Name: 在彗星分析中使用冷冻组织评估DNA损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 了解如何使用冷冻组织样本进行彗星分析以评估DNA损伤。本方法涵盖切碎组织、刮取上皮细胞和立方体组织样本的处理技术，适用于临床前药物开发和环境安全评估。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢Lincoln Martin和Kelley Owens在制备和分析彗星图谱实验载玻片过程中提供的专业技术支持，感谢Carol Swartz博士进行统计学分析。作者还感谢ILS公司遗传毒理学、研究毒理学和尸检项目团队成员所给予的支持性贡献。

组织样本是在美国实验动物照护与使用认证协会（AAALAC）认证的机构中，由国家毒理学计划（NTP）合同实验室根据优良实验室操作规范（21 CFR 第58部分）以及各实验室机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案进行研究期间采集的。
1. 组织收获与处理
注意：建议制备重复的样品管（例如肝脏），或将大约一半的样品转移至另一个储存管（例如十二指肠、胃），以便在需要时进行重新分析。为尽量减少肠道组织样品间的潜在差异，建议在每只动物相对于胃的相同解剖区域取样，并将样品分割以制备重复样本。转移脑等黏性组织时，建议使用塑料镊子。作为可选步骤，可将切碎、刮取或匀浆处理的组织通过连接在锥形管上的40 µm细胞筛过滤，以获得均一的单细胞悬液。
<ol>
	<li>去除目标器官上附着的结缔组织、其他器官及碎片。取出后立即在盛有约 7 mL 冷的 freshly prepared 切碎液（无 Mg++、Ca++ 和酚红的 Hank’s 平衡盐溶液，10% v/v DMSO，20 mM EDTA，pH 7.5）的中等大小称量皿中剧烈晃动，以去除残留血液和碎片。</li>
	<li>将每个器官转移至另一盛有足量（约 7 mL）冷切碎液的洁净称量皿中，置于冰上保持组织浸没，直至进一步处理。</li>
	<li>取各目标器官的一部分组织放入包埋盒中。按照实验室常规程序用 10% 中性缓冲福尔马林固定、修块并进行石蜡包埋，以备将来可能的组织病理学评估。</li>
	<li>对于肝脏，取左叶一段长约 5 mm 的纵向切片，在约 7 mL 冷切碎液中轻轻晃动。将组织条放入盛有约 7 mL 冷切碎液的洁净中等大小称量皿中，置于冰上保存，待后续处理（步骤 1.8 或 1.11）。</li>
	<li>对于十二指肠，取靠近胃部的一段长约 10 mm 的十二指肠。使用 21–25 G 针头冲洗以去除碎片和细菌。&#160;
	<ol>
		<li>将针头插入十二指肠一端，用 1 mL 冷切碎液冲洗。</li>
		<li>翻转十二指肠，从另一端重复冲洗，再使用 1 mL 切碎液冲洗一次。弃去针头。</li>
		<li>纵向剖开十二指肠，并在约 7 mL 切碎液中冲洗，然后放入盛有约 7 mL 洁净切碎液的中等大小称量皿中；置于冰上保存，待后续处理（步骤 1.8 或 1.11）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于脑组织，可先将脑分为两个半球；其中一个半球可用于可能的组织病理学分析（见步骤 1.2）。
	<ol>
		<li>分离出目标脑区，在约 7 mL 冷切碎液中轻轻晃动。</li>
		<li>将组织转移至盛有约 7 mL 冷切碎液的洁净中等大小称量皿中，置于冰上保存，待后续处理（步骤 1.8 或 1.11；注意小脑、海马等较小区域可能无需进一步修剪）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于胃组织
	<ol>
		<li>去除并弃去前胃。切开腺胃，在中等大小称量皿中用约 7 mL 冷切碎缓冲液清洗，去除食物残渣。</li>
		<li>取靠近十二指肠处一段长约 5 mm 的腺胃组织，用于固定，以备可能的组织病理学评估（见步骤 1.2）。</li>
		<li>将剩余胃组织放入盛有约 7 mL 冷切碎缓冲液的中等大小称量皿中，于冰上孵育 15–30 分钟。 
		注意：此孵育步骤可能非必需；该步骤包含在 JaCVAM 验证方案中，但在 OECD 测试指南8,9 中未提及。</li>
		<li>将胃转移至一块洁净的石蜡纸（或培养皿或称量皿）上，使用手术刀片背面或聚四氟乙烯（PTFE）刮刀轻轻刮擦表面上皮 2 次或以上，以去除碎片。用镊子夹起胃黏膜，用移液器加入 1 mL 冷切碎缓冲液冲洗。将胃组织转移至洁净表面或培养皿中。</li>
