Name: 极快速和特殊的代谢标签的RNA在Vivo与4-Thiouracil （Ers4tU） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: 学习使用4-硫尿嘧啶标记技术快速纯化酿酒酵母新合成RNA的方法。该方案可在15秒至5分钟内完成脉冲追踪实验，背景干扰低，适用于RNA动力学分析和基因表达研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了惠康基金会（Wellcome）对JB的资助[104648]。惠康细胞生物学中心的工作由惠康核心资助支持[092076]。作者感谢实验室成员Bella Maudlin、Emanuela Sani、Susanna De Lucas-Arias和Shiney George提供的帮助。作者还要感谢Patrick Cramer提供质粒YEpEBI31111。

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种极为快速且特异的4tU标记方案，可在标记仅15秒后从S. cerevisiae中有效回收新生的、新合成的RNA，并且未标记RNA的污染极低。
用户应始终注意通过使用低温环境和经DEPC处理的试剂来保持RNA的完整性。链霉亲和素磁珠纯化通常较为可靠；然而，磁珠缓冲液难以操作，必须新鲜配制，并按正确顺序加入各组分，且不能冷藏或高压灭菌。常见的问题包括RNA在沉淀步骤后未能完全溶解，从而导致在后续处理步骤中无法进行生物素标记或发生RNA丢失。补充材料中提供了详尽的故障排除指导。
在 ers4tU 中需注意一些局限性。其中一个已提及的局限性是 4tU 会减缓酵母的生长（图 1a）。除了内源性硫醇化 RNA9 外，仅能在标记期间转录的 RNA 可通过此方法纯化。在整个硫醇化期间停留在基因上的暂停聚合酶不会产生可被纯化的硫醇化转录本，但若聚合酶在硫醇化期间进入或退出暂停状态而产生部分标记的转录本，则仍可被回收。由于突变或培养条件导致转录效率较低的菌株产生的 nsRNA 较少，尽管如此，本文所用技术相较于其他方法仍可提高 nsRNA 的回收率。在这些菌株和条件下，可能需要更长的标记时间和更大的培养体积。请注意，尿嘧啶是良好的氮源，因此在开展涉及氮饥饿的研究前，应先对该方法进行预实验验证。
ers4tU 实验方案特别适用于短寿命 RNA 的分析，其中许多 RNA 降解速度极快，若不抑制其降解机制则无法被鉴定。这类 RNA 包括隐蔽不稳定转录本（cryptic unstable transcripts, CUTs）4、由提前终止或启动子近端暂停产生的短转录本18，以及在启动子上游区域反义转录产生的 PROMPTs（promoter upstream transcripts）19。在稳定 RNA 物种加工过程中产生的中间产物也具有瞬时性，但可通过 ers4tU 标记实现富集4。因此，ers4tU 实验方案的独特之处在于，能够在接近生理条件下对高度瞬时的 RNA 物种进行分析和捕获，这是相较于其他方法的一大优势。该技术已被用于研究 RNA 聚合酶突变体中的转录过程及下游 RNA 加工动力学，这些突变体的延伸速度较正常情况更快或更慢20。
硫醇化修饰也适用于RNA-seq和SLAM-seq21，能够对极短时间内产生的所有RNA进行极为精细的表征。

