Name: 制造用于采用免疫疗法的奇美抗原受体（CAR）T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学习制备具有功能活性的嵌合抗原受体T细胞用于过继免疫治疗。该方法通过优化培养条件保持T细胞健康状态，避免终末分化或耗竭，从而提高CAR-T细胞的增殖能力和抗肿瘤功效。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了诺华制药通过与宾夕法尼亚大学的研究合作（Michael C. Milone）提供的资助，以及圣巴尔德里克基金会学者奖（Saba Ghassemi）的支持。

所有动物实验均经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. T细胞激活、转导与扩增
<ol>
	<li>在6孔细胞培养板中，按每3个磁珠对应1个T细胞的比例，将新鲜或冻存的原代人T细胞与抗CD3/CD28磁珠（例如Dynabeads）混合，以激活T细胞。使用添加了5%正常人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、20 mM HEPES和IL-2（100单位/mL）的X-VIVO 15培养基培养T细胞。扩增期间维持T细胞浓度为106个T细胞/mL。在37 °C、20% O2、95%湿度及5% CO2条件下培养T细胞。</li>
	<li>过夜刺激后，向活化的T细胞中加入慢病毒上清液。计算所需上清液体积，以达到3−5的感染复数（MOI）。 
	注意： CD19-BBζ CAR慢病毒质粒包含CD8铰链区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域21。CD19-BBζ慢病毒上清液的制备方法如前所述21。</li>
	<li>第3天，取部分细胞样品用于冻存。冻存前，通过轻柔吹打和磁性分离去除磁珠。配制含0.5%二甲基亚砜（DMSO）的磷酸盐缓冲液（PBS），4 °C保存备用。
	<ol>
		<li>将T细胞以300 × g离心5分钟。弃去上清液，加入5 mL PBS。再次以300 × g离心5分钟，弃去PBS。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL预冷的冻存液中。将T细胞置于预冷的冻存盒中，于-80 °C保存48小时，随后转移至液氮中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用5 mL PBS洗涤剩余T细胞一次，以去除残留的病毒载体。以300 × g离心5分钟，弃去PBS，将细胞沉淀重悬于T细胞培养基中，调整细胞浓度至0.5 × 106个细胞/mL。</li>
	<li>将T细胞分为两份培养物，分别用于第5天和第9天的实验。使用计数微球（材料表）以及针对人CD4和CD8的单克隆抗体和活细胞染料（材料表），通过流式细胞术对T细胞进行计数。
	<ol>
		<li>为测定T细胞浓度，配制主混合液：500 µL PBS、5 µL计数微球、10 µL 7-氨基放线菌素D（7-AAD）活细胞染色液、4 µL CD4-FITC和4 µL CD8-APC。向主混合液中加入40 µL T细胞，通过流式细胞术根据活T细胞与微球的数量比例测定细胞浓度。每隔一天补充培养基，维持培养物细胞浓度为0.5 × 106个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天，按照步骤1.3和1.5所述方法，对第5天的培养物进行计数并冻存。</li>
	<li>第7天，用PBS洗涤0.5 × 106个T细胞，并重悬于100 µL荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中。使用荧光标记的抗CAR19独特型抗体通过流式细胞术检测CAR表面蛋白的表达。</li>
	<li>第9天，对第9天的培养物进行计数，并按照步骤1.3所述方法进行冻存。</li>
</ol>
2. T细胞分化的表型评估
<ol>