		<li>在切碎液（通常每只小鼠 250 µL 或每只大鼠 500–1,000 µL）中，使用手术刀片背面或 PTFE 刮刀小心刮擦胃上皮 4–5 次（必要时可更多），以释放细胞。可选：用大致等体积的切碎液冲洗组织，以回收更多细胞。用移液器收集含有释放细胞的切碎液，转移至置于冰上的微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切碎组织样品时，取一段 3–4 mm 的肝或脑组织，或约 5 mm 的十二指肠组织，转移至含有 1 mL 冷切碎液的已标记 1.5 或 2.0 mL 微量离心管中。使用组织剪快速剪碎（≤30 秒），直至组织充分分散，同时保持样品低温。样品应略显浑浊；但通常会残留少量组织碎片，沉于管底。</li>
	<li>若需使用新鲜组织，将含有剪碎组织或刮取的上皮细胞的离心管置于冰上保存；在取材后约 1 小时内用于制备彗星电泳载玻片（见第 2 部分）。</li>
	<li>若需冷冻保存组织样品，在剪碎或刮取上皮细胞后立即进行以下操作
	<ol>
		<li>拧紧管盖，将离心管直接投入盛有液氮的杜瓦瓶中；在解剖期间（≤3 小时）可将管子保存在液氮中。</li>
		<li>用勺子取出管子，置于干冰上进行分拣。将管子转移至置于干冰上的冻存盒中，并将冻存盒存于 -80 °C 冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若需制备组织冻块，切取数个小块组织（直径 ≤4 mm，长度约 6 mm；图 1）。
	<ol>
		<li>将组织块逐一直接投入盛有液氮的中等大小称量皿或其他合适容器中。</li>
		<li>等待数秒，待组织块完全冻结后，将单个冻存组织块转移至置于干冰上的已标记微量离心管或冻存管中；冷冻过程中避免组织块聚集粘连。</li>
		<li>将管子转移至置于干冰上的冻存盒中，并将冻存盒存于 -80 °C 冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 载玻片制备
<ol>
	<li>对于绞碎/刮取的组织
	<ol>
		<li>将含有新鲜组织的离心管置于湿冰上保存。</li>
		<li>将装有冷冻组织的离心管放入室温水浴中，直至样品完全解冻，同时确保组织保持低温状态。解冻后立即转移至冰上。</li>
		<li>在吸取细胞转移至琼脂糖之前（步骤 2.3），轻轻混匀每份细胞悬液；对于未过滤的样品，让较大的组织块沉降至管底。所有离心管在完成全部样品的载玻片制备前均需保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于组织块
	<ol>
		<li>从 -80 °C 冰箱中取出含有组织块的离心管，并在干冰上保存，直至进行载玻片制备。</li>
		<li>为每个样品在已标记的 1.7 mL 微量离心管中加入 1 mL Merchant 培养基（0.14 M NaCl, 1.47 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4）或绞碎液，并置于冰上保存。</li>
		<li>操作需迅速，避免组织解冻，将一块组织放入室温组织绞碎装置的开口端（图 1）。可使用多个组织片段；如有必要，可用预冷的研钵和研杵将冷冻组织切割或敲碎成更小的片段，以便适配装置。</li>
		<li>迅速将尺寸匹配的注射器推杆插入装置，推动组织至滤网端，并将该端浸入含有冷绞碎液的微量离心管中；注意避免液体溢出管外。将装置的滤网端浸入冷绞碎液中约 5–10 秒，使组织完全解冻。</li>
		<li>完全下压推杆，直至观察到细胞从滤网孔中挤出。然后将推杆上拉约 2.5 cm，再完全下压；重复此过程数次，直至绞碎液变得浑浊。</li>
		<li>如有必要，可通过在 4 °C 下以 1100 rpm 离心 5 分钟并去除部分上清液，对样品进行浓缩以提高细胞密度。</li>
		<li>每个样品均使用洁净的组织绞碎装置重复上述操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 50 µL 细胞悬液转移至另一离心管中，该管内含 450 µL 37 °C 的 0.5% 低熔点琼脂糖。 
	注意：体积可适当调整，但琼脂糖终浓度应 ≤1%。</li>
	<li>按照先前所述方法制备并标记载玻片10,11。</li>
</ol>

