在彗星分析中使用冷冻组织评估DNA损伤

该协议意义重大，因为使用冷冻组织简化了评估多个组织时物流，允许样品转移到远程实验室进行分析，并能够将分析组织的决定推迟数月。该技术的主要优点是，使用冷冻立方体组织不需要在验尸时接受彗星检测培训的人员，并最大限度地减少了在样品操作过程中引入的技术错误和机械DNA损伤的机会。该技术在临床前药物开发、进入环境化学品的安全评价、食品添加剂等应用。

冷冻组织可用于彗星测定，以评估基因毒性潜力、DNA修复、对化疗或放疗引起的DNA损伤的保护作用，以及环境生物监测。理想情况下，实验应设计为允许每个组织样本的处理到冻结步骤之前，从下一个动物收获的器官变得可用于处理。冷冻组织可以在彗星测定中被起诉，以评估基因毒性潜力、DNA修复、对化疗或放疗引起的DNA损伤的保护作用，以及环境生物监测。

技术教练卡罗尔·博比特和调查毒理学实验室经理艾琳·吉拉斯今天将担任顾问。研究助理林肯·马丁和组织学技术员阿梅利·拉德瑟尔将演示样品处理。要开始此过程，请从感兴趣的器官中去除任何连接的组织、器官和碎屑。

立即在一艘中等大小的重船上大力挥舞器官，船上装有约七毫升的冷、新鲜准备的碎液，以清除残留的血液和碎屑。将器官转移到另一艘含有足够冷切碎溶液的清洁称重船上，使组织保持浸没，并将其放在冰上，直到进一步处理。对于肝脏，切割左叶的五毫米纵向部分，并轻轻地摆动约七毫升的冷切碎溶液。

然后将组织条放入一个干净的中等尺寸的称重船上，里面装着大约 7 毫升的冷切碎溶液，并放在冰上，直到准备进一步处理。取出肝脏的一部分，并放入嵌入的盒式磁带中。根据实验室标准程序进行固定、修剪和石蜡嵌入，以进行未来可能进行组织病理学评估。

对于十二指肠，切入胃的十二指肠近部 10 毫米部分。在十二指肠的一端插入 21 到 25 量针，用一毫升冷切碎溶液冲洗，以清除任何碎屑和细菌。翻转十二指肠，再次用另一毫升的切碎溶液冲洗，并丢弃针头。

将十二指肠切开，用约七毫升的切碎溶液冲洗。然后再次冲洗十二指肠，并在冰上切碎溶液中保持，直到准备进一步处理。切割并修复剩余十二指肠的一部分，以进行未来可能进行的古骨学评估，如之前为肝脏描述的那样。

对于大脑来说，首先将大脑分成两个半球可能是有用的，一个半球被保存为可能的组织病理学。解剖感兴趣的大脑区域，然后轻轻冲洗它们，并在切碎溶液中保持在冰上，直到准备进一步处理，如前面描述的肝脏和十二指肠。对于胃，取出并丢弃林瘤。

切开腺胃，在中等大小的重船上，在含有约7毫升的冷切碎缓冲液的船上挥动，从食物中洗净。取出五毫米的腺胃带近到十二指肠固定，以进行可能的组织病理学评估，如前所述。将剩余的胃放入一个中等大小的重船上，内含约7毫升的冷切碎缓冲液，在冰上孵育15至30分钟。

在此之后，将胃转移到一块干净的石蜡上，并使用手术刀刀片或塑料细胞刮刀轻轻刮擦表面上皮至少两次，以清除碎屑。用钳子拿起胃粘膜，用移液器用一毫升的冷切碎缓冲液冲洗。将冲洗过的胃组织转移到干净的表面或盘子中，并加入冷切碎溶液。

使用手术刀刀片或塑料细胞刮刀的背面小心刮胃上皮四到五次，以释放细胞。然后，使用移液器收集含有释放细胞的切碎溶液，并转移到冰上的微离心管。对于切碎组织样本，切开一段肝脏、大脑或十二指肠，然后转移到含有一毫升冷切碎溶液的标记微离心管中。

