Name: 通过高分辨率熔融在水稻种群中识别突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 了解高分辨率熔融分析结合TILLING技术在水稻突变体筛选中的应用。该方法可高通量检测插入缺失和单碱基替换突变，为作物遗传改良和抗病育种提供经济高效的分子工具。

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本工作得到中国国家重点研发计划（编号：2016YFD0102103）和国家自然科学基金（编号：31701394）的资助。

1. 准备工作
<ol>
	<li>高分辨率熔解曲线分析技术在突变筛选中的应用 &#947;-rays诱变群体
	<ol>
		<li>处理约20,000粒干燥的粳稻种子（含水量约为14%），如DS552品系， 137Cs γ射线以100 Gy（1 Gy/min）照射 &#947; 辐照设施（例如，γ射线辐照室）。 
		注意：用于处理的种子应具有高活力（例如，发芽率 &#62;85%）。籼稻的辐照剂量可增加至150 Gy。</li>
		<li>将辐射处理后的种子在苗床上播种，待发芽后将幼苗单株移栽至稻田，并培育至M代1 群体 
		注意：M的直接播种1 植株稀疏种植也可用于节省劳动力成本。防止M代植株异花授粉。1 使用物理或生物隔离手段将植株与其他水稻品种隔离开来。</li>
		<li>批量收获 M2 M 代种子1 植株，每株M代取1-2粒种子1 恐慌，以形成一个 M2 群体 
		注意：在实际操作中，为简便起见，收获 M 的所有种子1 植物并充分混匀后，取一部分样品形成一个M2 群体</li>
		<li>浸泡约 5,000 M2 将种子在室温下浸泡于水中24小时（籼稻）至36小时（粳稻），然后在37℃条件下萌发 &#176;在培养皿中的湿润滤纸上于4°C放置2天。 
		注意：更多 M2 种子可萌发用于分析，以提高突变体的鉴定概率。</li>
		<li>将已萌发的种子放入带有小孔的育苗板中，并在改良自Yoshida等人的培养液中进行水培，培养3-4周。15 在玻璃温室中，光照周期为12小时［白天（30&#177;2) &#176;C 和夜间（24&#177;2) &#176;C]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>叶片组织取样：剪取一个圆片（&#934; 使用打孔器从每株幼苗完全展开的叶片相同位置取样约2 mm。</li>
	<li>DNA提取溶液的配制
	<ol>
		<li>缓冲液A：加入2 mL 5 M NaOH和10 mL 20% Tween 20，加水定容至50 mL。在DNA提取前新鲜配制缓冲液A。</li>
		<li>缓冲液B：加入20 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）和80 &#956;100 mL 的 0.5 M EDTA 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR引物
	<ol>
		<li>HRM分析引物：使用软件（如Primer Premier5）设计用于扩增目标序列的引物，并由商业公司合成。 
		注意：由于高分辨率熔解（HRM）技术不适用于长片段的分析，因此扩增子长度应小于400 bp。片段的GC含量过高（&#62;75%）或过低（&#60;GC 含量为 25% 也不适合进行 HRM 分析。</li>
		<li>用于质量控制的引物：采用彭 et al. 提供的分布在12条水稻染色体上的24个SSR标记16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. DNA 提取
<ol>
	<li>将4个叶片圆片放入96孔PCR板的每个孔中，每孔加入缓冲液A（50 mL/孔）。将板置于-80 °C冰箱中冷冻10分钟。</li>
	<li>在室温下解冻该板，然后在95 °C孵育10分钟。</li>
	<li>向每孔加入50 μL缓冲液B，并通过涡旋充分混匀。</li>
	<li>将板在1,500 x g条件下离心1分钟。上清液即可用于PCR。</li>
</ol>
3. PCR 扩增
<ol>
	<li>PCR 优化
	<ol>
		<li>向每个 PCR 孔中加入以下试剂：1 μL DNA（步骤 2.4 中的上清液），5 μL 2x Master Mix（包含 2x PCR 缓冲液、4 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L 2'-脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）和 50 U/mL Taq DNA 聚合酶），0.2 μL 的 10 μmol/L 引物各两种，并用无核酸酶水补足至终体积 10 μL。</li>