<ol><li>van der Leede, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+data+interpretation+of+the+in+vivo+comet+assay+in+pharmaceutical+industry%3A+EFPIA+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).</li>
<li>ICH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Conference+on+Harmonisation+of+Technical+Requirements+for+Registration+of+Pharmaceuticals+for+Human+Use+%28ICH%29+S2%28R1%29%3A+Guidance+on+Genotoxicity+Testing+and+Data+Interpretation+for+Pharmaceuticals+Intended+for+Human+Use%5BTitle%5D)+AND+%22ICH%22%5BJournal%5D)">International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.</a> ICH. , (2012).</li>
<li>EFSA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).</li>
<li>Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%2C+DNA+damage%2C+DNA+repair+and+cytotoxicity%3A+hedgehogs+are+not+always+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead.</a> Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).</li>
<li>Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+experimental+conditions+on+data+variability+in+the+liver+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+freezing+tissues+and+cells+for+analysis+of+DNA+strand+break+levels+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay.</a> Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).</li>
<li>Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Comet+assay+dose-response+for+ethyl+methanesulfonate+using+freshly+prepared+versus+cryopreserved+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>Uno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JaCVAM-organized+international+validation+study+of+the+in+vivo+rodent+alkaline+comet+assay+for+detection+of+genotoxic+carcinogens%3A+II.+Summary+of+definitive+validation+study+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%3A+In+Vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay.</a> OECD. 489, (2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+evaluation+of+six+chemicals+of+known+genotoxic+potential+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).</li>
<li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Alkaline+Comet+Assay+and+Enzyme-modified+Alkaline+Comet+Assay+for+Measuring+DNA+Strand+Breaks+and+Oxidative+DNA+Damage+in+Rat+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 53833(2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+styrene-acrylonitrile+trimer+in+brain%2C+liver%2C+and+blood+cells+of+weanling+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+the+flavonol+anti-oxidants%2C+alpha-glycosyl+isoquercitrin+and+isoquercitrin%2C+for+genotoxic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential.</a> Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).</li>
<li>Pant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vehicle+and+positive+control+values+from+the+in+vivo+rodent+comet+assay+and+biomonitoring+studies+using+human+lymphocytes%3A+historical+database+and+influence+of+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).</li>
</ol>

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家环境卫生科学研究所（NIEHS）院内研究计划资助，合同编号为HHSN273201300009C；然而，其中包含的陈述、观点或结论不一定代表NIEHS、NIH或美国政府的陈述、观点或结论。

如先前研究所示7,12,13，经过适当处理的速冻研磨组织在彗星试验中可获得良好的结果。事实上，本实验室制备的冷冻研磨大鼠和小鼠肝脏样本，其基础尾DNA百分比（% tail DNA）通常≤6%，符合OECD测试指南9对新鲜研磨大鼠肝脏样本的推荐标准。多个实验室已使用多种经研磨并冷冻保存的组织类型获得了良好结果；同样，从胃肠道器官刮取的速冻上皮细胞也已成功用于彗星试验7,12,13,14。冷冻研磨或刮取的组织在至少数月内保持相对稳定。采用Jackson等人最初描述的组织研磨装置对速冻肝组织小块进行匀浆的方法6...

