆抗体2F5的替代性亲和层析树脂，该方法利用其线性表位ELDKWA（单字母氨基酸编码）5,14。我们将2F5表位通过基因工程融合至荧光蛋白DsRed的C末端，DsRed作为载体和报告分子，随后在转基因烟草（Nicotiana tabacum）植株中表达了融合蛋白DsRed-2F5-Epitope（DFE）。DFE通过一步法固定化金属离子亲和层析（IMAC）进行纯化。将纯化的DFE亲和配体固定于交联琼脂糖树脂上，是通过使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的交联琼脂糖柱进行化学偶联实现的。随后采用统计实验设计优化固定化过程及偶联效率15。我们从抗体纯度、得率和配体稳定性等方面评估了2F5单克隆抗体的纯化策略。与结合Fc区的Protein A不同，DFE结合2F5的互补决定区，从而确保纯化出具有完整抗原结合位点（paratope）的分子。该策略可轻松拓展至任何具有线性表位的单克隆抗体，或可通过微阵列研究快速鉴定的其他基于多肽的亲和配体16。
<img alt="植物提取过程示意图；色谱系统；蛋白质纯化结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体的表位亲和树脂制备流程图。（A）亲和配体DFE在转基因烟草植物中表达。在收获叶片进行匀浆（C）之前，加入热沉淀步骤（B）。（D）粗制植物提取物通过袋式过滤、深层过滤和0.2 µm无菌过滤进行澄清。（E）DFE随后通过IMAC进行纯化。（F, G）将纯化的DFE亲和配体固定在EDC/NHS活化的交联琼脂糖柱上。（H）携带编码抗体2F5的T-DNA的细菌培养物用于在植物生长室中种植的N. benthamiana植物（I）中进行瞬时表达。（J）N. benthamiana叶片按D步骤所述方法进行收获和处理。（K）使用DFE亲和柱从澄清的提取物中纯化单克隆抗体2F5（L）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>10 升/20 升桶</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>烫漂设备</td></tr><tr><td>2100P 便携式浊度计</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>浊度计</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTApure</td><td>GE Helthcare</td><td>29018226</td><td>色谱系统</td></tr><tr><td>Allegra 25R</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>离心机</td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050</td><td>SPR 芯片偶联试剂盒</td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050</td><td>SPR 芯片偶联试剂盒</td></tr><tr><td>抗体 2G12</td><td>Fraunhofer IME</td><td>n/a</td><td>SPR 定量标准品</td></tr><tr><td>搅拌机</td><td>Waring</td><td>800EG</td><td>搅拌机</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Fuhr</td><td>2632410001</td><td>袋式过滤器</td></tr><tr><td>CanoScan 5600F</td><td>Canon</td><td>2925B009</td><td>扫描仪</td></tr><tr><td>50 mL 自立式离心管</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>反应管</td></tr><tr><td>螯合 Sepharose FF</td><td>GE Helthcare</td><td>17-0575-01</td><td>色谱树脂</td></tr><tr><td>Cond 3320</td><td>WTW</td><td>EKA 3338</td><td>电导率仪</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n/a</td><td>实验设计软件</td></tr><tr><td>Discovery Compfort</td><td>Gilson</td><td>F81029</td><td>多通道移液器</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>多种玻璃瓶</td><td>Schott Duran</td><td>n/a</td><td>玻璃瓶</td></tr><tr><td>Dri Block DB8</td><td>Techne</td><td>Z381373</td><td>加热金属块</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Fraunhofe IME</td><td>n/a</td><td>标准品</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8043.2</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>EnSpire</td><td>Perkin