RNA具有动态特性；在转录产生后不久，大部分RNA会迅速被加工和降解。目前，大多数关于RNA代谢的研究分析的是细胞内的总RNA，这类RNA主要是已完全加工且处于稳态水平的分子。该稳态水平取决于转录速率、转录后成熟过程与降解速率之间的平衡。要分析达到稳态平衡的各个过程，则需要采用专门的技术来捕获寿命极短的RNA分子。
利用核苷酸类似物（如4-硫尿嘧啶（4tU）或4-硫尿苷（4sU））对RNA进行代谢标记（参见Duffy等人的优秀综述1），能够分离出硫标记的新生RNA及其加工中间产物。然而，已发表的实验方案通常需要数分钟的标记时间2,3，相对于许多转录本的生成速率而言较慢。转录一个平均长度的酵母基因大约需要一分钟，因此对酵母RNA进行短于一分钟的标记可被视为极短时间标记。极快速且特异性的4-硫尿嘧啶标记法（ers4tU）通过最大化4tU的掺入并最小化未标记的预存RNA的回收，显著提高了信噪比，从而使极短时间的标记成为可能4。
硫代修饰的碱基必须快速且足量地导入细胞，以高效标记新合成的RNA（nsRNA）。为此，需将细胞培养在无尿嘧啶的培养基中，并通过表达适当的通透酶来促进4tU或4sU的摄取（适合的通透酶基因载体列表见表1，相关补充信息见补充图1）。4tU可溶于氢氧化钠，因此无需使用其他核苷类似物所需的有毒有机溶剂。然而，已有研究发现，长时间使用浓度高于50 µM的硫代修饰核苷培养细胞会破坏核糖体结构5。但本实验所采用的浓度（10 µM）以及极短的标记时间可将不利影响降至最低5（图1a），同时仍能获得足量的RNA用于分析。
该技术可与快速且特异的生长素介导的目标蛋白降解方法6,7（图2）相结合，称为“β-est AID 4U&#34;方案，其中β-雌二醇调控的生长素诱导降解标签（AID）系统与4tU标记技术联合使用。采用β-est AID 4U方法，可实现目标蛋白的耗竭，并能密切监测其对RNA代谢的影响（图2）。实验时机至关重要；建议观看配套视频，并仔细参考图2及其动态形式（见补充图2）。
为了获得准确的时间分辨率，必须极快速地停止RNA的加工和降解过程。这可通过低温下的甲醇处理实现，甲醇能够非常迅速地固定细胞内容物并破坏细胞膜，同时保持核酸的完整性8。RNA提取过程应高效且不损伤RNA。在不存在变性剂的情况下，机械裂解是有效的方法（通常变性剂含有巯基，因此应避免使用）。优先选用氯化锂沉淀RNA，因为tRNA在此条件下的沉淀效率较低。tRNA转录迅速且天然含有硫修饰9，因此去除tRNA可减少其对生物素化试剂的竞争。如果研究目标是小分子、高度结构化的RNA，则推荐使用基于醇类的RNA沉淀方法。
为回收硫醇化RNA，可通过4tU掺入RNA的硫醇基团共价连接生物素。使用经修饰的生物素（通过可裂解的二硫键连接，例如HPDP-生物素（N-[6-(生物素酰胺)己基]马来酰亚胺））h乙基]-3´-(2´-p吡啶基dithio)propionamide 或 MTS-生物素（Methane thiosulfonate）是推荐的选择，因其可通过添加还原剂释放RNA。生物素标记的RNA通过与磁珠偶联的链霉亲和素进行亲和纯化。本方案与此前列出的其他方案类似10 但经过深入优化以降低背景信号。
可以进行两种类型的硫醇标记实验：连续标记和非连续标记。每种方法都有其各自的优势。在连续标记实验中，将4tU加入培养物中，并定期取样。此类实验可显示RNA的加工过程以及随时间推移RNA水平的变化情况。例如，突变体与野生型的比较实验以及脉冲-追踪实验均属于此类。如图3b,c所示的实验即为此类。在非连续标记实验中，首先在系统中诱导某种变化，然后监测RNA的变化。一旦诱导发生变化，必须将培养物分成若干个亚培养物，并在特定时间点对每个亚培养物进行短暂的硫醇标记。一个例子是如图27所示的β-est AID 4U实验。此类实验特别适用于监测代谢变化对RNA加工的影响（见图3d）。
硫代标记实验的图示见图4和图5，此外还提供了一个可极大简化实验流程操作的电子表格（见4tU experiment template.xlsx）。同时，补充信息中包含详细的故障排除指南。对于将4tU标记与生长素诱导降解（AID）技术结合的β-est AID 4U实验方案，请参见图2和Supplementary Figure 2。有关详细的AID降解方案，请参见Barrass等人的文献7。