彗星试验正越来越多地被用于评估暴露于化学物质或其他环境应激因素下的培养细胞和组织中的DNA损伤1。该试验可检测DNA双链和单链断裂、碱性不稳定位点以及与不完全DNA修复相关的单链断裂。人用药品技术要求国际协调委员会（ICH）的药品测试指南建议，将彗星试验等DNA链断裂检测方法作为第二项试验，以补充啮齿类动物红细胞微核试验，用于评估体内遗传毒性，并作为后续试验用于评估肿瘤诱导靶器官的作用机制2。欧洲食品安全局（EFSA）建议将体内彗星试验作为合适的后续试验，以探究体外遗传毒性试验中阳性结果的生物学相关性3。2014年，经济合作与发展组织（OECD）批准了啮齿类动物彗星试验的测试指南，从而提高了该试验在遗传毒性潜在风险监管测试中的可接受性。该试验基于电泳分离从裂解细胞的核样体中迁移出的松弛DNA环和片段。基本原理是将单个细胞包埋于涂覆在显微镜载玻片上的琼脂糖中。随后将载玻片浸入裂解缓冲液，再置于碱性（pH &#62; 13）溶液中，使紧密缠绕的核DNA松弛并解旋。然后将载玻片置于电场中，促使带负电荷的DNA向阳极迁移，形成类似彗星的图像；彗星尾部DNA含量相对于头部的比例与DNA损伤程度成正比；通常使用数字成像软件对尾部的DNA含量进行定量分析。
由于彗星试验可检测断裂的DNA，因此由处理引起的细胞毒性或应激所导致的坏死或凋亡相关的染色质断裂，可能会干扰对暴露所致DNA损伤的准确定量。此外，机械剪切或样品处理不当也可能导致DNA损伤4。先前研究已证实，在制片前保持收获组织处于冷藏状态，对于将DNA损伤的基础水平降至最低具有重要意义5,6。许多实验室使用新鲜组织制备彗星试验载玻片；然而，当在涉及大量动物的研究中需从每只动物获取多种组织类型时，这种方法在操作上可能具有挑战性。此外，若载玻片的制备与分析需在异地实验室进行，则必须运输样品，这也会带来问题。例如，美国国家毒理学计划（National Toxicology Program）已将彗星试验纳入其遗传毒理学测试项目（https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html），并有时将其用于28&#160;天或90天重复剂量毒性研究中；这要求由动物实验阶段的实验室采集组织，再将样品转移至另一实验室进行分析7。为实现这一流程，通常将组织块切碎，和/或刮取胃肠道上皮细胞，制成细胞悬液后迅速冷冻，并储存在冰箱中，待接收实验室后续运输和保存，直至分析。使用冷冻组织获得高质量数据的关键在于样品的正确处理；然而，在由不同人员轮流执行的解剖过程中，对组织样品进行可重复的一致性操作难以控制，尤其是在那些不常规为彗星试验采集组织的动物实验实验室。对解剖人员进行再培训，或派遣由经验丰富的实验人员组成的移动单元去采集新鲜或冷冻组织样品，往往成本过高、不可行，或未受到足够重视。
为了更好地确保生成高质量的组织样本并将其转运至远程地点进行彗星电泳分析，本研究探索了一种已发表的组织保存方法6，该方法利用速冻的组织小块进行处理。在此方法中，将冷冻的组织小块装入不锈钢组织剪切装置（图1），然后将装置置于含有冷缓冲液的微量离心管中。随后将组织小块从装置末端的细孔径筛网中推出。通过在两个方向上多次反复推动组织悬液穿过筛网，可获得相对均一的单细胞悬液。采用该方法制备的样本在质量上与通过剪切法处理的新鲜及冷冻组织样本相当。此外，与剪切后的样本不同，组织小块可在冷冻条件下长期保存，仍能在彗星电泳分析中获得高质量结果。