	<li>配制主混合液，包含预滴定的以下抗体：抗-CD3–BV605（克隆株 OKT3）、抗-CD14–Pacific Blue（PB）（克隆株 HCD14）、抗-CD19–PB（克隆株 HIB19）、抗-CD4–BV510（克隆株 OKT4）、抗-CD8–H7APC（克隆株 SK1）、抗-CCR7–FITC（克隆株 150503）、抗-CD45RO–PE（克隆株 UCHL1）、抗-CD27–PE-Cy7（克隆株 1A4CD27）、抗-CD95–PerCP-Cy5.5（克隆株 DX2）以及抗-CAR19-APC。</li>
	<li>为抗-CD45RO–PE、抗-CCR7–FITC、抗-CD27–PE-Cy7 和抗-CD95–PerCP-Cy5.5 分别制备单独的荧光减一（FMO）对照，以区分阳性染色细胞与背景信号。</li>
	<li>将活/死细胞染色原液（材料表）用 PBS 按 1:10,000 比例稀释，制备死细胞染色溶液。</li>
	<li>解冻先前冻存的第3天、第5天和第9天的T细胞。将每组1 × 106个T细胞在300 × g下离心3分钟。弃去上清液。用PBS洗涤细胞一次，在300 × g下离心3分钟，弃去PBS。</li>
	<li>将T细胞与死细胞染色液在室温（RT）避光条件下孵育15分钟。</li>
	<li>加入1 mL FACS缓冲液以淬灭死细胞染色荧光。在300 × g下离心3分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µL含步骤2.1和2.2所述抗体混合物的FACS缓冲液中，4 °C孵育1小时。</li>
	<li>加入1 mL FACS缓冲液，在300 × g下离心3分钟，洗去未结合的抗体。重复用FACS缓冲液洗涤三次。</li>
	<li>将细胞重悬于1%多聚甲醛（PFA）中，4 °C保存。</li>
	<li>由于固定后CD45RO表达下降，应在免疫染色后尽快通过流式细胞术分析样本。为评估T细胞分化状态，按以下顺序设门：单细胞（FSC-H vs FSC-A）、活CD3+ T细胞（排除门 [活/死染料、CD14-PB和CD19-PB vs CD3-BV605]，CD4-BV510 vs CD8-APC-H7）。在CD4+和CD8+亚群中，以CD45RO-PE vs CCR7-FITC设门，定义类初始T细胞（CD45RO-CCR7+）、中央记忆T细胞（Tcm，CD45RO+CCR7+）、效应记忆T细胞（Tem，CD45RO+CCR7-）和终末效应T细胞（Tte，CD45RO-CCR7-）。为鉴定干细胞样记忆T细胞（Tscm），在类初始T细胞群体中设门选择CD27+细胞；在此亚群中，Tscm为CD95+，而初始T细胞（Tn）为CD95-。</li>
</ol>
3. 体外功能分析
<ol>
	<li>CAR T细胞增殖与细胞因子分泌
	<ol>
		<li>通过流式细胞术，按照步骤1.5和1.7所述方法验证CAR表达水平及细胞活力。</li>
		<li>用PBS洗涤每组5 × 106个T细胞（第3天、第5天和第9天），然后重悬于含1 µM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）的PBS溶液中，室温孵育3.5分钟。</li>
		<li>立即加入含10%胎牛血清（FBS）的PBS 10 mL以终止反应。</li>
		<li>以300 × g离心3分钟，弃上清液，并重复洗涤步骤三次。使用库尔特计数器（材料表）在CFSE染色结束后对细胞进行计数。</li>
		<li>收集CFSE染色的细胞（未刺激组），重悬于1%多聚甲醛（PFA）中，4 °C保存，用于后续流式细胞术分析。</li>
		<li>将适量CFSE染色的CAR T细胞与经辐照的K562-CD19（靶细胞）以及K562野生型（对照）细胞按1:1比例混合，在无细胞因子培养基及步骤1.1所述培养条件下共培养120小时。</li>
		<li>培养24小时后，以300 × g离心5分钟，收集120 µL细胞上清液。根据制造商推荐方法，通过Luminex分析检测活化依赖性产生的IL2、IFNγ、TNFα、GM-CSF及其他炎症性细胞因子（IL1β、IL4、IL5、IL6、IL8和IL10）。</li>
		<li>用等体积（120 µL）的新鲜培养基替换步骤3.1.7中收集的上清液体积。</li>
		<li>第3天（即96小时后），使用基于微球的流式细胞术（如步骤1.5所述）对细胞进行计数，并以0.5 × 106个细胞/mL的浓度重新补液。</li>