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇（&amp;beta;ME</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>警告：有毒。储备液浓度约为 14 M，配制时需注意 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt; 稀释后使用</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td><td>警告：有毒</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>添加 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;1000&lt;/sub&gt; 加液体至溶液中，室温放置24小时，然后高压灭菌</td></tr><tr><td>DMF（N,N-二甲基甲酰胺）</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>警告：有毒</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>用氢氧化钠调节至0.5 M并调pH至8.0</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP 生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21341</td><td>避光保存。将所有瓶内物质溶于22.7 mL DMF中（配制成4 mM储备液）。避免接触水分，置于暗处保存。 &amp;和 -20 &amp;deg;C. 使用前检查溶液，因为部分批次的 HPDP 在储存过程中可能产生沉淀；可在 42℃ 加热溶解 &amp;deg;C 下重悬。</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>糖原 [20 mg/mL]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10901393001</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>固定化TCEP二硫键还原凝胶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>77712</td><td>可选</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 M 溶液。注意：溶解过程中会剧烈放热，温度可能超过 100 ℃ 甚至沸腾 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C，将LiCl晶体缓慢加入水中。</td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 M 溶液。注意：溶解过程中会剧烈放热，温度可能超过 100 ℃并发生沸腾 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C，加入 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 缓慢地将晶体加入水中。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>警告：有毒且易燃</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>分别配制1 M的溶液，然后等量混合，以获得适当pH的溶液</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>5 M 溶液</td></tr><tr><td>苯酚，低pH。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>避光保存于 4 &amp;deg;C. 注意：有毒</td></tr><tr><td>酚-氯仿 5:1（125:24:1），低pH&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>4℃避光保存 &amp;deg;C. 注意：有毒</td></tr><tr><td>Pierce 离心柱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>69702</td><td>可选</td></tr><tr><td>SCSM 单细胞单基因缺失 &amp;ndash;ura</td><td>Formedium&amp;nbsp;</td><td>DSCS101</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>配制3 M溶液，并用乙酸调节pH至5.3</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>警告：腐蚀性</td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>警告：有刺激性，切勿吸入</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>4°C 下保存&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERase-In，RNase抑制剂</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>AM2696</td><td>-20℃保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>巯基化 &lt;em&gt;裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）&lt;/em&gt; 用于 spike</td><td></td><td></td><td>参见方案第1.7节</td></tr><tr><td>4-硫代尿嘧啶（4tU）&amp;nbsp;</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>359930010</td><td>避光保存。用1 M NaOH配制100 mM储存液，溶液于-20 ℃保存。&amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>不同 pH 条件下的 1 M 溶液</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5 mg/ml，于 -20 ℃ 保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>在 H 中配制 1 M 溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 分装为2 mL等份，于-20 °C保存。</td></tr><tr><td>无氨基酸酵母氮源基础培养基&amp;nbsp; 硫酸铵</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba脱盐柱 0.5 ml</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89882</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氧化锆珠</td><td>Thistle Scientific</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器与耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>珠磨机</td><td>生物样本</td><td>112011EUR</td><td>可使用其他均质器；必须为每种均质器和菌株确定合适的条件。</td></tr><tr><td>使用Agilent Bioanalyzer或类似仪器评估RNA质量。若无需评估质量，可使用分光光度计对RNA进行定量。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机：能够以 4,000 × g 离心培养物 &amp;deg;4°C 且至少 3000 × g。如可能，预先冷却。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机：可旋转容量达 2 mL 的离心管，转速范围为 1000 g 至 13,000 g&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于将磁珠与样本分离的磁力架。文中所用为3D打印磁力架，可从Thingiverse获取（thing:3562952）。亦存在 commercially available racks&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带有加热盖的PCR仪，可在避光条件下进行孵育。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转轮以使1.5 mL离心管翻滚旋转&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>建议使用振荡加热块（如 Eppendorf Thermomixer）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管，低吸附，RNase-free 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>离心管，低吸附，无RN酶，1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL离心管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>其他离心管不具备防气体渗透性能，允许CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 用甲醇溶解后，加入温热的培养物会剧烈析出沉淀，导致样品损失</td></tr><tr><td>15 mL离心管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 螺口管</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 八联管（带一体式管盖）</td><td>品牌</td><td>781332</td><td></td></tr></tbody></table>

体内利用4-硫尿嘧啶进行极快速且特异的rna代谢标记（ers4tu）

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

核酸类似物4-硫尿嘧啶（4tU）可被细胞快速摄取，并在体内转录过程中掺入RNA中, 通过将生物素基团连接到掺入的硫代基团上，并利用链霉亲和素包被的磁珠进行亲和纯化，从而实现对短时间标记期间所产生的RNA的分离。获得高产量且不含预先存在RNA的纯净新生RNA，使得更短的标记时间成为可能，并提高了动力学研究的时间分辨率。本方案适用于新生RNA的高特异性、高得率纯化。本文所述方案详细介绍了从酵母中提取RNA的方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 然而，一旦从细胞中提取出总RNA，该硫醇化RNA的纯化方案应适用于来自任何生物体的RNA。所获得的纯化RNA可用于多种常用技术进行分析，如逆转录-qPCR、RNA-seq和SLAM-seq。该技术具有高度的特异性、灵敏性和灵活性，可为RNA代谢研究提供前所未有的深入见解。