<table><tbody><tr><td>冻存管</td><td>Corning Costar</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>牙科蜡片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72670</td><td></td></tr><tr><td>解剖（剪切）微型剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Teknova</td><td>P0315-10</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.7 mL）</td><td>Corning</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林</td><td>Leica</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>注射器推杆（1 mL）</td><td>Fisher Scientific 或 Vitality Medical</td><td>14-826-88; 8881901014</td><td>Becton Dickinson 或 Monoject 结核菌素注射器</td></tr><tr><td>组织剪切装置</td><td>NorGenoTech（挪威奥斯陆）</td><td>无</td><td>观察到直径存在轻微差异，可能影响推杆的贴合度。</td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>Trade Winds Direct</td><td>DF8088N</td><td>增强型尼龙，非无菌，钝头，可高压灭菌；tradewindsdirect.com</td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Krackler Scientific/Heathrow Scientific</td><td>6290-14251B</td><td></td></tr></tbody></table>

使用冻存组织进行彗星实验以评估dna损伤

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

彗星试验正日益流行，被用于评估培养细胞和组织中的DNA损伤，特别是在暴露于化学物质或其他环境应激因素之后。2014年，经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）发布了测试指南，推动了彗星试验在啮齿类动物遗传毒性监管测试中的应用。通常，彗星试验载玻片是在动物解剖时使用新鲜组织制备的；然而，冷冻组织样本可避免因每只动物需同时制备多个器官、以及每项研究涉及大量动物所带来的操作上的困难。冷冻还便于将样本从暴露实验场所运送至其他实验室进行分析，并且冷冻保存使得可以延迟决定是否针对特定器官生成DNA损伤数据。碱性彗星试验可用于检测与暴露相关的DNA双链和单链断裂、碱不稳定位点，以及不完全DNA切除修复相关的链断裂。然而，机械剪切或不当的样品处理过程也可能导致DNA损伤，从而干扰试验结果。由于参与解剖的实验室人员经验水平参差不齐，且人员流动性较大，因此在解剖过程中对组织样本采集和处理的一致性较难控制。通过再培训或派遣由经验丰富的实验人员组成的移动单元来提高一致性，成本较高，且并非总是可行。为了优化高质量样本的稳定制备，本研究评估了一种使用定制组织切碎装置对快速冷冻组织块进行均质化处理的方法。采用该方法制备的彗星试验样本，在质量上与解剖时通过手工切碎制备的新鲜或冷冻组织样本相当。此外，经过长期储存后，从冷冻组织块中获得的细胞测得的基础DNA损伤水平较低。

研究 1 
从两组雄性 Sprague Dawley 大鼠中采集肝脏，这些大鼠均连续 4 天经口给予玉米油，两组实验间隔一周。切片由新鲜切碎的组织、冷冻切碎的组织以及在 Merchant 培养基或切碎液中使用组织切碎装置处理的冷冻立方体组织制备而成。第一组动物来源的冷冻组织在冰箱中储存约 3.5 个月后进行评估；第二组动物来源的冷冻组织则在储存约 6 个月后进行评估。具有典型“刺猬状”形态的彗星图像（表明细胞损伤严重，其成因尚不明确，可能包括细胞毒性或机械应力）未被纳入 % 尾部 DNA 的评分统计；根据 OECD TG 4899 的要求，仅通过形态学目视识别出的刺猬状细胞比例被单独记录统计。两组动物（每只动物评分 100 个细胞）的平均 % 尾部 DNA 结果汇总于图 2A。所有使用冷冻组织的方法所得数值均高于新鲜组织，尽管差异并非始终具有统计学意义。考虑到新鲜大鼠肝脏中 % 尾部 DNA 的推荐上限为 6%9</sup...