		<li>使用具备梯度功能的热循环仪，通过以下 PCR 程序确定每个目标片段的最佳退火温度：94 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环（94 °C 变性 30 秒，52–62 °C 退火 30 秒（梯度温度），72 °C 延伸 30 秒），最后在 72 °C 延伸 8 分钟，然后在 16 °C 保存。</li>
		<li>在 1% 琼脂糖凝胶上检测扩增产物，以确定最佳退火温度。 
		注意：最佳退火温度应能实现目标片段的特异性扩增，避免非特异性扩增和引物二聚体的形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于 HRM 分析的 PCR 
	注意：使用适用于 HRM 分析的 PCR 板，以及按照步骤 2.4 所述方法提取的 M2 代幼苗 DNA 进行 PCR。
	<ol>
		<li>在终体积为 10 μL 的体系中进行 PCR 反应，包括 1 μL DNA（上清液），5 μL 2x Master Mix，0.2 μL 的 10 μmol/L 引物各一种，以及 1 μL 10x 荧光染料。每块 PCR 板中应包含一个野生型（WT）亲本样本和一个阴性对照（不加 DNA）。</li>
		<li>向每个孔中加入一滴矿物油，以防止蒸发。</li>
		<li>用粘性封膜密封反应板，并在 1,000 x g 条件下离心 1 分钟。</li>
		<li>使用已优化的退火温度运行 PCR。 
		注意：在少数情况下，荧光染料可能影响 PCR 扩增效果，因此可在 PCR 完成后再加入染料。此类情况下，通过 PCR 后的变性和退火步骤使染料掺入 DNA 链中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. HRM 扫描与突变确认
<ol>
	<li>从平板上移除封口膜，并将平板插入高分辨率熔解（HRM）仪中。</li>
	<li>从文件菜单中选择新建运行，或点击屏幕顶部的运行按钮。</li>
	<li>设定熔解温度范围，从 55 °C 到 95 °C。 
	注意：首次运行后，可确定特定片段的熔解温度范围，因此在后续对同一片段的分析中可调整熔解温度范围以节省时间。</li>
	<li>选择用于高分辨率熔解分析的样品，排除与阴性对照相似的样品。</li>
	<li>对熔解曲线进行归一化处理，使其起始和终止荧光值一致。目视确认下限最小值和下限最大值温度游标位于曲线的合适区域。</li>
	<li>将∆F（荧光差异值）保持在默认值 0.05。</li>
	<li>在标准品选择列表中选择共同型 vs. 变异型，并选择正常灵敏度。</li>
	<li>以野生型（WT）作为对照；若样品与野生型的∆F值 ≥0.05，则认为其含有突变植株。</li>
	<li>突变植株的鉴定与确认。
	<ol>
		<li>鉴定构成每个突变池的四株植株。</li>
		<li>采用经 Allen 等17描述的 CTAB 法（略有修改）提取各植株的 DNA。 
		注意：使用 Allen 等17所述的 CTAB 法提取 DNA 时，无需使用无 DNase 的 RNase 和 NaAc，因为所得 DNA 质量已足以用于后续 PCR 扩增。使用分光光度计定量后，将 DNA 调整至终浓度约为 25 ng/μL。</li>
		<li>使用与 HRM 分析相同的 PCR 引物和程序扩增目标片段。</li>
		<li>通过扩增产物的 Sanger 测序鉴定具体的分子突变位点。 
		注意：PCR 扩增完成后，将扩增产物送至公司进行 Sanger 测序。通过比较 M2 植株与野生型（WT）的序列，可确定分子突变类型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 利用分子标记对筛选出的突变体进行质量控制
<ol>
	<li>使用CTAB法提取基因组DNA，以25 ng基因组DNA、5 µL 2x混合液和0.2 µL的10 μM SSR引物，在终体积10 μL中进行24个SSR标记的PCR扩增。</li>
	<li>采用以下程序进行PCR扩增：94 °C预变性5分钟，随后进行30个循环（每个循环包括94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒），最后在72 °C延伸7分钟。</li>
	<li>在8%聚丙烯酰胺凝胶上分离扩增产物，并通过银染法显示扩增片段的多态性18。</li>
	<li>比较所选变异株与野生型（WT）的SSR单倍型。 
	注意：若多个SSR标记在变异株与野生型之间存在差异，则该变异株极有可能为遗传污染（例如混合样本或异交植株），而非诱导突变体；通常情况下，诱导突变体的SSR单倍型与其野生型相同18。</li>
</ol>