使用本ers4tU方案回收nsRNA的典型产量如图1b所示，该图由生物分析仪生成，图中曲线显示了RNA产量与其大小（核苷酸[nt]）的关系。请注意，在生物分析仪曲线及插图中的小图中，0时间点回收的RNA量远小于较长时间点回收的RNA量——从约109个细胞中仅回收到约0.3 µg RNA，而相同数量的细胞在标记30秒后即可回收超过两倍的RNA（0.8 µg nsRNA）。15秒时间点的RNA回收量变异性较大，因为取样操作中的微小差异会对RNA回收量产生相对更大的影响。在生物分析仪曲线中，rRNA前体表现为接近1000 nt处的一个峰以及1700−1800 nt处的双峰。随着硫醇化反应的进行，这些中间产物的丰度逐渐增加。
采用硫醇标记法对 ACT1 转录本的剪接进行定量分析（图3）。在开始硫醇标记后，每隔15秒取样，检测 ACT1 RNA 的加工过程（图3a、b）。如图所示，即使仅标记15秒，仍可观察到前体mRNA（通过转录生成）以及套索结构（由前体mRNA剪接的第一步反应生成）。大约在45秒至1分钟时，套索结构和前体mRNA的含量达到平衡状态，其由转录生成的量与通过剪接被加工清除的量相当。
为获得 图3c 所示数据，对该菌株用4tU脉冲标记25秒，随后用尿苷进行追踪。前体mRNA和套索RNA的生成在1分钟时达到峰值。这与 图3b 的结果吻合良好；达到平衡所需时间约为45秒，加上标记的25秒。在达到峰值后，随着硫代标记的RNA经过剪接过程被追踪，其水平逐渐下降。
图3d展示了利用β-雌二醇诱导降解（β-est AID 4U）系统对一种剪接因子蛋白进行耗竭及其对RNA代谢的影响6,7。在此系统中，Prp16p的水平在耗竭25分钟后从接近生理水平下降至原有水平的5%。Prp16p是剪接第二步所必需的剪接因子15。套索RNA（lariats）通常在剪接的第二步被去除（图3a），但当Prp16p变得不足时，套索RNA的积累量超过了前体mRNA的水平。在更长的耗竭时间后，由于次级效应，其他因子也相继变得不足，导致套索RNA水平下降，而前体mRNA水平上升。剪接后的成熟mRNA水平则下降。
<img alt="4tU 对酵母生长的影响；nsRNA 回收率与硫醇化时间的关系柱状图；光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：4tU 中的生长情况及 RNA 回收。 (a) 4-硫代尿嘧啶影响细胞生长。在不含尿嘧啶的 YMM 缺陷型培养基中增加 4tU 浓度，会导致携带 p4FuiΔPEST 质粒的 S. cerevisiae (BY4741) 增加倍增时间。在 Tecan Infinite Pro 200 仪器中于 30 °C 下监测四组重复培养物的生长情况。所有培养物在整个实验过程中均处于对数生长期，OD600 介于 0.1 至 0.6 之间。Mock 组为对照组，加入等量 NaOH，其本身不改变生长速率。该图表明，硫醇标记需在快速标记与细胞损伤之间进行权衡。误差线表示四次重复实验的标准误。(b) 新合成 RNA（nsRNA）的产量自约 15 秒标记时间起呈线性增加。主图显示了在加入 4tU 后，每隔 15 秒至 2 分钟内纯化的 nsRNA 的生物分析仪图谱（从 0 秒即未硫醇化样本开始）。注意 15 秒样本未显示，因其与未标记样本无法区分。两个主要峰对应核糖体 RNA（rRNA）。rRNA 前体和中间产物表现为分子量高于成熟 rRNA 的多个小峰，其回收量随时间增加而上升。图中展示的是一个代表性实验的结果。插图显示随着 4tU 孵育时间延长，nsRNA 回收量的变化。随着 4tU 培养时间增加，nsRNA 产量也随之提高。在整个实验时间范围内，回收量呈现显著线性关系（R2 = 0.934），即使在 15 秒标记时，nsRNA 回收量已略高于背景水平，尽管在生物分析仪图谱上肉眼无法与未标记样本区分。误差线表示三次生物学重复实验的标准误。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡实验流程示意图；展示β-雌二醇、生长素、4tU培养方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：β-est AID 4U β-est AID 4U 图文实验方案。 本图展示了β-est AID 4U实验方案的图解概要。β-雌二醇（β-est）可促进生长素诱导型降解决定子（AID）系统的表达，从而导致带有AID*标签的目标蛋白被降解，详细方案请参见Barrass等人的研究7。在此方案中，降解决定子系统的表达在蛋白降解开始前25分钟启动，每个时间点的硫醇化处理持续1分钟。样品在诱导前以及降解过程中每2分钟采集一次。动画版本见补充图2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示 ACT1 RNA 前体、中间体和产物水平的 RNA 剪接过程示意图与图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：ACT1 RNA 剪接的前体与中间产物。通过定量反转录 PCR 监测 ACT1 前体 mRNA 转录本的剪接过程16。图中显示了 ACT1 前体（pre-mRNA）、中间体套索-外显子2（Lariat）和剪接产物（mRNA）的水平，均以 ACT1 外显子2的水平以及这些RNA的稳态水平进行归一化。(a) qPCR 产物在 ACT1 转录本上的位置。ACT1 转录本剪接反应中用于检测前体、中间体和产物水平的 qPCR 产物位置示意图16。外显子用方框表示，内含子用线条表示，qPCR 产物用两端带菱形的线表示，其颜色与图中使用的颜色一致。pre-mRNA PCR 特异性识别 pre-mRNA，不识别任何剪接中间体，因为该产物跨越了剪接第一步后即被破坏的分支点。Lariat PCR 可检测剪接第一步的产物以及第二步后被切除的套索结构。mRNA PCR 特异性识别剪接产物 mRNA。外显子 PCR 的结果（存在于所有前体、中间体和产物中，但被切除的套索除外）未在图中显示，因其用于数据归一化，故其值恒为1。(b) 连续硫代标记。随着4tU在转录过程中被掺入，pre-mRNA 的量随时间增加，经过短暂延迟后，剪接将其转化为套索-外显子2中间体和剪接产物。在仅15秒的4tU培养后，这些 pre-mRNA 和套索物种的水平即可高于背景值，并在约45秒的连续4tU标记后达到峰值，此时其生成速率与向剪接mRNA的转化或降解速率达到平衡。