本方案描述了在动物尸检时制备高质量冷冻组织样本的几种方法，用于彗星试验以评估DNA损伤：1）剪碎的组织，2）胃肠道刮取的上皮细胞，以及3）需使用组织剪切装置均质化的立方体组织样本。

使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

彗星试验正日益流行，被用于评估培养细胞和组织中的DNA损伤，尤其是在暴露于化学物质或其他...之后

本方案具有重要意义，因为使用冷冻组织在评估多种组织时可简化物流流程，允许将样品转移至远程实验室进行分析，并可将组织分析的决策推迟数月。该技术的主要优势在于，使用冷冻组织块无需在解剖时依赖经过彗星试验培训的人员，同时最大限度地减少了样品操作过程中可能引入的技术误差和机械性DNA损伤。该技术可应用于临床前药物开发、进入环境的化学品安全性评价以及食品添加剂的安全性评估。冷冻组织可用于彗星试验，以评估基因毒性潜力、DNA修复能力、对化疗或放疗诱导的DNA损伤的保护作用，以及用于环境生物监测。理想情况下，实验设计应确保在处理下一个动物的器官之前，每个组织样本均可完成至冷冻步骤的处理流程。冷冻组织可用于彗星试验，以评估基因毒性潜力、DNA修复能力、对化疗或放疗诱导的DNA损伤的保护作用，以及用于环境生物监测。技术培训师 Carole Bobbitt 和调查毒理学实验室经理 Eileen Gilas 将担任今天的剖检员。研究助理 Lincoln Martin 和组织学技术员 Amelie Ladesseur 将演示样本处理。开始此操作时，需从目标器官上移除所有附着的结缔组织、器官及其他碎屑。立即将器官在含有约七毫升冰冷、新鲜配制的剪切溶液的中等大小称量皿中用力振荡，以去除残留血液和碎片。将器官转移至另一含有足够冰冷剪切溶液的洁净称量皿中，使组织保持浸没状态，并置于冰上直至进一步处理。对于肝脏，取左侧叶的五毫米纵向切片，轻轻在约七毫升冰冷剪切溶液中振荡清洗。然后将组织条放入一个洁净的中等大小称量皿中，皿内含有约七毫升冷剪切液，并置于冰上保存，直至准备进行后续处理。取一段肝脏组织放入包埋盒中。根据实验室常规标准操作程序进行固定、修块和石蜡包埋，以备将来可能进行的组织病理学评估。对于十二指肠，剪取靠近胃部的10毫米段。在一端插入21至25号针头，用1毫升冷剪切液冲洗以去除任何碎屑和细菌。将十二指肠翻转，再次用另一毫升剪切液冲洗，并弃去针头。将十二指肠切开，并用约七毫升的剪切溶液冲洗。再次冲洗十二指肠，并将其置于冰上的剪切溶液中保存，直至准备进行后续处理。取部分剩余的十二指肠组织，按照先前所述肝脏处理方法进行切割并固定，以备将来可能进行的组织病理学评估。对于脑组织，可先将脑分为两个半球，其中一个半球保留以备可能的组织病理学检查。分离出感兴趣的脑区后，轻轻冲洗，并将其置于切碎液中冰上保存，直至按前述肝脏和十二指肠的方法进行后续处理。对于胃组织，去除并弃去前胃部分。切开腺胃，将其置于含有约七毫升冷切碎缓冲液的中型称量皿中，轻轻晃动以彻底清除食物残渣。在靠近十二指肠处取一段五毫米宽的腺胃组织条，用于固定，以便后续可能进行的组织病理学评估，操作方法如前所述。将剩余的腺胃组织放入另一个含有约七毫升冷切碎缓冲液的中型称量皿中，冰上孵育15至30分钟。此后，将胃转移至一块干净的石蜡纸上，使用手术刀片或塑料细胞刮刀轻轻刮擦表面上皮至少两次，以去除碎片。用镊子夹起胃黏膜，用移液器加入一毫升冷剪切缓冲液进行冲洗。将冲洗后的胃组织转移至干净的表面或培养皿中，并加入冷剪切溶液。使用手术刀背侧或塑料细胞刮刀小心刮取胃上皮组织4到5次，以释放细胞。然后用移液器收集含有已释放细胞的剪切液，并转移至预冷的微量离心管中。对于组织样本的剪切，取一段肝脏、脑组织或十二指肠，剪下后转移至含有1 mL冷剪切液的已标记微量离心管中。