活联甘蔗，用于亲和色谱树脂的快速发展 - 抗体捕获作为案例研究
August 16th, 2019
在此过程中，基于DsRed的表位配体被固定，以产生一种高度选择性的亲和树脂，用于从粗植物提取物或细胞培养上生子中捕获单克隆抗体，作为蛋白质A的替代品。
单克隆抗体主导着生物制药市场，通常通过蛋白质 A 色谱法进行纯化。根据树脂是生产过程中影响抗体治疗价格的主要成本驱动因素。在这里，我们描述了一种新的亲和力配体基于荧光蛋白，被读取为HIV中和抗体2F5的线性表位载体。
一般来说，我们的方法允许快速生成亲和力色谱树脂，可用于捕获单克隆抗体。我们通过从粗植物提取物中捕获抗体2F5来证明这一能力。我们优化了捕获条件和溶液缓冲液，以提高动态结合能力和树脂可再使用性。
我们的树脂通常比蛋白质 A 条件宽松，并且有可能降低单克隆抗体的纯化成本。此外，树脂可以很容易地适应其他抗体，结合线性表位。要开始此过程，请调整已准备的亲和力配体溶液的浓度，以便根据实验设计定义，浓度在每升 5 到 15 克的范围内。
将溶液存放在冰上，直到耦合反应就绪。接下来，用 DFE 溶液填充一个两毫升注射器。并准备一个适配器，将注射器安装在NHS激活的交叉链接的阿加罗斯柱上，床容为1毫升。
对于用于耦合的每 10 列，准备 30 毫升的停用溶液、30 毫升的低 pH 溶液和 1 毫升的存储溶液。然后在管子中准备20毫升一毫升盐酸。并在冰上孵育至少20分钟。
准备精密刻度，以监控耦合反应期间所有步骤的流经分数。在此之后，打开一个密封的 NHS 激活的交联阿加罗斯柱。将一滴缓冲液涂抹到适配器入口上，以防止空气进入柱。
将注射器适配器安装在柱入口。用六毫升冰冷一毫升盐酸清洗柱子，流量小于每分钟一毫升。使用两毫升注射器，立即以低于每分钟 1 毫升的流量注射 1.5 毫升的 DFE 溶液。
并收集通过分数的精度尺度，以便进行后续分析。在22摄氏度下密封柱子，孵育15至45分钟。接下来注射六毫升的活化溶液，然后注射六毫升的低pH溶液，以低于每分钟一毫升的流速，从树脂中去除非共价结合配体。
注射6毫升的激活溶液，并孵育该柱15分钟。在此之后，将六毫升的低pH溶液注入柱中。然后是六毫升的激活解决方案。
然后再将六毫升的低pH溶液注入柱中。将两毫升的存储溶液注入柱中，并将其储存在四摄氏度。首先准备100毫升的澄清植物提取物包含2F5，或上清液为首选基于细胞的表达系统，其中也包含2F5。
接下来准备平衡缓冲器，以及文本协议中概述的高铁 X 强度错觉缓冲器。用缓冲器冲洗色谱系统。在色谱系统上安装 DFE 亲和力柱。
与五 CV 的平衡缓冲液进行平衡，流量为每分钟一毫升。以 280 纳米监控紫外线吸收度。然后以每分钟 5 毫升的流速将 80 毫升的澄清植物提取物或上清液加载到柱上。
保证接触时间为两分钟。以两毫升分数收集通过样品的流量或突破性曲线重建。如果无法立即进行样品分析，则将流经样品的流量储存在四摄氏度。
在此之后，用 6CV 的平衡缓冲液清洗柱。在洗涤的开始、中间和结束收集样品。使用五卷高离子强度幻象缓冲液稀释 MAB2F5。
当 280 纳米的 UV 信号增加到基线以上的 5 毫吸收度单位时，收集 DFE 分数。优化每个表位抗体对的幻象缓冲液，如文本协议中所述。融合蛋白DFE在生长在温室的转基因烟草植物中表达。
DFE的整体回收量为每公斤23.5毫克。纯度超过 90% 时，树脂上固定的 DFE 绝对量随 DFE 质量注入柱中而增加，并且以每升 15 克左右的速度稳定，而耦合产量随着注入更多 DFE 而持续下降。即使在耦合后，DFE分子也被认为可以保留其红色荧光。
颜色强度对应于固定 DFE 的总量。因此，列颜色可以用作简单的质量控制参数，以估计耦合效率和列质量。重组2F5抗体在生长于植物龙的尼科蒂亚娜本thamiana植物中暂时产生。
从粗植物提取物中捕获 2F5，使用亲和力柱进行测试，并结合约 7 毫克纯化 DFE 进行测试。氯化镁浓度为1.25摩尔，足以从DFE亲和树脂中吸收2F5，回收率接近100%，纯度约为97%，可与蛋白质 A 树脂相媲美。DFE 亲和树脂的 DBC 突破 10%2F5，在 25 个周期中呈线性下降，约为初始值的 15%。
我们使用实验方法的设计来优化我们的亲和力配体耦合能力。这些条件可以针对将来的其他配体进行微调。我们的方法使用荧光蛋白为产品特异性配体线程亚载体蛋白。
同时，只需添加功能作为动员程序的视觉质量指标，立即向操作员提供直观的反馈。
概述
本研究提出了一种新型基于DsRed的亲和树脂，用于从植物原料提取物或细胞培养上清液中选择性捕获单克隆抗体。该方法旨在比传统的蛋白质A层析法降低纯化成本。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 蛋白质纯化
- 单克隆抗体
背景
- 单克隆抗体在生物制药中至关重要。
- 蛋白质A层析是一种常见但昂贵的纯化方法。
- 需要新的方法来降低生产成本。
- 荧光蛋白可用于亲和层析。
研究目的
- 开发一种用于单克隆抗体纯化的替代性亲和树脂。
- 优化捕获条件以提高结合能力。
- 展示树脂对各种抗体的适应性。
使用的方法
- 制备基于DsRed的亲和配体溶液。
- 将配体偶联到NHS活化的琼脂糖柱上。
- 使用含有抗体的澄清植物提取物测试树脂。
- 在纯化步骤中监测UV吸光度。
主要结果
- 新树脂能够高效捕获高纯度的抗体。
- 对于测试的抗体，恢复率达到近100%。
- 树脂显示出比蛋白质A更好的可重复使用性。
- 偶联效率可以通过荧光进行可视化监测。
结论
- 基于DsRed的树脂是抗体纯化的一个有前景的替代方案。
- 它可能会降低生物制药生产成本。