数值已归一化至其稳态水平（图中最左侧点），并与外显子2水平进行比较，以显示其出现和加工过程相对于外显子2转录的情况。由于 ACT1 的RNA剪接主要是共转录进行的4,17，剪接后的mRNA迅速成为最丰富的物种，其水平与外显子2相近。误差棒为三次生物学重复实验的标准误差，每次实验均设三个技术重复。(c) 脉冲/追踪实验。进行25秒硫代标记脉冲后，用尿苷进行追踪。与这些RNA的稳态水平（最左侧点）相比，它们在新合成的RNA池中初始含量非常高。随着被加工为mRNA（或降解），其水平逐渐下降，在5分钟时接近稳态水平。误差棒为三次生物学重复实验的标准误差，每次实验均设三个技术重复。(d) nsRNA 和蛋白质耗竭实验。采用与图 (a) 相同的方法，通过定量反转录PCR监测在使用生长素降解系统耗竭Prp16蛋白后 ACT1 前体mRNA转录本的剪接情况，如 图 2 所述。Prp16蛋白水平也在图中以右侧Y轴绘制，表示相对于生长素处理前水平的百分比。Prp16是剪接体的重要组分，尤其在剪接第二步（见图 a）中起关键作用，此步骤之后套索结构被降解。当该步骤受限时，套索结构最初会积累；在后期时间点，剪接完全失败，不再产生套索结构，pre-mRNA 水平上升。误差棒为三次生物学重复实验的标准误差，每次实验均设三个技术重复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA 准备和生物素化示意图，显示硫代标记和离心步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：方案第 1 至第 3 部分的图示总结。 细胞用 4tU 进行硫代修饰，并继续培养以将修饰后的核苷酸掺入 RNA 中。可加入硫代标记的 S. pombe 内参 spike，用于不同时间点和实验之间的归一化处理。可通过加入未硫代的尿苷对 4tU 的脉冲标记进行追踪。标记可从添加 4tU 开始持续进行，也可在改变培养条件后开始：将培养物分装，并在培养条件改变后的不同时间点向各培养物中依次加入 4tU，但每次标记时间均较短。收集细胞后，从细胞中提取 RNA，建议使用匀浆器和基于苯酚的方法。随后对 RNA 进行生物素标记，并通过尺寸排阻柱去除未掺入的游离生物素，从而纯化生物素化的 RNA。此时，新生 RNA（nsRNA）已准备好用于链霉亲和素磁珠纯化（第 4 部分，图 5）。红色数字对应于方案中的步骤编号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用链霉亲和素磁珠进行RNA纯化的流程；详细描述实验工作流程的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：第4节实验方案的图示总结。 在完成第1至第3节（图4）后，先对链霉亲和素磁珠进行封闭，然后将生物素标记的RNA样品加入已准备好的磁珠中。生物素化的RNA会结合到链霉亲和素磁珠上，未生物素化的RNA则被去除并通过洗涤清除。随后使用β-巯基乙醇（βME）将生物素化RNA从磁珠上洗脱，并进行沉淀，以备后续研究使用。图中红色数字对应实验方案中的步骤编号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充图1：在硫标记1分钟和3分钟时，含有或不含额外导入蛋白拷贝的酵母细胞中nsRNA回收效率的改善。请注意，Fui1 是由2 µm质粒表达的酵母自身启动子。这两个菌株均含有该基因的基因组拷贝。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：β-est AID 4U β-est AID 4U 图文实验方案的动画版本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：4tU_experiment_template.xltx。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">请点击此处下载该文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>质粒名称</td>
			<td>转运蛋白/通透酶</td>
			<td>标记基因</td>
			<td>备注</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p4Fui</td>
			<td>S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 可转运尿嘧啶和尿苷，因此非常适合用于脉冲-追踪实验。</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAT2</td>
			<td>S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Fui1 的 PEST 结构域已被失活，因此当细胞内尿嘧啶充足时，该通透酶不会被降解。在标记实验中表现良好，并可提高脉冲-追踪实验的性能。</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p4Fur</td>
			<td>S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>尿嘧啶通透酶</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. Sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller 等人11。该质粒还含有 HSV 胸苷激酶基因。</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（平衡型核苷转运蛋白）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">所有质粒均为基于 2 µm 的载体。所有 p4 质粒和 pAT 质粒均基于 pRS16 系列质粒。FUI1 和 FUR4 均由其自身的内源启动子驱动表达。</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案所使用的质粒。

