从鲟鱼鳍和颌骨基质中提取皮质醇

本方法提出了一种新型的替代性应激指标，可作为未来在新型非侵入性样本及毛发基质中检测皮质醇的平台。该技术的优势在于操作简便，且可用于评估屠宰后动物的应激水平。利用该技术建立高皮质醇水平与健康动物或人体之间的关系，有助于某些疾病的诊断。

该方法还可用于研究数个世纪前的生物样本，例如这些古老的化石，以评估样本生命周期内的应激水平。进行皮质醇提取时，使用精度为0.0001的电子分析天平，称取每份样品300±10毫克，并将样品分别放入15毫升的锥形管中。向每个样品管中加入3毫升异丙醇，并以每分钟80转的速度旋转2.5分钟，以洗脱皮质醇并去除任何可能的外部污染。

最后一次洗涤后，将样品在室温下晾干七天，然后使用新鲜的超纯水进行三次额外洗涤，每次洗涤均使用新鲜超纯水。准确称取75 ± 5毫克干燥的鳍条或颌骨样品，使用珠磨机在50赫兹条件下彻底研磨32分钟。随后，向每管粉末状鳍条或颌骨样品中加入1.5毫升甲醇，并将样品置于转速为40转/分钟的管式旋转仪上，在室温下旋转18小时。

皮质醇提取后，通过离心沉淀样品组织。然后将每个样品中上层一毫升呈黄色的含皮质醇有机层转移至各自的1.5毫升微量离心管中。在通风橱中于38°C下过夜干燥皮质醇样品，以蒸发甲醇。

第二天早晨，向每根试管中加入 400 µL PBS，涡旋混匀后离心，以收集皮质醇。进行 ELISA 分析时，将每种提取的标准皮质醇样品和对照品各取 25 µL，重复设两个孔，加入 96 孔 ELISA 板的相应孔中。另取两个孔，每孔加入 25 µL 测定稀释液，作为空白对照（零点），并在每个非特异性结合孔中也加入 25 µL 测定稀释液。

将15微升酶结合物与24毫升检测稀释液混合，然后向每孔中加入200微升结合物。在500转/分钟的旋转摇床上混匀5分钟，随后于室温孵育1小时。

孵育结束后，每孔加入 300 微升 1× 洗涤缓冲液，洗涤 4 次。每次洗涤后，迅速将酶标板在水槽上方倒置以弃去缓冲液，并将板轻拍在叠好的纸巾上吸干。最后一次洗涤后，每孔加入 200 微升 TMB 底物溶液，将酶标板置于旋转器上，500 转/分钟旋转 5 分钟。

混匀后，将酶标板在室温下避光孵育25分钟。孵育结束后，向每孔中加入50 µL终止液，并在旋转摇床上以每分钟500转的速度混匀3分钟，或持续混匀直至所有孔中的溶液颜色由绿色完全变为黄色。

然后，读取各样品的光密度值，并使用微孔板软件将各样品中的皮质醇水平转换为每毫克皮克（pg/mg）。在此代表性分析中，经异丙醇清洗的鳍条样品中的皮质醇水平 tends to be higher than those washed with water，但在不同鲟鱼物种之间，鳍条皮质醇水平未观察到显著差异。洗涤溶剂与鲟鱼物种之间无显著交互作用。

通过检测H.Huso鲟鱼颌骨中的皮质醇，以确定鲟鱼颌骨是否可作为鳍组织的替代基质，结果表明，清洗溶剂对H.Huso鲟鱼中测得的皮质醇水平无显著影响。此外，数据还显示，所测试的三种鲟鱼的鳍组织之间以及H.Huso的颌骨之间具有高度相似性。为成功测定皮质醇，必须使用珠磨机将样品研磨成细粉，并选用合适的商用ELISA检测试剂盒。

该方法还可用于检测牙齿及其他硬质基质中的皮质醇，因为皮质醇水平的测定可提供有关环境如何影响动物生物学的重要信息。该方法可作为评估人类儿童乳牙中皮质醇水平的新途径，并可用于儿科内分泌学、心理生物学、行为学、考古学及法医学研究。