Elmer</td><td>2390-0000</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>ETHG-912</td><td>Oregon Scientific</td><td>086L001499-230</td><td>温度计</td></tr><tr><td>F9-C</td><td>GE Helthcare</td><td>29027743</td><td>馏分收集器</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>肥料</td></tr><tr><td>Forma -86°C 超低温冰箱</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>冰箱</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td><td>Hettich</td><td>2400</td><td>离心机</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10</td><td>GE Helthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td>色谱柱</td></tr><tr><td>HiTrap NHS-活化 Sepharose HP，1 mL</td><td>GE Helthcare</td><td>17-0716-01</td><td>色谱柱</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4625.1</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3899.2</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>K700</td><td>Pall</td><td>5302305</td><td>深层过滤层</td></tr><tr><td>KM02 basic</td><td>IKA</td><td>n/a</td><td>磁力搅拌器</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>深层过滤层</td></tr><tr><td>L/S 24</td><td>Masterflex</td><td>SN-06508-24</td><td>管路</td></tr><tr><td>Lauda E300</td><td>Lauda Dr Wobser GmbH</td><td>Z90010</td><td>浸入式循环器</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>KK36.2</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>HV-77921-75</td><td>蠕动泵</td></tr><tr><td>Minisart 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>滤器单元</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow PES 瓶顶过滤器</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>595-4520</td><td>SPR 缓冲液真空过滤</td></tr><tr><td>硫酸镍</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T111.1</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0336BOX</td><td>LDS-PAA 凝胶</td></tr><tr><td>Novex X-cell Mini Cell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>PAGE 电泳槽</td></tr><tr><td>NuPAGE 20x 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0002</td><td>缓冲液浓缩液</td></tr><tr><td>NuPAGE 抗氧化剂</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td>抗氧化剂</td></tr><tr><td>PageRuler 蛋白标准品（10-180 kDa）</td><td>Invitrogen</td><td>26616</td><td>蛋白标准品</td></tr><tr><td>带孔桶</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>烫漂</td></tr><tr><td>PH 3110</td><td>WTW</td><td>2AA110</td><td>pH 计</td></tr><tr><td>PowerPac HC</td><td>Biorad</td><td>1645052</td><td>电泳模块</td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt; 的蛋白 