利用硫代尿嘧啶从酵母Saccharomyces cerevisiae中灵敏且特异性地纯化新转录的RNA。

体内利用4-硫尿嘧啶进行极快速且特异的RNA代谢标记（Ers4tU）

核苷酸类似物4-硫尿嘧啶（4tU）可被细胞快速摄取，并在体内转录过程中掺入RNA，从而实现……

该方法具有重要意义，因为目前尚无其他方案能够在如此短的时间尺度内分析新合成的RNA，也难以在如此短暂的脉冲标记下进行脉冲追踪实验。该方案与蛋白质耗竭技术（如Best AID 4U方案）联用效果良好。其主要优势在于背景信号较低。这可以通过去除几乎所有未硫醇化的RNA来实现较短的标记时间。书面方案还详细介绍了可进行的多种不同类型的实验，以及如何将这些实验整合到该技术中。开始此操作时，将酵母在YMM培养基中培养至OD 600在0.6至0.8之间。在通风橱中，向一个50毫升离心管中加入相当于目标样品体积30%至50%的甲醇。将离心管盖紧，做好标记，并置于干冰上冷却。接着，标记两个用于长期储存样品的离心管，并将其放在冰上预冷。向2毫升离心管中加入氧化锆珠。每份样品至少取1毫升水置于冰上预冷。若需向培养物中添加S.pombe内参，将一份巯基化S.pombe细胞置于冰上解冻。涡旋混匀解冻的等分试样，并将其加入培养物中。然后向培养物中加入4tU，使其终浓度为10 µM，并剧烈混匀。硫代标记时间控制在15秒至5分钟之间。在时间进程结束前定期取样。将每个样品加入含有甲醇的预冷离心管中。密封各管，充分振荡混匀，然后置于干冰上。所有样品采集完毕后，立即将其全部置于冰上。确保样品均未冻结。若发现有样品冻结，需将其在手中轻轻温热，同时持续倒置。在 4 °C 条件下，以 3,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。倒去上清液，并通过反复吹打，将沉淀重悬于至少 1 毫升预冷的冰水中。将悬液转移至已准备好的螺旋盖管中，并将试管置于冰上。将样品在转速大于13,000 ×g的条件下短暂离心，以重新沉淀细胞。然后将样品放回冰上，去除上清液。首先加入400 µL AE缓冲液、40 µL SDS和800 µL低pH苯酚。通过涡旋振荡10秒重新悬浮。然后在最低功率设置下，使用匀浆器对细胞进行裂解，每次匀浆2分钟，共进行三次，每次之间将样品置于冰上静置2分钟。将裂解的细胞置于干冰上五分钟，直至完全凝固。接着，使用微量离心机在室温下以超过13,000 ×g的转速离心五分钟。随后，按照文本方案中所述步骤进行苯酚-氯仿抽提和氯仿抽提。加入相当于1/3至1/2体积的10摩尔氯化锂，混匀以沉淀RNA。在超过13,000 ×g的条件下离心5分钟。弃去上清液，并短暂再次离心样品以去除残渣。然后，用 300 至 500 微升 70% 乙醇洗涤沉淀。短暂离心洗涤后的沉淀，并除去残留的乙醇。将 RNA 沉淀在 90 微升 pH 7.0 的 TE 缓冲液中重新溶解，同时在 65 摄氏度下加热并振荡。确认RNA完全溶解后，将悬液转移至0.2毫升离心管中。首先，通过向RNA中加入10微升HPDP-生物素溶液并充分混匀，进行生物素标记。在65摄氏度避光孵育15至30分钟。接下来，准备一个装有少量凝胶体积的排阻层析柱，以去除未结合的生物素。取下层析柱底部的标签，松开盖子，并将层析柱放入一个 2 毫升离心管中。在 1,500 × g 离心 1 分钟，以冲洗出缓冲液，并弃去流出液。然后在柱子顶部轻轻加入 0.3 毫升 TE，使用相同条件再次离心。将洗涤后的柱子转移至一个新的 1.5 毫升离心管中。当样品孵育完成后，将样品加至柱子顶部。在1,500 × g离心两分钟，使生物素标记的RNA样品留在管底。