使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

本方案具有重要意义，因为使用冷冻组织在评估多种组织时可简化物流流程，允许将样品转移至远程实验室进行分析，并可将组织分析的决策推迟数月。该技术的主要优势在于，使用冷冻组织块无需在解剖时依赖经过彗星试验培训的人员，同时最大限度地减少了样品操作过程中可能引入的技术误差和机械性DNA损伤。该技术可应用于临床前药物开发、进入环境的化学品安全性评价以及食品添加剂的安全性评估。

冷冻组织可用于彗星试验，以评估基因毒性潜力、DNA修复能力、对化疗或放疗诱导的DNA损伤的保护作用，以及用于环境生物监测。理想情况下，实验设计应确保在处理下一个动物的器官之前，每个组织样本均可完成至冷冻步骤的处理流程。冷冻组织可用于彗星试验，以评估基因毒性潜力、DNA修复能力、对化疗或放疗诱导的DNA损伤的保护作用，以及用于环境生物监测。

技术培训师 Carole Bobbitt 和调查毒理学实验室经理 Eileen Gilas 将担任今天的剖检员。研究助理 Lincoln Martin 和组织学技术员 Amelie Ladesseur 将演示样本处理。开始此操作时，需从目标器官上移除所有附着的结缔组织、器官及其他碎屑。

立即将器官在含有约七毫升冰冷、新鲜配制的剪切溶液的中等大小称量皿中用力振荡，以去除残留血液和碎片。将器官转移至另一含有足够冰冷剪切溶液的洁净称量皿中，使组织保持浸没状态，并置于冰上直至进一步处理。对于肝脏，取左侧叶的五毫米纵向切片，轻轻在约七毫升冰冷剪切溶液中振荡清洗。

然后将组织条放入一个洁净的中等大小称量皿中，皿内含有约七毫升冷剪切液，并置于冰上保存，直至准备进行后续处理。取一段肝脏组织放入包埋盒中。根据实验室常规标准操作程序进行固定、修块和石蜡包埋，以备将来可能进行的组织病理学评估。

对于十二指肠，剪取靠近胃部的10毫米段。在一端插入21至25号针头，用1毫升冷剪切液冲洗以去除任何碎屑和细菌。将十二指肠翻转，再次用另一毫升剪切液冲洗，并弃去针头。

将十二指肠切开，并用约七毫升的剪切溶液冲洗。再次冲洗十二指肠，并将其置于冰上的剪切溶液中保存，直至准备进行后续处理。取部分剩余的十二指肠组织，按照先前所述肝脏处理方法进行切割并固定，以备将来可能进行的组织病理学评估。

对于脑组织，可先将脑分为两个半球，其中一个半球保留以备可能的组织病理学检查。分离出感兴趣的脑区后，轻轻冲洗，并将其置于切碎液中冰上保存，直至按前述肝脏和十二指肠的方法进行后续处理。对于胃组织，去除并弃去前胃部分。

切开腺胃，将其置于含有约七毫升冷切碎缓冲液的中型称量皿中，轻轻晃动以彻底清除食物残渣。在靠近十二指肠处取一段五毫米宽的腺胃组织条，用于固定，以便后续可能进行的组织病理学评估，操作方法如前所述。将剩余的腺胃组织放入另一个含有约七毫升冷切碎缓冲液的中型称量皿中，冰上孵育15至30分钟。

此后，将胃转移至一块干净的石蜡纸上，使用手术刀片或塑料细胞刮刀轻轻刮擦表面上皮至少两次，以去除碎片。用镊子夹起胃黏膜，用移液器加入一毫升冷剪切缓冲液进行冲洗。将冲洗后的胃组织转移至干净的表面或培养皿中，并加入冷剪切溶液。

使用手术刀背侧或塑料细胞刮刀小心刮取胃上皮组织4到5次，以释放细胞。然后用移液器收集含有已释放细胞的剪切液，并转移至预冷的微量离心管中。对于组织样本的剪切，取一段肝脏、脑组织或十二指肠，剪下后转移至含有1 mL冷剪切液的已标记微量离心管中。

使用剪刀快速剪切样本，直至其完全分散，同时确保样本保持低温。样本应呈现轻微浑浊状。然而，通常会有一些小块残留，沉降至管底。

为了在组织新鲜时立即使用，请将装有样本的试管置于冰上保存。如需冷冻组织样本，在切碎或收集后立即拧紧试管盖，并将试管放入装有液氮的杜瓦瓶中。组织收获结束后，使用勺子取出样本试管，并将其放置在干冰上进行分拣。