- 对其他抗体的未来适应是可行的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Protein A chromatography remains a major cost driver in monoclonal antibody purification, impacting the affordability of biologics. This method presents a cost-effective alternative using a DsRed-based affinity ligand immobilized on activated cross-linked agarose, enabling selective capture of antibodies with linear epitopes from crude extracts. The approach supports early-stage target validation and assay development by providing a reusable, visually quantifiable resin system that reduces reliance on expensive ligands.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through selective capture of epitope-specific antibodies from complex mixtures.
- Operational Value: Supports biological de-risking by validating target engagement using a linear epitope ligand expressed in plant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized affinity matrix for quantitative measurement of antibody binding in crude extracts.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through fluorescence-based coupling efficiency monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by allowing purification of functional antibodies from disease-relevant expression systems.
- Operational Value: Supports predictive confidence in lead identification through consistent recovery and purity across multiple cycles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, offering a platform for rapid resin generation applicable to multiple antibody targets with linear epitopes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of specific antibodies from complex biological samples.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via UV absorbance monitoring and fluorescence-coupled ligand quantification.
- Analytics: Provides measurable readouts such as dynamic binding capacity and recovery rates to compare purification conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by producing purified antibodies suitable for functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for rapid adaptation to new antibody targets through ligand exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in antibody-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of resin production using design-of-experiments optimization.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early purification feasibility.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on achievable purity and recovery metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, purification, and conjugation chemistry.
- Needs instrumentation for flow-controlled coupling, UV monitoring, and fraction collection.
- Demands cross-team standardization of ligand concentration, buffer conditions, and coupling timelines.
- Involves adaptation considerations for different epitope-antibody pairs, particularly in optimizing elution buffers.
- Includes practical limitations such as ligand leaching over cycles and declining dynamic binding capacity with reuse.