弃去层析柱。向含有样品的管中加入1/3至1/2体积的10 mol/L氯化锂溶液。混合以重新沉淀RNA。首先，将RNA重新溶解于200 µL经DEPC处理的水中。测定RNA浓度，并计算各样品所需的体积，以确保所有样品中的RNA量相等。将此量的RNA加入新离心管中，并加入DEPC处理的水，使总体积补至200 µL。当样品处于室温时，加入25 µL 10× NaTM缓冲液、25 µL 1 mol/L磷酸钠溶液和2.5 µL 10% SDS。充分混匀后，在约100 × g条件下短暂离心，时间少于30秒。为每个样品准备两毫升珠缓冲液，其中包含一倍浓度的 NaTM 缓冲液、0.1 摩尔的磷酸钠以及 0.1% 的 SDS。向一个低吸附的 1.5 毫升离心管中加入 50 微升链霉亲和素磁珠。将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠完全沉降。然后，通过抽吸去除液体。洗涤磁珠时，加入200毫升磁珠缓冲液，涡旋振荡直至磁珠完全重悬。将离心管在约100 × g条件下离心，时间不超过5秒。将离心管置于磁力架上，使磁珠被磁铁吸附。若样本数量较少，可通过抽吸去除上清液；若样本数量较多，可先倾倒上清液，再进行抽吸。用 200 微升珠缓冲液、10 微升糖原和 2.5 微升 tRNA 封闭。室温下温和旋转（上下翻转）孵育 20 分钟。随后，移除液体，并按照文本方案中所述再次洗涤。将珠子重悬于样品中，在室温下旋转孵育30分钟。孵育期间，为每个样品准备一个新的1.5毫升离心管。加入1/10体积的pH 5.3的3摩尔乙酸钠溶液和20微克糖原。在约100 × g条件下离心三秒钟。移除未结合的RNA，并按照文本方案中所述步骤洗涤磁珠。为洗脱RNA，向磁珠中加入50 µL新配制的0.7 mol/L β-巯基乙醇。涡旋振荡并离心后，将裂解液置于磁力架上。用移液器将含有RNA的溶液转移至预先准备好的1.5毫升离心管中。按前述方法再次洗脱。然后，将样品重新放回磁力架中，以去除洗脱RNA中的残留磁珠，并将液体转移至新的低吸附0.5毫升离心管中。混匀样品，随后加入2.5倍体积的乙醇以沉淀nsRNA。混合并孵育后，在4°C条件下以至少13,000 ×g的转速离心20分钟。使用本方案回收snRNA的典型产量如下所示。请注意，零时间点的RNA回收量远低于较长时间点的回收量，从约300亿个细胞中仅回收到0.3 µg RNA。然而，仅标记30秒后，从相同数量的细胞中收集到的RNA量即超过两倍。在生物分析仪图谱中，我们的RNA前体表现为接近1,000个核苷酸处的一个峰，以及1,700至1,800个核苷酸处的双峰。随着硫醇化反应的进行，这些中间产物的丰度逐渐增加。随后进行巯基化反应，从硫代标记开始后每隔15秒取样，监测ACT1 RNA转录本的加工过程。可以看出，即使仅标记15秒，前体mRNA和套索结构（lariats）均已生成。大约45秒至1分钟后，前体mRNA和套索RNA的生成量与通过剪接被加工清除的量达到平衡状态。最困难的步骤涉及磁珠的操作、洗涤和封闭。需小心避免丢失磁珠，或让磁珠干燥。一旦纯化得到新合成的 RNA，即可采用任何传统的 RNA 分析方法。建议您使用生物分析仪或类似设备对 RNA 进行检测。之后，我们通常采用 QPCR 和 RNA-Seq 对 RNA 进行分析。该方法被证明非常适合分析 RNA 加工的动力学过程。最危险的步骤是在RNA提取过程中使用苯酚和氯仿。每次在未密封的容器中使用这些化学品时，都必须在通风橱中操作，并穿戴适当的防护服、实验服和手套。特别需要注意的是，螺口管的螺纹处不得有氧化锆珠，否则会导致泄漏。