		<li>第5天，计数活CD3+细胞，并计算相对于第0天活T细胞数量的扩增倍数。</li>
		<li>使用FlowJo软件对分裂中的CAR T细胞CFSE稀释情况进行全面分析，以显示连续的细胞分裂轮次。 
		注：增殖实验在FlowJo操作手册中有详细描述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞毒性实验 
	注：采用51Cr释放实验评估CART19细胞杀伤表达CD19靶细胞的能力。
	<ol>
		<li>将5 × 105个K562-CD19细胞、K562野生型对照细胞或NALM6白血病细胞与50 µL Na251CrO4及0.5 mL含10% FBS的RPMI培养基混合，在37 °C培养箱中孵育90分钟，以标记靶细胞。</li>
		<li>以300 × g离心2.5分钟，将放射性上清液弃入专用废液容器中，并用5 mL PBS洗涤靶细胞，重复洗涤两次。</li>
		<li>将靶细胞重悬于含5% FBS的酚红无培养基中。后续所有步骤均使用该培养基以降低背景信号。</li>
		<li>通过流式细胞术评估CAR表达和细胞活力（如第5.1节所述）后，将CAR T细胞与标记的靶细胞按效应细胞:靶细胞（E:T）比例10:1、3:1和1:1设置三复孔，混合后转移至96孔U型底板。</li>
		<li>同时设置仅含靶细胞的组以及靶细胞加1%十二烷基硫酸钠（SDS）的组，分别用于测定自发性（S）和最大（M）51Cr释放量。</li>
		<li>以300 × g离心5分钟后，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育4小时或20小时。</li>
		<li>在指定时间点，以300 × g离心5分钟，收集35 µL细胞上清液转移至检测板中，避免产生气泡。让检测板过夜干燥。</li>
		<li>使用标准封板膜密封检测板，用液体闪烁计数器进行计数。上清液中的铬含量可反映靶细胞杀伤程度。特异性裂解百分比计算公式如下：100 ×（实验组每分钟计数[cpm] – 自发释放组cpm）/（最大释放组cpm – 自发释放组cpm）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体内功能分析
<ol>
	<li>获取6−10周龄的NOD-SCID γc–/–（NSG）小鼠，该品系缺乏适应性免疫系统，并将其随机分配至治疗组或对照组。</li>
	<li>通过尾静脉将1 × 106个NALM6细胞溶于0.1 mL无菌PBS中，静脉注射至小鼠体内。</li>
	<li>注射后5−7天，通过生物发光成像（BLI）确认肿瘤移植情况。向经异氟烷麻醉（体积根据体重调整）的小鼠注射150 mg/kg的D-荧光素酶底物。</li>
	<li>使用成像系统测量生物发光值。通过在每只小鼠周围绘制相同面积的矩形（从头部至尾部长度的50%），使用相应软件定量总荧光通量。对每张图像单独扣除背景信号。</li>
	<li>在白血病模型建立后，通过尾静脉注射3 × 106个第9天收获的CART19细胞、0.5 × 106个第3天收获的CAR T细胞，或相应数量的非转导（NTD）人源T细胞，总体积为100 µL无菌PBS/Ca2+。 
	注意：由于在培养过程中不同时间点收获的细胞生物活性存在差异，第3天细胞的使用浓度低于第9天细胞。</li>
	<li>为评估疾病进展，按照步骤4.3所述方法，每周两次测量生物发光值。</li>
	<li>为评估CAR T细胞的移植情况，通过眼后静脉采血，收集75 µL血液至EDTA包被的采血管中。将50 µL血液转移至绝对计数管中。</li>
	<li>使用抗CD45、CD4、CD8和CAR抗体在室温下避光孵育30分钟进行染色。向管中加入400 µL 1× FACS裂解液，充分涡旋混匀。染色完成后，通过流式细胞术分析血液中表面标志物的表达。 
	注意：可使用其他表面标志物评估血液中T细胞的分化状态和耗竭状态。</li>
	<li>为检测血液中细胞因子水平，将血液在4 °C条件下以1,200 × g离心30分钟，分离血清层。</li>
	<li>收集血清，并根据制造商说明书使用指定的读板试剂盒检测细胞因子水平。</li>
</ol>