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7837-5MG</td><td>SPR 芯片包被</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 细粒，交联葡聚糖</td><td>GE Helthcare</td><td>17003301</td><td>色谱树脂</td></tr><tr><td>硅胶勺</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>勺子</td></tr><tr><td>Simply Blue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>凝胶染色液</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6773.1</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X891.1</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>HN13.2</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>亚硫酸氢钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>243973-100G</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T877.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>SPR 亲和传感器 - 高容量胺</td><td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td><td>SPR-AS-HCA</td><td>SPR 芯片</td></tr><tr><td>SPR-2/4 表面等离子共振分析仪</td><td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td><td>n/a</td><td>SPR 设备</td></tr><tr><td>SSM3</td><td>Stuart</td><td>10034264</td><td>微型旋转摇床</td></tr><tr><td>加热容器，20 L</td><td>Clatronic</td><td>n/a</td><td>烫漂室</td></tr><tr><td>无菌注射器，2 mL</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td>注射器</td></tr><tr><td>注射器接头（Luer F 联通接头）</td><td>GE Helthcare</td><td>181112-51</td><td>注射器适配器</td></tr><tr><td>TE6101</td><td>Sartorius</td><td>TE6101</td><td>精密天平</td></tr><tr><td>Tween-20（聚山梨酯）</td><td>Merck</td><td>8170721000</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Unicorn 6.4</td><td>GE Helthcare</td><td>29056102</td><td>色谱软件</td></tr><tr><td>真空袋</td><td>Ikea</td><td>203.392.84</td><td>植物储存</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>滤器外壳</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific industries</td><td>SI-0236</td><td>涡旋振荡器</td></tr><tr><td>XK-26/20 柱套</td><td>GE Helthcare</td><td>28-9889-48</td><td>色谱柱</td></tr></tbody></table>

用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

单克隆抗体（mAbs）的纯化通常通过 Protein A 亲和层析实现，该步骤可占整个工艺成本的25%。因此，在需要大量生产单一mAb的工业级制造中，开发替代性、更具成本效益的捕获步骤具有重要价值。本文介绍了一种将基于DsRed的表位配体固定于交联琼脂糖树脂的方法，可在不使用Protein A的情况下，从粗制植物提取物中选择性捕获HIV中和抗体2F5。首先将线性表位ELDKWA在基因水平上与荧光蛋白DsRed融合，并在转基因烟草（Nicotiana tabacum）植株中表达该融合蛋白，随后通过固定化金属离子亲和层析进行纯化。此外，我们优化了一种基于活化交联琼脂糖的固定方法，以实现高配体密度、高效偶联和低成本。在偶联过程中，pH值、缓冲液组成以及可溶性配体浓度是最关键的参数，通过实验设计方法对这些参数进行了优化。所得亲和树脂被用于测试其在粗制植物提取物中选择性结合目标mAb的能力，并进一步优化洗脱缓冲液，以实现高mAb回收率、产物活性以及亲和树脂的稳定性。该方法可轻松适用于其他具有线性表位的抗体。新型树脂相比Protein A可实现更温和的洗脱条件，同时还有望降低mAb生产中初始捕获步骤的成本。

亲和配体的表达与纯化
