使用 CRISPR/Cas9 系统将基因敲除直接引入克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的无鞭毛体阶段

由于无鞭毛体是专性胞内寄生虫，因此在实验中很难利用克氏锥虫（T. cruzi）的宿主感染阶段。我们的培养技术可使无鞭毛体在宿主细胞外暂时进行复制，从而能够直接对该寄生虫具有临床相关性的阶段开展实验。本次实验操作将由本研究所的技术员 Yukie Akutsu 进行示范。

根据手稿说明维持宿主与寄生虫的共培养。当表达Cas9的寄生虫准备进入分化阶段时，将上清液收集至锥形管中，并在显微镜下检查样品质量。如果存在大量胞外无鞭毛体，应进行游离分离操作以纯化出锥虫形态体。

将上鞭毛体和无鞭毛体混合物在2,100 × g条件下离心15分钟。然后弃去大部分上清液，管中保留0.5至1毫升培养基。将管盖松开，将沉淀物在37°C孵育1至2小时，以使活跃的上鞭毛体从沉淀中游出。孵育结束后，将含有上鞭毛体的上清液转移至1.5毫升微量离心管中。

离心沉淀，并用 5 毫升 DMEM 重悬沉淀物。将寄生虫转移至 T-25 培养瓶中，在 37°C、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育。约 95% 的寄生虫将在 24 小时后分化为无鞭毛体。

将无鞭毛体培养物在2,100 × g条件下离心15分钟，弃去上清液。用含有提供的补充液的电穿孔缓冲液重悬沉淀，使最终细胞密度达到每毫升1 × 10⁸个细胞。将100 µL重悬的寄生虫分装至1.5 mL微量离心管中。

然后加入5至10微克的向导RNA，用移液器轻轻混匀。将混合物转移至2毫米间隙的电穿孔比色皿中，使用电穿孔仪施加电脉冲。接着，将比色皿中的内容物转移至含有5毫升预热LIT培养基的T-25培养瓶中，松开瓶盖，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。

通过继续无菌培养或在宿主细胞感染后作为细胞内无鞭毛体来监测细胞生长。若监测无菌无鞭毛体的生长，需轻轻振荡培养瓶，使细胞外的无鞭毛体重新悬浮于溶液中，然后在微量离心管中将20 µL培养物与1 µL碘化丙啶溶液混合。应注意避免将培养瓶在培养箱外放置过久，因为温度是影响无鞭毛体无菌增殖的关键因素之一。

将样品接种到血细胞计数板上，在荧光显微镜下观察。然后计数未被碘化丙啶染色的有活力无鞭毛体数量。为监测基因敲除细胞作为细胞内无鞭毛体的生长情况，将宿主3T3细胞接种于含DMEM的12孔板中。

电穿孔后一天，通过离心收集敲除型无鞭毛体，弃去上清液，并用两毫升 DMEM 重悬寄生虫。移除宿主细胞培养物中的培养基，加入重悬的无鞭毛体。将培养板置于 37 °C、5% 二氧化碳条件下孵育两天，以使无鞭毛体建立感染。

两天后，用 DMEM 洗去宿主细胞外的胞外无鞭毛体，并加入新鲜的 DMEM。继续培养两天，然后对宿主细胞的细胞核以及细胞内无鞭毛体进行成像观察。已有研究表明，转染了针对必需基因 TcCGM1 的向导 RNA 的克氏锥虫无鞭毛体，与对照组相比表现出显著的生长缺陷。

在监测作为细胞内无鞭毛体的生长情况时，与对照组相比，TcCGM1基因敲除组中与宿主细胞核相关联的克氏锥虫（T. Cruzi）细胞核比例显著降低。相反，转染针对副鞭毛杆蛋白之一TcPAR1的向导RNA后，在无血清培养四天后对细胞生长无显著影响，也不抑制细胞内无鞭毛体的生长。然而，在感染后第五天，与对照共培养组相比，TcPAR1基因敲除共培养组中从宿主细胞释放出的锥鞭毛体数量显著减少。

此外，对照组中宿主细胞内分化的上鞭毛体比基因敲除组中的上鞭毛体表现出更高的活动性。该方法也可用于研究外源基因对无鞭毛体阶段的影响，此时无需将引导RNA转染至表达Cas9的无鞭毛体中，而是可将质粒转染至野生型无鞭毛体中以表达外源基因。