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了在体外培养的不同时间点收获CAR T细胞后，评估其功能和效力的方法。我们的方法全面阐述了用于体外评估CAR T细胞增殖能力及效应功能的实验方案。我们描述了通过CAR刺激后检测CAR T细胞活性的方法，并详细说明了使用对数扩增期第3天与第9天收获的CAR T细胞建立的白血病异种移植模型。
在比较体外扩增不同时间点收获的CAR T细胞疗效时，存在固有的挑战。由于3天培养周期内产生的T细胞数量较少，可能不足以全面评估其功能。这一问题在患者来源的T细胞中尤为突出，因为这些细胞的增殖能力常因内外因素而减弱20。
考虑到第3天的CAR T细胞相比处于对数增殖期末期的第9天细胞具有更强的代谢和增殖能力，应输注多少CAR T细胞？我们估算了第3天的CAR T细胞在体外再培养6天后可达到3 × 106的数量，并据此确定应输注的第3天CAR T细胞数量（0.5 × 106），以实现与第9天细胞的等效比较。因此，我们采用“压力测试”策略来比较输注后...

嵌合抗原受体（CAR）为将T细胞重定向以靶向特定肿瘤抗原提供了一种前景广阔的策略。CAR是一种可结合抗原靶标的合成受体。尽管其具体结构存在差异，但CAR通常包含三个不同的功能域。胞外域负责与靶抗原结合，通常由一个单链抗体片段通过胞外铰链区连接至CAR构成。第二个功能域通常来源于T细胞受体（TCR）复合物中的CD3ζ链，在CAR与抗原结合后促进T细胞的活化。第三个共刺激域则用于增强T细胞的功能、植入能力、代谢活性及持久性。CAR-T细胞疗法在多种造血系统恶性肿瘤（包括B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和多发性骨髓瘤）中的成功应用，凸显了该策略的治疗潜力1,2,3,4,5,6。近期美国食品药品监督管理局（FDA）批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞疗法——用于儿童及年轻成人ALL的替沙格列克（tisagenlecleucel）和用于弥漫性大B细胞淋巴瘤的阿基仑赛（axicabtagene ciloleucel），进一步证实了CAR-T细胞疗法的转化医学价值。
CAR T 细胞治疗策略包括从外周血中分离 T 细胞，进行激活、遗传修饰，并在体外扩增。分化程度是调控 CAR T 细胞疗效的重要参数。因此，在体外培养过程中限制 T 细胞的分化，可增强输注产物的植入能力、扩增能力及持久性，从而在过继性转移后实现长期的免疫监视2,7,8,9。T 细胞包含若干不同的亚群，包括：初始 T 细胞（Tn）、中央记忆 T 细胞（Tcm）、效应记忆 T 细胞（Tem）、效应分化 T 细胞（Tte）以及干细胞样记忆 T 细胞（Tscm）。效应分化 T 细胞具有强大的细胞溶解能力，但其寿命较短且植入能力较差10,11,12。相比之下，具有较低分化表型的 T 细胞，如初始 T 细胞和 Tcm，在过继性细胞转移后表现出更优的植入和增殖能力13,14,15,16,17,18。制备前采集的 T 细胞在不同患者间的组成可能存在差异，且与 CAR T 细胞的治疗潜力相关。起始单采产品中具有初始样免疫表型的 T 细胞比例，与细胞植入效果和临床应答均高度相关19。
培养时间是影响用于过继性转移的CAR T细胞分化的重要参数。我们近期开发了一种通过缩短培养周期来制备高质量CAR T细胞的方法20。利用该方法，我们证明了在白血病异种移植模型中，较短的培养时间可产生效应功能更强且在过继转移后具有更优持久性的CAR T细胞。本文介绍了稳定制备CART19细胞（即经基因工程改造以表达抗CD19单链可变区片段并连接CD3ζ和4-1BB信号结构域的自体T细胞）的技术方法，并详细描述了在过继转移前用于评估CAR T细胞生物学活性和功效的多种检测手段。

<table><tbody><tr><td>抗CD3/CD28 Dynabeads</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC 小鼠抗人 CD8</td><td>BD 生物科学</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 小鼠抗人 CD8 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS溶血溶液 10倍浓缩液</td><td>BD 生物科学</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount 绝对计数管</td><td>BD 生物科学</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗人 CD4 抗体</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 抗人 CD3 抗体</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright 绝对计数微球，</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记抗人 CD197（CCR7）抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC 标记小鼠抗人 CD4</td><td>BD 生物科学</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>人AB型血清</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>人IL-2免疫印迹，优质级</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数器，MicroBeta Trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定紫染料</td><td>分子探针</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 库尔特计数器</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>太平洋蓝染料标记的抗人CD14抗体</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>太平洋蓝染料标记的抗人CD19抗体</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗人 CD45RO 抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗人 CD95（Fas）抗体</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗人 CD27 抗体</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>无酚红培养基</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>10% UltraPure SDS 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>微电极探针</td><td>BD 生物科学</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-荧光素钾盐</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（car）t细胞