融合蛋白DFE在温室种植的转基因烟草植株中表达，产量约为120 mg·kg⁻¹鲜重。-1 叶质量，平均每株植物生物量约为130 g。DFE纯度 &lt;生植物粗提物中TSP占5%，经热处理后增至约40% 70 °C 1.5 分钟，产生沉淀 &gt;97% 的宿主细胞蛋白。漂白步骤可轻松整合到收获与提取流程中。图1）且额外耗时少于2小时，包括水浴装置的准备。DFE的总回收量为23.5 mg/kg1 纯度为 &gt;90%。导致产物损失的关键步骤为热烫、深层过滤和金属螯合亲和层析（IMAC），其特异性损失分别为40%、27%和45%。深层过滤器的平均通量为135 ± 36 L/m²-2 （均值±标准差，n=3），处于文献报道值的较高范围21。随着植株年龄的增长，DFE 产量增加（图2).
亲和配体在NHS活化层析柱上的固定化
在初始偶联测试中，我们发现与生产商推荐的碳酸氢盐缓冲液（78 ± 9%，±标准差，n=3）相比，HEPES缓冲液（pH 8.3）可将偶联效率提高至89 ± 6%（±标准差，n=3）。因此，后续所有偶联实验均采用HEPES缓冲液。为优化DFE与NHS活化的交联琼脂糖树脂的偶联效率，采用了实验设计（DoE）方法。固定在树脂上的DFE绝对量随注入柱中DFE质量的增加而上升，并在约15 g·L⁻¹时达到平台期。-1 而随着注入的DFE增多，偶联产率持续下降（图2）。偶联产率也 &gt;在酸性缓冲液中降低了50%，表明需要针对每种配体逐案筛选合适的偶联条件。通过使用实验设计（DoE）软件中的数值优化工具，确定了在偶联产率、固定化DFE的绝对量以及柱成本方面的理想条件。最理想的条件（pH 9.0，每1 mL交联琼脂糖树脂固定7.0 mg DFE）位于一个较大的平台区域，因此具有较强的稳健性。DFE分子在偶联后仍保持其红色荧光，且颜色强度与固定化DFE的总量相对应图2因此，柱子颜色可作为简单的质量控制参数，用于评估偶联效率和柱子质量。荧光结果还证实，DFE融合蛋白以天然DsRed的四聚体形式组装。
<img alt="SDS-PAGE 电泳图、pH 与质量的三维表面图、偶联 DFE 分析装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：DFE 固定化至 NHS 活化交联琼脂糖树脂的优化。（A）LDS-PAA 凝胶，叠加了未烫漂和烫漂转基因 DFE 植物提取物在播种后 38、45 或 52 天采集的匀浆液和洗脱样品的 Western 印迹。Western 印迹使用抗 His6 抗体进行检测5。（B）偶联 DFE 亲和配体的总量，依赖于偶联 pH 值以及注入 NHS 活化交联琼脂糖柱的纯化 DFE 总质量。红点表示用于构建响应面模型的实际实验点。（C）偶联反应完成后的 DFE 亲和柱。数字对应于 B 图中高亮的偶联条件。dps = 播种后天数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
使用DFE亲和树脂检测2F5的分离
重组2F5抗体在瞬时系统中表达 Nicotiana benthamiana 在植物生长室中培养的植物5使用偶联了约 7.0 mg 纯化 DFE（步骤 6）的亲和柱，检测从粗制植物提取物中捕获 2F5 的能力。从 Protein A 树脂洗脱通常采用酸性缓冲液（pH ~3.3）13因此，我们首先评估了不同低pH洗脱缓冲液（pH 6.0–3.25）用于DFE柱的效果。2F5在pH低于4.5时可成功洗脱，其中在pH 3.25时回收率最高，约为35%。然而，低pH洗脱使抗体（通过SPR光谱法确认）和DFE配体（表现为颜色消失及动态结合载量降低）均失活。 图3）。后者在预期之中，因为天然DsRed在pH下会变性 &lt;4.022,23为避免产物和配体变性，我们测试了氯化镁作为替代洗脱剂，因其此前已被用于从其他亲和树脂中洗脱单克隆抗体241.25 M 的氯化镁浓度足以从DFE亲和树脂上洗脱2F5，回收率为105 ± 11%（±标准差，n=3），纯度为97 ± 3%（±标准差，n=3）。该表现与Protein A树脂相当25,26. 平衡解离常数（KD) 经DFE纯化的2F5抗体与合成配体Fuzeon的解离常数为791 pM，而经蛋白A纯化的对应抗体的解离常数为763 pM5此外，在总共25次结合-洗脱循环中，树脂未观察到明显的颜色损失。DFE亲和树脂在2F5突破率为10%时的动态结合载量（DBC）在25个循环过程中线性下降至初始值的约15%（图3).
<img alt="色谱pH变化、氯化镁洗脱循环；洗脱浓度图；分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：使用DFE亲和树脂从澄清的植物提取物中分离2F5的测试结果。（A）使用pH值在4.0–3.0范围内的不同缓冲液进行一次洗脱循环后，以及在pH 6.0中和步骤后的DFE亲和树脂。（B）使用1.25 M或4.00 M氯化镁作为洗脱液，进行一次和六次2F5纯化循环后的DFE亲和树脂。（C）采用氯化镁作为洗脱液，通过前导进样实验（穿透曲线）测定DFE树脂循环依赖性动态结合容量的色谱图。穿透曲线针对4.0 M和1.25 M氯化镁洗脱缓冲液以及不同循环次数进行测定。（D）使用1.25 M氯化镁作为洗脱液时，DFE树脂循环依赖性动态结合容量的变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

在此方案中，将一种基于 DsRed 的表位配体固定化，以制备高选择性亲和树脂，用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体，可作为 Protein A 的替代方法。

单克隆抗体（mAbs）的纯化通常通过 Protein A 亲和层析实现，该步骤可能占整个...

