制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

在输注后能够定植、扩增并具有细胞毒活性的功能性CAR T细胞产品的制备，是有效过继性免疫治疗的关键组成部分。例如，在实体瘤中，CAR T细胞能够浸润实体瘤并获得最佳的抗原刺激；然而，其在人体内的整体定植和扩增能力受到限制。该方法的主要优势在于，能够在不产生终末分化或耗竭T细胞的情况下，维持CAR T细胞的质量或分化状态，从而避免因细胞增殖能力下降或效应功能不佳而影响治疗效果。

该技术可能具有难度，因为T细胞对其细胞浓度、培养容器的表面积以及代谢需求非常敏感。本质上，在整个操作过程中都需要维持T细胞的良好状态，否则它们将无法生长。

开始此操作时，准备好6孔培养板。通过将新鲜或冻存的原代人T细胞与抗CD3和CD28磁珠按每3个磁珠对应1个T细胞的比例混合，激活T细胞。将T细胞在X-Vivo 15培养基中进行培养，培养基中需添加正常人AB型血清、L-谷氨酰胺、hepes和IL2。

扩增期间，以每毫升一百万个T细胞的浓度激活T细胞，并在37摄氏度、20%氧气、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养。经一夜刺激后，将慢病毒上清液加入已激活的T细胞中。

计算上清液的体积，以获得3至5之间的感染复数。继续在相同条件下培养细胞。第3天，收集用于冷冻保存的细胞代表性等分试样。

在冷冻保存之前，通过轻柔移液和磁力分离去除磁珠。准备含有0.5% DMSO的PBS冷冻培养基，并在4°C下保存，直至使用。

接下来，将T细胞在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，加入5 mL PBS。再次以300 × g离心5分钟，弃去PBS。

将沉淀重悬于1毫升冷的冷冻保存液中。将T细胞放入预冷的冻存容器中冷冻，并于-80摄氏度保存48小时。

此后，将冻存的细胞转移至液氮中。用 5 毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤剩余的 T 细胞一次，以去除任何残留的载体。在 300 × g 条件下离心 5 分钟。

然后，弃去 PBS，将细胞沉淀重悬于 T 细胞培养基中，浓度为每毫升 500,000 个细胞。将 T 细胞分入两份培养物中，分别标记为 45 和 9。使用计数微球及针对人 CD4 和 CD8 的单克隆抗体，通过流式细胞术对 T 细胞进行计数。

以及活性染料。每隔一天更换一次培养基，以维持细胞浓度在每毫升50万个细胞。在第5天，计数并按照之前所述方法对第5天的培养物进行冷冻保存。

第7天，用PBS洗涤500,000个细胞，并将细胞重悬于100 µL荧光激活细胞分选缓冲液中。然后，通过流式细胞术，使用荧光标记的抗CAR 19独特型抗体对CAR表面蛋白表达进行免疫染色检测。

第九天，按照此前所述方法对第九天的培养物进行计数并冷冻保存。本研究检测了在X-Vivo培养过程中不同时间点收获的CAR T细胞的功能与效力。利用本视频所述方法，T细胞被激活并分别扩增三天或九天。

根据此处所示的设门策略，通过检测细胞表面表达的不同糖蛋白的丰度来分析细胞的分化特征。在X-Vivo培养过程中，随时间推移可观察到细胞逐渐向效应表型分化。随后评估CAR T细胞在抗原刺激下的效应功能和增殖能力。

培养时间较短的细胞在功能上优于长期大规模培养的细胞。在急性淋巴细胞白血病（ALL）的人源异种移植小鼠模型中，比较了在不同时间点收获的CAR T细胞的效力。培养9天的细胞表现出剂量依赖性的抗白血病反应，在高剂量（三百万个细胞）时可达到完全缓解；而在低剂量（50万个细胞）时则疗效丧失。

然而，第3天的细胞在高剂量和低剂量下均表现出持续的肿瘤控制效果。这种反应与小鼠外周血中CAR-T 19细胞的绝对数量相关。总体而言，这些结果表明，较早收获的CAR T细胞优于较晚收获的细胞。

在完成该操作步骤后，可进一步开展其他功能检测，例如海马分析，以测定其代谢特性，如耗氧量或线粒体应激能力。也可进行多轮重复刺激，以深入了解CAR T细胞的分化状态及其持久性。基于本研究工作，我们及其他研究人员正在开展研究，以进一步缩短培养过程。

该方法还可扩展应用于其他肿瘤抗原的核心策略设计。在操作慢病毒时必须始终注意安全，即使所使用的慢病毒已被改造为不具备复制能力。