<ol><li>McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).</li>
<li>Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%2C+high-resolution+melting+%28HRM%29%2C+and+next-generation+sequencing+%28NGS%29+techniques+in+plant+mutation+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding.</a> Molecular Breeding. 37 (3), 40(2017).</li>
<li>Till, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+induced+point+mutations+with+high+throughput+TILLING%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING.</a> Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single+nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single nucleotide mutation discovery.</a> The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).</li>
<li>Comai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+discovery+of+DNA+polymorphisms+in+natural+populations+by+Ecotilling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling.</a> The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).</li>
<li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicagotruncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula.</a> Plant Physiology. 151 (3), 1077(2009).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis.</a> Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).</li>
<li>Colasuonno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHPLC+technology+for+high-throughput+detection+of+mutations+in+a+durum+wheat+TILLING+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genetics%22%5BJournal%5D)">DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population.</a> BMC Genetics. 17 (1), 43(2016).</li>
<li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+rare+mutations+in+populations%3A+TILLING+by+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing.</a> Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).</li>
<li>Kumar, A. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING+by+Sequencing+%28TbyS%29+for+targeted+genome+mutagenesis+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops.</a> Molecular Breeding. 37, 14(2017).</li>
<li>Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mutation+detection+of+three+homoeologous+genes+in+wheat+by+High+Resolution+Melting+analysis+and+Mutation+Surveyor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor.</a> BMC Plant Biology. 9, 143(2009).</li>
<li>Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+two+high+through-put+techniques+in+a+novel+application%3A+detecting+point+mutations+in+large+EMS+mutated+plant+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations.</a> Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).</li>
<li>Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+differentiation+by+analysis+of+DNA+melting+curves+during+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.</a> Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).</li>
<li>Lochlainn, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+%28HRM%29+analysis+is+an+efficient+tool+to+genotype+EMS+mutants+in+complex+crop+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes.</a> Plant Methods. 7, 43(2011).</li>
<li>Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoshida%2C+S+%22The+International+Rice+Research+Institute%22">The International Rice Research Institute</a>. , Manila, the Philippines. (1976).</li>
<li>Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSR+markers+selection+and+purity+detection+of+major+hybrid+rice+combinations+and+their+parents+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Rice+Science%22%5BJournal%5D)">SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China.</a> Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).</li>
<li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissues+using+cetyltrimethymmonium+bromide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide.</a> Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).</li>
<li>Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revisit+of+mutation+induction+by+gamma+rays+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%3A+implications+of+microsatellite+markers+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control.</a> Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).</li>
<li>Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting-based+tilling+of+%CE%B3+ray-induced+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).</li>
<li>Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+mutagenesis+and+qPCR-HRM+prescreening+for+point+mutations+in+an+embryogenic+cell+suspension+of+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine.</a> Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).</li>
<li>Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+an+HRM-based%2C+safe+and+high-throughput+genotyping+system+for+photoperiod+sensitive+genic+male+sterility+gene+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice.</a> Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).</li>
<li>Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+type+of+inheritable+mutations+induced+by+%CE%B3+rays+in+rice+as+revealed+by+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University-Science+B%22%5BJournal%5D)">Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905(2016).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

TILLING 已被证明是一种强大的反向遗传学工具，可用于鉴定诱导突变，以进行基因功能分析和作物育种。对于某些不易观察或难以确定的性状，采用基于高通量 PCR 的突变检测 TILLING 方法，可有效获得不同基因的突变体。HRM-TILLING 方法已应用于番茄12、小麦11和葡萄20的 EMS 诱变群体中进行突变筛选。本文展示了一种更简便且更高效的 HRM-TILLING 方法，适用于 Indel 和 SBS 突变的筛选。
为了提高效率，采用SSF方法而非耗时耗力且需要使用有毒化学试剂的传统CTAB方法进行DNA提取。Si等人21比较了SSF法与CTAB法所提取DNA的质量。尽管发现SSF法提取的DNA纯度低于CTAB法，但其仍能满足水稻PCR及高分辨率熔解曲线（HRM）分析的要求。然而需要注意的是，SSF法提取的DNA不能长期保存，因此不适合用于构建永久性突变体文库。
<p cla...

