用于管状结构组织工程的核/壳打印支架

管状结构的制备是血管网络组织工程的一种有前景的方法，而血管网络的构建仍然是体外厚组织培养中的主要挑战之一。同轴喷射技术的主要优势在于能够一步法简单地制备中空纤维支架，从而缩短制备时间，并有望实现细胞的直接打印。配制具有合适黏弹性能的水凝胶，并维持芯层/壳层材料的持续平衡流动，对于稳定支架的3D打印至关重要。

首先，用新配制的水凝胶填充无菌的5 mL注射器。另取一支配备27号钝端针头的5 mL注射器，吸入新配制的交联溶液。组装核-壳喷嘴。

将G27平头针作为核心部件插入，并用螺丝固定针头。内针应从外层针管喷嘴突出约1 mm。将装有交联溶液的注射器连接至喷嘴内的G27针头，并将注射器装载到经乙醇消毒的3D打印机的其中一个挤出装置支架上。

将装有水凝胶的注射器安装到第二个挤出机上，并连接至喷嘴。使用鲁尔锁接头将一段短管连接至同轴喷嘴的侧向鲁尔接口。手动仔细调节对准位置，直至喷嘴轻轻接触表面，随后将喷嘴回撤至距离等于外喷嘴直径的位置。

导入生成的支架g代码，然后按“播放”以启动打印过程。打印完成后，小心取下带有打印支架的基底，并将二次交联溶液倒在整个支架上。在室温下孵育支架1分钟。

为将支架从基底上分离，轻轻横向拉动支架。如果支架与基底粘附较牢固，可在两者之间插入一个锋利的边缘以分离材料。将支架转移至一个新的容器中。

将支架两面分别进行紫外线灭菌，每面30分钟。然后将支架放入无色细胞培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少24小时。次日，在37摄氏度下用0.25%胰蛋白酶处理体外培养物5分钟，收获huvex细胞。

当细胞脱落后，加入 3 mL 新鲜细胞培养基以终止酶促反应，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于含酚红的新鲜培养基中，调整细胞浓度至每毫升 3.4 × 10⁵ 个内皮细胞。将细胞悬液装入带有 27 号针头的无菌 5 mL 注射器中，并在支架上选择一个进针位置。

将针头与支架丝的直线部分对齐，以较低角度小心刺入支架。确认针头已进入通道的中空丝内，轻轻按压推杆，将约1-2 mL细胞悬液注入支架中。悬液的流动应可通过半透明的支架观察到。

当整个支架完全填充细胞悬液后，将支架浸入新鲜的细胞培养基中，并放回细胞培养箱中培养最多10天。培养结束后如需进行活/死细胞成像，先用PBS冲洗支架，然后使用钝头针小心地将活/死细胞染色溶液注入支架内部。确认溶液已充满整个支架后，将支架置于37摄氏度环境中孵育30分钟。

孵育结束后，用 PBS 冲洗支架，并小心地将支架转移至载玻片上。随后可在荧光显微镜下观察支架中的染色细胞。在此新鲜打印并经后续处理的支架横截面中，可清晰观察到丝状结构内部存在中空通道。

即使在37摄氏度的细胞培养基中孵育72小时后，如图所示，该纤维在整个支架长度上仍保持中空结构。此处展示的是内皮细胞在支架内培养48小时后的代表性活/死染色实验结果。活细胞可通过其明亮的绿色荧光信号进行识别。

该技术是中空管状支架一步法制备的基础，可通过将细胞掺入生物墨水中进行直接打印而进一步升级。