单克隆抗体主导着生物制药市场，通常通过蛋白A亲和层析进行纯化。相应的层析树脂在生产过程中是主要的成本驱动因素，影响着抗体类治疗药物的价格。本文介绍了一种基于荧光蛋白的新型亲和配体，该蛋白可作为HIV中和抗体2F5线性表位的载体。总体而言，我们的方法能够快速制备可用于单克隆抗体捕获的亲和层析树脂。我们通过从粗制植物提取物中捕获抗体 2F5 验证了该方法的能力。为提高动态结合载量和树脂的可重复使用性，我们对捕获条件和溶液缓冲液进行了优化。我们的树脂通常比蛋白A具有更宽松的条件，有望降低单克隆抗体的纯化成本。此外，该树脂可轻松适配于其他结合线性表位的抗体。开始此操作前，调整已制备的亲和配体溶液浓度，使其处于实验设计所规定的每升5至15克范围内。将溶液置于冰上保存，直至准备进行偶联反应。接下来，用一个两毫升注射器吸取DFE溶液，并准备一个连接适配器，用于将注射器安装在床体积为一毫升的NHS活化交联琼脂糖柱上。每使用10个柱子进行偶联，需准备30毫升失活溶液、30毫升低pH溶液和1毫升保存溶液。然后在离心管中准备20毫升1毫摩尔盐酸，并在冰上孵育至少20分钟。准备一台精密天平，用于监测偶联反应过程中所有步骤的流穿组分。随后，打开一支密封的NHS活化交联琼脂糖柱。在接头入口处加入一滴缓冲液，以防止空气进入柱中。将注射器接头安装到色谱柱入口。以低于每分钟1毫升的流速，用6毫升冰浴的1毫摩尔盐酸冲洗色谱柱。使用2毫升注射器，立即以低于每分钟1毫升的流速注入1.5毫升DFE溶液。并在精密天平上收集穿流组分，用于后续分析。将层析柱两端密封，在22摄氏度下孵育15至45分钟。随后以低于每分钟1毫升的流速，依次注入6毫升活化溶液和6毫升低pH溶液，以去除树脂上非共价结合的配体。注入6 mL活化溶液，并将层析柱孵育15分钟。随后，向层析柱中注入6 mL低pH溶液，接着再注入6 mL活化溶液。然后向柱中注入另外6 mL低pH溶液。向柱中注入2 mL保存溶液，并在4°C下保存。首先制备100 mL含有2F5的澄清植物提取物，或制备优选的基于细胞表达系统的上清液（同样含有2F5）。接下来，按照文本方案配制平衡缓冲液和高铁X倍强度illusion缓冲液。用这些缓冲液冲洗层析系统。将DFE亲和柱安装到层析系统上。然后用五个柱体积的平衡缓冲液以每分钟1毫升的流速进行平衡。监测280纳米处的紫外吸光度。接着以每分钟5毫升的流速将80毫升澄清的植物提取物或上清液上样到柱中。确保接触时间为两分钟。以2毫升为一份收集流出液样品，用于穿透曲线重建。若无法立即进行样品分析，则将流出液样品储存在4°C条件下。用6个柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。在洗涤的开始、中间和结束时分别收集样品。用五倍体积的高离子强度稀释缓冲液稀释MAB2F5。当280纳米处的紫外信号较基线升高5毫吸光度单位时，收集DFE组分。根据文本方案中所述，针对每种表位-抗体组合优化洗脱缓冲液。融合蛋白DFE在转基因烟草植株中表达，并于温室中培养。DFE 的总回收率为 23.5 毫克每千克。纯度超过 90%。固定在树脂上的 DFE 绝对量随着注入柱中 DFE 质量的增加而增加，并在约 15 克每升时达到 plateau（平台期），而偶联产率则随着注入更多 DFE 而持续下降。即使在偶联后，DFE 分子仍显示出其红色荧光。颜色深浅对应于固定化 DFE 的总量。因此，可通过色谱柱颜色作为简单的质量控制参数，以评估偶联效率和色谱柱质量。重组 2F5 抗体在植物生长箱中培养的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）植株中瞬时表达产生。使用偶联了约七毫克纯化DFE的亲和柱，检测从粗制植物提取物中捕获2F5的效果。1.25摩尔的氯化镁浓度足以从DFE亲和树脂中洗脱2F5，回收率接近100%，纯度约为97%，与Protein A树脂相当。在25个循环过程中，DFE亲和树脂在2F5穿透10%时的动态载量（DBC）呈线性下降，降至初始值的约15%。我们采用实验设计方法优化了亲和配体的偶联能力。这些条件今后可针对其他配体进行精细调整。我们的方法利用荧光蛋白作为载体，穿插连接产物特异性配体的亚单位蛋白。同时，将功能作为动员过程的视觉质量指标，为操作者提供即时且直观的反馈。

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