将试管转移至盛有干冰的冻存盒中，并将冻存盒置于零下80摄氏度的冰箱中保存。为制备组织冻块，切取数个小块组织，分别直接投入盛有液氮的中等大小称量舟或其他合适容器中，浸泡数秒钟。待组织块完全冻结后，将冻结的组织块逐一转移至预冷的、标记好的微量离心管或冻存管中，操作过程需在干冰上进行。

组织收获结束后，将试管转移至盛有干冰的冻存盒中，并将冻存盒置于–80 °C 超低温冰箱中保存。若使用置于湿冰上保存的新鲜切碎或刮取的组织，应在收获后1小时内制备彗星凝胶电泳载玻片。若使用冷冻的切碎或刮取组织，则将装有冷冻组织的试管放入室温水浴中，直至样品完全解冻，同时确保组织始终保持低温状态。

样本解冻后，立即将离心管置于冰上。对于切成小块的组织，从冷冻箱中取出含有组织块的离心管，并在干冰上保存，直至进行切片制备。为每个样品取1毫升商业培养基或剪碎液，分装至已标记的1.7毫升微量离心管中，并置于冰上保存。

为避免组织融化，请迅速操作，将一块组织放入室温组织剪切装置的开口端。迅速插入与装置匹配尺寸的注射器推杆，将组织推入装置的滤网端，并将滤网端立即放入含有冷剪切液的微量离心管中。将装置的滤网端浸入冷剪切液中约5至10秒，使组织完全解冻。

完全按下柱塞，直至观察到细胞从筛网孔中挤出。然后将柱塞向上拉起约2.5厘米，再彻底压下。重复数次，直至匀浆液变得浑浊。

制备载玻片时，轻轻混匀细胞悬液，取 50 微升加入含有 450 微升 37 摄氏度的 0.5% 低熔点琼脂糖的离心管中。按照文本方案中所述的方法制备并标记载玻片。在第一项研究中，分别采集了两组雄性 Sprague Dawley 大鼠（溶剂对照组）的肝脏组织，两组之间间隔一周。

切片由新鲜切碎的组织、冷冻切碎的组织和冷冻成块状的组织制备。由于 OECD 推荐的新鲜大鼠肝脏尾 DNA 百分比上限为 6%，这些结果表明，任何一种冷冻方法均可有效用于组织评估。总体而言，刺猬细胞百分比与尾 DNA 百分比趋势一致，但冷冻组织表现出更大的变异性。

在第二项研究中，向雌性B6C3F1小鼠给予溶剂或致突变物乙基甲烷磺酸盐。尾部DNA百分比结果显示，将肝脏组织冷冻成方块后，再使用组织切碎装置进行处理，所得结果与新鲜切碎组织处理的结果非常相似。采用三种方法处理的组织样本中，均检测到EMS诱导的DNA损伤显著增加。

在第三项研究中，分析了来自为期90天的化学毒性研究中雌性B6C3F1小鼠的肝脏样本。在所有剂量组中，冷冻切碎组织中的DNA损伤水平均较高，且个体间差异显著。尾部DNA百分比结果与刺猬样细胞百分比呈正相关，表明刺猬样细胞对这些样本中观察到的高水平DNA损伤有重要贡献。

相比之下，在与切碎组织样本平行制备的速冻立方体组织中，DNA损伤细胞和“刺猬”细胞的比例均非常低。因此，在切碎组织样本中表现为“刺猬”的高度损伤细胞显然并非生物学过程所致，而很可能是在速冻前的切碎过程中由机械破坏和/或组织升温所引入的人为假象。因此，切碎组织的数据被认为不可靠。

相比之下，即使经过长期储存，从冷冻的组织块中仍可获得高质量的数据。收获组织后必须保持其低温和湿润，并迅速进行冷冻处理。此外，冷冻的组织块应在匀浆步骤前立即解冻。

冷冻组织样本适用于其他下游应用，包括例如改良彗星试验以检测氧化损伤或交联，以及评估基因表达的变化。在使用手术刀片切割或刮取组织时，以及在冷冻过程中操作液氮时，应格外小心。