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

过继性免疫治疗在癌症和传染病的治疗中具有广阔前景。我们描述了一种简单的方法，用于将嵌合抗原受体（CAR）转导至原代人T细胞，并在体外扩增其子代细胞。我们提供了检测CAR表达、细胞分化、增殖能力及细胞溶解活性的实验方法。同时，我们还描述了检测CAR T细胞效应细胞因子产生及炎性细胞因子分泌的实验方案。该方法为过继性免疫治疗的临床前模型提供了可靠且全面的CAR T细胞培养技术。

采用上述方法，我们对T细胞进行了刺激与扩增，培养时间为3天或9天（图1A,B）。我们还通过检测细胞表面表达的不同糖蛋白，分析了其分化特征，具体分群策略如图1C所示。结果显示，在体外培养过程中，T细胞随时间推移逐渐向效应细胞表型转变（图1D）。我们评估了CAR T细胞在抗原刺激下的效应功能和增殖能力，发现培养时间较短（较早收获）的细胞在功能上优于长期培养的细胞。与培养9天的细胞相比，第3天收获的CART19细胞在再次受到相应配体刺激时，表现出更强的增殖能力和细胞杀伤活性（图2A,B）。
在一种人源异种移植小鼠急性淋巴细胞白血病（ALL）模型中，我们比较了第3天与第9天收获的CAR T细胞的效力（<strong cl...