突变体是植物功能基因组学研究和新品种育种的重要遗传资源。大约20年前，正向遗传学方法（即从突变体筛选到基因克隆或品种培育）曾是利用人工诱变的主要且唯一手段。McCallum 等人1开发的一种新型反向遗传学方法——TILLING（Targeting Induced Local Lesions In Genomes，基因组中诱导局部突变的靶向技术），开创了一种新范式，并已被广泛应用于大量动物和植物物种中2。TILLING 特别适用于那些在技术上难以或成本较高的性状育种（例如抗病性、矿物质含量）。
TILLING 最初用于筛选化学诱变剂（如 EMS1,3）诱导的点突变，其流程包括以下步骤：构建 TILLING 群体；提取并混合个体植株的 DNA；靶 DNA 片段的 PCR 扩增；通过 PCR 产物的变性与复性形成异源双链，并利用 CEL I 核酸酶进行切割；最后鉴定突变个体及其特异性的分子变异位点3,4。然而，该方法仍相对复杂、耗时较长且通量较低。为了提高效率和通量，已发展出多种改进的 TILLING 方法，例如缺失 TILLING（De-TILLING）（表 1）1,3,5,6,7,8,9,10,11,12。
高分辨率熔解曲线分析（HRM）基于DNA双链解链过程中荧光信号的变化，是一种简单、经济且高通量的突变筛查与基因分型方法13。HRM已广泛应用于植物研究中，包括基于HRM的TILLING技术（HRM-TILLING），用于筛选由EMS诱变诱导的单碱基替换（SBS）突变14。本文提供了利用HRM-TILLING技术在水稻中筛选γ射线诱导的突变（包括插入缺失突变和单碱基替换突变）的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>2&amp;times; Taq plus PCR Master Mix</td><td>Tiangen, 中国</td><td>KT201</td><td>用于PCR扩增的PCR缓冲液、dNTP和聚合酶</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Bio-rad, 美国</td><td>MSP-9651</td><td>HRM分析中PCR专用板</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf, 德国</td><td>6333000073</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>LightScanner</td><td>Idaho Technology, 美国</td><td>LCSN-ASY-0011</td><td>用于荧光信号的采集与处理</td></tr><tr><td>CALL-IT 2.0</td><td>Idaho Technology, 美国</td><td></td><td>用于分析荧光变化</td></tr><tr><td>EvaGreen</td><td>Biotium, 美国</td><td>31000-T</td><td>HRM用荧光染料</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific, 美国</td><td>ND2000</td><td>用于DNA定量</td></tr></tbody></table>

通过高分辨率熔解分析在水稻tilling群体中鉴定突变位点

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

靶标诱导基因组局部突变检测技术（TILLING）是一种用于高通量筛选诱导突变的反向遗传学策略。然而，传统的TILLING体系在插入/缺失（Indel）检测方面适用性较低，且需要更为复杂的步骤，例如CEL I核酸酶消化和凝胶电泳。为了提高通量和筛选效率，并实现对插入/缺失突变和单碱基替换（SBSs）的同步检测，已开发出一种基于高分辨率熔解曲线（HRM）的新型TILLING系统。本文详细介绍了一种HRM-TILLING实验方案，并展示了其在突变筛选中的应用。该方法通过检测双链DNA在高温下的变性过程，分析PCR扩增子中的突变情况。HRM分析可在PCR完成后直接进行，无需额外处理步骤。此外，本方法整合了一种简单、安全、快速（SSF）的DNA提取技术，可同时用于识别插入/缺失突变和单碱基替换突变。由于其操作简便、结果稳定且通量高，该技术在水稻及其他作物的突变扫描中具有广泛的应用前景。

HRM 扫描与分析
总共制备了来自4,560株M2幼苗的1,140个混合DNA样本，并进行了PCR扩增。分别针对OsLCT1和SPDT扩增出大小为195 bp和259 bp的两个片段（表2）。大多数样本的熔解曲线与野生型（WT）无显著差异（ΔF &lt; 0.05）。与野生型熔解曲线显著不同的样本（ΔF &gt; 0.05）由软件自动归类为与野生型不同颜色的组别（图1）。
突变确认与频率
采用单株幼苗的DNA样品进行扩增，并对相应片段进行测序。通过测序色谱图可确认突变类型及其在基因上的位置（图2）。在4,560株M2代幼苗中鉴定出三个突变，包括两个插入/缺失突变（Indel）...