使用剪刀快速剪切样本，直至其完全分散，同时确保样本保持低温。样本应呈现轻微浑浊状。然而，通常会有一些小块残留，沉降至管底。为了在组织新鲜时立即使用，请将装有样本的试管置于冰上保存。如需冷冻组织样本，在切碎或收集后立即拧紧试管盖，并将试管放入装有液氮的杜瓦瓶中。组织收获结束后，使用勺子取出样本试管，并将其放置在干冰上进行分拣。将试管转移至盛有干冰的冻存盒中，并将冻存盒置于零下80摄氏度的冰箱中保存。为制备组织冻块，切取数个小块组织，分别直接投入盛有液氮的中等大小称量舟或其他合适容器中，浸泡数秒钟。待组织块完全冻结后，将冻结的组织块逐一转移至预冷的、标记好的微量离心管或冻存管中，操作过程需在干冰上进行。组织收获结束后，将试管转移至盛有干冰的冻存盒中，并将冻存盒置于–80 °C 超低温冰箱中保存。若使用置于湿冰上保存的新鲜切碎或刮取的组织，应在收获后1小时内制备彗星凝胶电泳载玻片。若使用冷冻的切碎或刮取组织，则将装有冷冻组织的试管放入室温水浴中，直至样品完全解冻，同时确保组织始终保持低温状态。样本解冻后，立即将离心管置于冰上。对于切成小块的组织，从冷冻箱中取出含有组织块的离心管，并在干冰上保存，直至进行切片制备。为每个样品取1毫升商业培养基或剪碎液，分装至已标记的1.7毫升微量离心管中，并置于冰上保存。为避免组织融化，请迅速操作，将一块组织放入室温组织剪切装置的开口端。迅速插入与装置匹配尺寸的注射器推杆，将组织推入装置的滤网端，并将滤网端立即放入含有冷剪切液的微量离心管中。将装置的滤网端浸入冷剪切液中约5至10秒，使组织完全解冻。完全按下柱塞，直至观察到细胞从筛网孔中挤出。然后将柱塞向上拉起约2.5厘米，再彻底压下。重复数次，直至匀浆液变得浑浊。制备载玻片时，轻轻混匀细胞悬液，取 50 微升加入含有 450 微升 37 摄氏度的 0.5% 低熔点琼脂糖的离心管中。按照文本方案中所述的方法制备并标记载玻片。在第一项研究中，分别采集了两组雄性 Sprague Dawley 大鼠（溶剂对照组）的肝脏组织，两组之间间隔一周。切片由新鲜切碎的组织、冷冻切碎的组织和冷冻成块状的组织制备。由于 OECD 推荐的新鲜大鼠肝脏尾 DNA 百分比上限为 6%，这些结果表明，任何一种冷冻方法均可有效用于组织评估。总体而言，刺猬细胞百分比与尾 DNA 百分比趋势一致，但冷冻组织表现出更大的变异性。在第二项研究中，向雌性B6C3F1小鼠给予溶剂或致突变物乙基甲烷磺酸盐。尾部DNA百分比结果显示，将肝脏组织冷冻成方块后，再使用组织切碎装置进行处理，所得结果与新鲜切碎组织处理的结果非常相似。采用三种方法处理的组织样本中，均检测到EMS诱导的DNA损伤显著增加。在第三项研究中，分析了来自为期90天的化学毒性研究中雌性B6C3F1小鼠的肝脏样本。在所有剂量组中，冷冻切碎组织中的DNA损伤水平均较高，且个体间差异显著。尾部DNA百分比结果与刺猬样细胞百分比呈正相关，表明刺猬样细胞对这些样本中观察到的高水平DNA损伤有重要贡献。相比之下，在与切碎组织样本平行制备的速冻立方体组织中，DNA损伤细胞和“刺猬”细胞的比例均非常低。因此，在切碎组织样本中表现为“刺猬”的高度损伤细胞显然并非生物学过程所致，而很可能是在速冻前的切碎过程中由机械破坏和/或组织升温所引入的人为假象。因此，切碎组织的数据被认为不可靠。相比之下，即使经过长期储存，从冷冻的组织块中仍可获得高质量的数据。收获组织后必须保持其低温和湿润，并迅速进行冷冻处理。此外，冷冻的组织块应在匀浆步骤前立即解冻。冷冻组织样本适用于其他下游应用，包括例如改良彗星试验以检测氧化损伤或交联，以及评估基因表达的变化。在使用手术刀片切割或刮取组织时，以及在冷冻过程中操作液氮时，应格外小心。