我们介绍了一种可靠生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并在体外和体内检测其分化与功能。

制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

过继性免疫治疗在癌症和传染病治疗中具有广阔前景。我们描述了一种简单的方法，用于转导原代人T细胞……

在输注后能够定植、扩增并具有细胞毒活性的功能性CAR T细胞产品的制备，是有效过继性免疫治疗的关键组成部分。例如，在实体瘤中，CAR T细胞能够浸润实体瘤并获得最佳的抗原刺激；然而，其在人体内的整体定植和扩增能力受到限制。该方法的主要优势在于，能够在不产生终末分化或耗竭T细胞的情况下，维持CAR T细胞的质量或分化状态，从而避免因细胞增殖能力下降或效应功能不佳而影响治疗效果。该技术可能具有难度，因为T细胞对其细胞浓度、培养容器的表面积以及代谢需求非常敏感。本质上，在整个操作过程中都需要维持T细胞的良好状态，否则它们将无法生长。开始此操作时，准备好6孔培养板。通过将新鲜或冻存的原代人T细胞与抗CD3和CD28磁珠按每3个磁珠对应1个T细胞的比例混合，激活T细胞。将T细胞在X-Vivo 15培养基中进行培养，培养基中需添加正常人AB型血清、L-谷氨酰胺、hepes和IL2。扩增期间，以每毫升一百万个T细胞的浓度激活T细胞，并在37摄氏度、20%氧气、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养。经一夜刺激后，将慢病毒上清液加入已激活的T细胞中。计算上清液的体积，以获得3至5之间的感染复数。继续在相同条件下培养细胞。第3天，收集用于冷冻保存的细胞代表性等分试样。在冷冻保存之前，通过轻柔移液和磁力分离去除磁珠。准备含有0.5% DMSO的PBS冷冻培养基，并在4°C下保存，直至使用。接下来，将T细胞在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，加入5 mL PBS。再次以300 × g离心5分钟，弃去PBS。将沉淀重悬于1毫升冷的冷冻保存液中。将T细胞放入预冷的冻存容器中冷冻，并于-80摄氏度保存48小时。此后，将冻存的细胞转移至液氮中。用 5 毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤剩余的 T 细胞一次，以去除任何残留的载体。在 300 × g 条件下离心 5 分钟。然后，弃去 PBS，将细胞沉淀重悬于 T 细胞培养基中，浓度为每毫升 500,000 个细胞。将 T 细胞分入两份培养物中，分别标记为 45 和 9。使用计数微球及针对人 CD4 和 CD8 的单克隆抗体，通过流式细胞术对 T 细胞进行计数。以及活性染料。每隔一天更换一次培养基，以维持细胞浓度在每毫升50万个细胞。在第5天，计数并按照之前所述方法对第5天的培养物进行冷冻保存。第7天，用PBS洗涤500,000个细胞，并将细胞重悬于100 µL荧光激活细胞分选缓冲液中。然后，通过流式细胞术，使用荧光标记的抗CAR 19独特型抗体对CAR表面蛋白表达进行免疫染色检测。第九天，按照此前所述方法对第九天的培养物进行计数并冷冻保存。本研究检测了在X-Vivo培养过程中不同时间点收获的CAR T细胞的功能与效力。利用本视频所述方法，T细胞被激活并分别扩增三天或九天。根据此处所示的设门策略，通过检测细胞表面表达的不同糖蛋白的丰度来分析细胞的分化特征。在X-Vivo培养过程中，随时间推移可观察到细胞逐渐向效应表型分化。随后评估CAR T细胞在抗原刺激下的效应功能和增殖能力。培养时间较短的细胞在功能上优于长期大规模培养的细胞。在急性淋巴细胞白血病（ALL）的人源异种移植小鼠模型中，比较了在不同时间点收获的CAR T细胞的效力。培养9天的细胞表现出剂量依赖性的抗白血病反应，在高剂量（三百万个细胞）时可达到完全缓解；而在低剂量（50万个细胞）时则疗效丧失。然而，第3天的细胞在高剂量和低剂量下均表现出持续的肿瘤控制效果。这种反应与小鼠外周血中CAR-T 19细胞的绝对数量相关。总体而言，这些结果表明，较早收获的CAR T细胞优于较晚收获的细胞。在完成该操作步骤后，可进一步开展其他功能检测，例如海马分析，以测定其代谢特性，如耗氧量或线粒体应激能力。也可进行多轮重复刺激，以深入了解CAR T细胞的分化状态及其持久性。基于本研究工作，我们及其他研究人员正在开展研究，以进一步缩短培养过程。该方法还可扩展应用于其他肿瘤抗原的核心策略设计。在操作慢病毒时必须始终注意安全，即使所使用的慢病毒已被改造为不具备复制能力。

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

制造用于采用免疫疗法的奇美抗原受体（CAR）T细胞

本视频展示了一种制备嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术 离体...

一种用于制备嵌合抗原受体T细胞的离体技术

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。...

一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

我们描述了一种定量实时体外细胞裂解检测系统，用于评估靶向液体和实体肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞的杀伤效力。该方案可扩展用于评估其他免疫效应细胞以及联合治疗方法。...

一种针对实体瘤及血液系统癌细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法

人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备

本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。...

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

本方案概述了使用非整合型mRNA生成瞬时嵌合抗原受体（CAR）T细胞以用于癌症免疫治疗的详细步骤，并提供了评估CAR-T细胞及其细胞毒功能的可靠方法。...

一种利用mRNA生成非病毒性短暂嵌合抗原受体T细胞用于癌症免疫治疗的方法

本文介绍了一种制备双乳液滴的方法，该液滴包封单个T细胞和一个癌细胞靶标，用于在单细胞水平上研究细胞杀伤作用。该方法能够在大量T细胞中同时定量检测细胞毒性分子和靶细胞的凋亡情况。...

基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

本方案描述了原代T细胞培养的关键步骤，包括其分离、活化、扩增以及通过mRNA电穿孔进行的瞬时转染。此外，还提出了一套用于流式细胞术分析表型、活化标志物、细胞活力以及嵌合抗原受体（CAR）表达的实验流程和抗体组合。...

分离、培养及瞬时转染人原代T细胞以生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞

学习制备具有功能活性的嵌合抗原受体T细胞用于过继免疫治疗。该方法通过优化培养条件保持T细胞健康状态，避免终末分化或耗竭，从而提高CAR-T细胞的增殖能力和抗肿瘤功效。

制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

探索更多视频