本文介绍了基于高分辨率熔解分析（HRM）的靶向诱导基因组局部突变（TILLING）技术方案。该方法利用DNA双链熔解过程中荧光信号的变化，适用于对插入/缺失（Indel）和单碱基替换（SBS）进行高通量筛选。

通过高分辨率熔解分析在水稻TILLING群体中鉴定突变位点

靶向诱导基因组局部突变（Target Induced Local Lesions In Genomes，TILLING）是一种反向遗传学策略，用于高通量筛选诱导突变。然而，该方法……

对于那些在技术上难以或成本较高的性状鉴定而言，该方法将非常有用，例如抗病性、矿物质含量等。这是一种相当简单、经济高效且高通量的技术。首先，将四个叶片圆片放入96孔PCR板的每个孔中。向每个孔中加入 50 毫升缓冲液 A 溶液。将培养板置于 -80 °C 冰箱中冷冻 10 分钟。然后在室温下解冻培养板。在95摄氏度下孵育10分钟。向每个孔中加入50 µL缓冲液B，并通过涡旋充分混匀。在1,500 ×g条件下离心微孔板1分钟。将上清液作为DNA用于PCR。首先，使用一个孔中的DNA上清液作为PCR模板，以优化退火温度。将试剂和一微升DNA上清液加入每个PCR孔中。将PCR管放入具有梯度功能的热循环仪中，并根据论文调整加热程序，以确定每个目标片段的最佳退火温度。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增片段。确定能够实现目标片段特异性扩增的最佳退火温度。进行高分辨率熔解（HRM）分析时，将试剂混合，每孔加入1微升10倍浓度的荧光染料和1微升DNA上清液至适用于HRM的PCR板中。每块板中需包含一个野生型亲本样本和一个不含DNA的阴性对照。每孔加入一滴矿物油，以防止蒸发。然后，用粘性封膜密封反应板，并在1,000 × g条件下离心1分钟。使用优化的退火温度运行PCR。随后，移除反应板上的粘性封膜，将反应板放入高分辨率熔解（HRM）仪中。在软件中，从文件菜单选择“新建运行”，或按屏幕顶部的“运行”按钮。设定熔解温度范围，从 55 到 95 摄氏度。选择用于高分辨率熔解分析的样本，并排除与阴性对照相似的样本。将熔解曲线归一化，使其具有相同的起始和终止荧光值。目视确认较低的最小值和较低的最大值温度光标位于曲线的相应区域。将荧光差值（delta F）保持在默认设置 05。从标准品选择列表中，选择常见型与变异型，并选择正常灵敏度。选择 H12 以将野生型作为对照。ΔF 值大于 05 的样本被认为含有突变植株。然后，采用CTAB法从突变体群体中提取熔解曲线与野生型显著不同的四种植物的DNA。使用分光光度计定量后，用NanoDrop 2000将DNA浓度调整至最终约为25纳克/微升。向PCR管中的DNA样本加入0.4微升PCR引物，放入热循环仪中，并调整程序以扩增目标片段。然后，将PCR产物送至公司进行测序。经Sanger测序后，通过比较M2植株与野生型之间的序列来确定分子突变位点。本研究中，对M2幼苗进行HRM扫描及OsLCT1或SPDT基因突变分析，结果显示大多数样本的熔解曲线与野生型无显著差异，ΔF小于0.5。在90至92摄氏度和81.5至83.5摄氏度的温度下，突变体表现出显著不同的HRM曲线，其delta Fs均大于05。通过测序色谱图确认了来自4,560株M2幼苗的基因上突变类型及位置。在OsLCT1基因的4,304个碱基对处鉴定出一个G到A的杂合突变位点。在 OsLCT1 的第 4,240 个碱基对处出现了一个单核苷酸 A 插入，在 SPDT 的第 5,948 至 5,950 个碱基对位置观察到一个 TTC 三核苷酸缺失。我在高分辨率熔解曲线分析前对 PCR 进行了优化。凝胶中的染料具有一定的危害性。运行凝胶时请记得戴上手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过高分辨率熔融在水稻种群中识别突变

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