使用切碎的剪刀快速切碎样品，直到样品最终被分散，同时确保样品保持冷。样品应看起来稍微多云。然而，这是常见的一些件保持，将定居到管的底部。

要在组织新鲜时使用，请保持冰上含有样品的管子。要冷冻组织样品，请立即在切碎或收集后固定管盖，然后将管子放入含有液氮的 Dewar 烧瓶中。在组织收获结束时，使用一包来取回样品管，并把它们放在干冰上进行分拣。

将管子转移到干冰上的冷冻盒中，并在零下80摄氏度的冰柜中存放。要准备冷冻的组织立方体，切开几小块组织，然后直接将它们放入中等大小的称重船或其他含有液氮的合适容器中几秒钟。碎片完全冷冻后，将冷冻组织立方体单独转移到干冰上标有微离心管或低温管。

在组织收获结束时，将管子转移到干冰上的冷冻盒中，并在零下800摄氏度的冰柜中存放在冰柜中。使用在湿冰上保存的新鲜切碎或刮伤的组织时，在收获后一小时内准备彗星滑梯。使用冷冻切碎或刮伤的组织时，在室温下将冷冻纸巾管放入水浴中，直到样品完全解冻，同时确保保持冷却。

样品解冻后，立即将管子转移到冰上。对于立方组织，从冰柜中取回含有立方体的管子，并放在干冰上直到准备滑动。将一毫升的商商介质或切碎溶液放入标有 1.7 毫升的微离心管中，用于每个样品并维护在冰上。

快速工作以避免解冻，将一个组织立方体放入室温组织切碎装置的开端。快速将大小匹配的注射器柱塞插入设备，将组织推入网状端，然后放入含有冷切碎溶液的微离心管中。将设备的网状端浸入冷切碎溶液中约 5 到 10 秒，使组织完全解冻。

完全按下柱塞，直到看到细胞通过网状孔隙挤压。然后将柱塞向上拉约 2.5 厘米，然后再次完全向下按压。重复多次，直到切碎溶液变得浑浊。

要准备幻灯片，请轻轻混合细胞悬浮液，将 50 微升转移到含有 450 微升的管中，在 37 摄氏度下含有 0.5% 的低熔点 agarose。准备幻灯片并评分，如文本协议中所述。在第一项研究中，肝脏从两组雄性斯普拉格·道利车辆控制大鼠中收获，交错一周。

幻灯片由刚切碎的组织、冷冻的切碎组织和冷冻的立方体组织进行。由于经合组织建议新鲜大鼠肝脏尾部DNA的百分比上限为6%，这些结果表明，任何冷冻方法都可以很好地评估组织。总的来说，刺猪的百分比与百分比的尾部DNA平行，尽管冷冻组织表现出更大的变异性。

在第二项研究中，雌性B6C3F1小鼠被施用车辆或诱变乙基甲烷硫化酯。百分比尾部DNA结果表明，肝脏组织冻结为立方体，随后使用组织切碎装置处理的结果与新鲜切碎组织的结果非常相似。在所有三种方法处理的组织样本中测量了EMS诱导DNA损伤的统计显著增加。

在第三项研究中，分析了在90天的化学毒性研究中从雌性B6C3F1小鼠身上采集的肝脏样本。冷冻切碎组织中所有剂量群的DNA损伤都很高，动物对动物的变异性很大。百分比尾部DNA结果与刺猪的百分比相关，表明刺猪在这些样本中观察到的高DNA损伤水平有很大贡献。

相比之下，与切碎的组织样本同时准备的闪光冷冻立方组织中，DNA受损和刺猪百分比都非常低。因此，在切碎的组织样本中表现为刺猪的严重受损细胞显然不是生物过程的结果，而是可能通过机械中断，或在切碎过程中进行组织加热，在被闪光冷冻之前。因此，被切碎的组织的数据被认为是不可靠的。

相比之下，即使在长期储存后，也从冷冻的立方体组织获得高质量的数据。保持收获的组织保持寒冷和潮湿，并迅速冻结样品至关重要。此外，冷冻立方体组织应在均质步骤之前立即解冻。

冷冻组织样本适用于其他下游应用，例如，修改彗星测定以检测氧化损伤或交叉链接，以及评估基因表达的变化。在处理手术刀刀片切割或刮刮组织时，以及在冷冻过程中处理液氮时，应小心谨慎。