extremely-rapid-specific-metabolic-labelling-rna-vivo-with-4

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

极快速和特殊的代谢标签的RNA在Vivo与4-Thiouracil （Ers4tU）

RNA转录本受到多种反式作用的RNA结合蛋白（RBPs）介导的广泛转录后调控。本文介绍一种可普遍应用的方法，用于精确且在全转录组范围内鉴定RBPs的RNA结合位点。...

PAR-CliP——一种用于鉴定RNA结合蛋白转录组范围结合位点的方法

总细胞RNA作为研究RNA合成与降解的短期变化以及RNA加工动力学的模板效果较差。本文介绍了一种利用4-硫代尿苷对新转录RNA进行代谢标记，随后通过巯基特异性生物素化并纯化新转录RNA的方法，从而克服上述局限性。...

细胞培养中新生转录RNA的代谢标记：用于高分辨率RNA合成、加工与降解的基因表达谱分析

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

我们介绍一种名为SPOt（tRNA简化分析平台，Streamlined Platform for Observing...

利用宏阵列对转运RNA进行代谢标记与分析

该方法可用于测量RNA合成。将5-溴尿苷加入细胞中，并掺入新合成的RNA。通过标记后立即提取RNA，随后对标记的RNA进行针对5-溴尿苷的免疫沉淀，并通过逆转录和定量聚合酶链式反应分析，从而测定RNA合成水平。...

利用5-溴尿苷标记与免疫沉淀法研究RNA合成

本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。...

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

本文介绍了在长链RNA的末端位置进行双色标记，并通过将其包裹在磷脂囊泡中实现表面固定，从而应用于单分子FRET全内反射荧光显微镜检测。结合这些技术可实现对RNA动态行为在单分子水平上的精确可视化与分析。...

长RNA的荧光末端标记与封装用于单分子FRET-TIRF显微镜观察

本方案描述了使用定制的便携式FRET分析仪对荧光共振能量转移（FRET）传感器数据进行快速且高灵敏度定量的方法。该设备用于在可最大化检测灵敏度的关键温度范围内检测麦芽糖，从而实现对糖含量的实用且高效的评估。...

高灵敏度快速荧光检测结合便携式FRET分析仪

在传统的基于移液头的连续稀释过程中，多肽吸附到塑料器皿上会显著影响活性测定结果，并干扰对药物发现过程中先导化合物筛选和优化阶段所依赖的构效关系的理解。本文描述了多肽样品自动化声学非接触式连续稀释的方法。...

用于肽类激动剂效价测定实验中系列稀释的自动化声波移液技术

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

学习使用4-硫尿嘧啶标记技术快速纯化酿酒酵母新合成RNA的方法。该方案可在15秒至5分钟内完成脉冲追踪实验，背景干扰低，适用于RNA动力学分析和基因表达研究。

体内利用4-硫尿嘧啶进行极快速且特异的RNA代谢标记（Ers4tU）

探索更多视频