use-frozen-tissue-comet-assay-for-evaluation-dna

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在彗星分析中使用冷冻组织评估DNA损伤

该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

用于细胞DNA损伤检测的彗星实验

彗星试验是一种高效检测所有细胞（包括海马神经元）DNA中单链和双链断裂的方法，可检测碱性不稳定位点以及DNA-DNA/DNA-蛋白质交联。该方法利用不同DNA损伤程度导致DNA在电场中迁移率差异的原理进行检测。...

使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

本文介绍了一种能够以前所未有的通量进行彗星实验检测DNA损伤的平台。该装置可将哺乳动物细胞排列成微阵列，并实现96个样品的并行处理。该方法有助于分析基础水平的DNA损伤、暴露诱导的DNA损伤以及DNA修复动力学。...

CometChip：一种用于在微阵列化人细胞中高通量检测DNA损伤的96孔平台

彗星试验用于检测由不同因素引起的DNA断裂。如果除氧化应激外的所有其他导致DNA损伤的因素均保持恒定，则DNA损伤程度可作为氧化应激的一个良好间接参数。本实验方案的目标是利用彗星试验对氧化应激进行间接测定。...

彗星试验作为系统性氧化应激的间接检测方法

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。...

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

彗星试验是检测DNA损伤的常用方法。本研究介绍了一种用于运行彗星试验代表性变体的载玻片操作方法。该方法显著增加了样本数量，同时缩短了试验运行时间、减少了载玻片操作步骤以及凝胶损伤的风险。...

一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法

本方案描述了一种通过彗星实验来定量分析I型和II型抑制剂在FLT3突变细胞中诱导DNA损伤差异的有效方法。...

彗星实验定量分析表达FLT3突变体的32D细胞在暴露于I型和II型FLT3抑制剂后的DNA损伤

关键词：彗星实验，DNA损伤，FLT3突变，32D细胞，I型FLT3抑制剂，II型FLT3抑制剂

通过将DNA损伤剂连接至三链形成寡核苷酸（TFO），可实现靶向的DNA损伤。利用经修饰的TFO，结合本文所述的染色质免疫沉淀分析和DNA超螺旋分析方法，可在人细胞中研究DNA损伤特异性蛋白结合及DNA拓扑结构的改变。...

研究结构蛋白HMGB1在螺旋扭曲、位点特异性DNA链间交联加工中作用的工具

本实验方案的目的是描述如何利用激光显微照射诱导不同类型的DNA损伤，包括相对简单的链断裂和复杂损伤，以研究DNA损伤信号传导及修复因子在损伤位点的聚集。 在体.

激光微辐照技术用于研究 体内 细胞对简单和复杂DNA损伤的反应

本文展示了一种从标本馆材料中提取DNA并构建高通量测序文库的详细方案，包括对质量极差的DNA进行挽救的方法。...

植物标本DNA高效提取及高通量测序文库构建

了解如何使用冷冻组织样本进行彗星分析以评估DNA损伤。本方法涵盖切碎组织、刮取上皮细胞和立方体组织样本的处理技术，适用于临床前药物开发和环境安全评估。

使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

探索更多视频