一种基于强健聚合酶链反应的测定法，用于定量易碎 X 智力迟钝-1 基因中的细胞氨酸-鸟-鸟-鸟- 三核苷酸重复
2019年9月16日
精确和强大的聚合酶链反应测定，用于量化易碎 X 智力迟钝-1 基因中细胞氨酸-瓜氨酸-鸟-鸟三核苷酸重复，有助于分子诊断和筛选易碎 X 综合征和易碎 X 相关周转时间较短，设备投资时间缩短。
这种经济高效的方法在FXS和易碎X相关疾病的分子诊断和筛选中具有广泛的应用。周转时间快，设备投资少。我们基于 PCR 的测定可促进各种 FXS 和脆弱 X 相关疾病的分类，包括中间、预突变和完全突变，具有鲁棒性和快速报告时间。
来自新加坡珀金埃尔默的蔡文将演示这一程序。首先从 20 摄氏度的冰柜中取出 PCR 缓冲液混合物、样品稀释剂和 DNA 样品，并在室温下解冻 20 至 30 分钟。在使用试剂之前，涡流并短暂旋转。
使用分光光度计测量DNA样品浓度，如有必要，用样品稀释剂稀释至每微升25纳米。标记 PCR 板的孔，以识别参考和测试的 DNA 样本，并计算测试、参考和阴性控制样本所需的反应数。通过将 15 微升 PCR 缓冲液混合到 0.6 微升样品稀释剂和 0.4 微升聚合酶，准备 PCR 主混合物。
漩涡混合和旋转下来。然后将混合物的18微升倒入每井中。然后移液将每个DNA的两个微升放入适当的井中。
通过上下移液五次混合试剂，然后密封板。将板放在热循环器中，然后根据手稿指示运行 PCR。将孵化器摇床预热至 65 摄氏度，并将 80 微升 1X TE 缓冲液添加到每个 PCR 产品中。
使用多通道移液器将样品转移到 PCR 清理板，然后将板放入摇床中。在 65 摄氏度下孵育，同时在 1200 RPM 下摇晃 10 分钟。孵育后，将孵化器摇床冷却至25摄氏度，将真空仪器设置为250毫巴，并通过过滤器吸气溶液。
15分钟后，油井应没有剩余液体。关闭真空，向每井添加 50 微升 1X TE 缓冲液。使用以前的真空设置吸化解决方案 10 分钟。
将滤盘底部用力压在一叠纸巾上，然后将 20 微升 1X TE 缓冲液添加到每个井的底部中心，以干燥滤板的底部。将板放在摇床中，在 25 摄氏度下孵育，同时在 1200 RPM 下摇晃 5 分钟。孵育后，将净化PCR产品的至少15微升转移到新鲜的96井PCR板中。
在开始之前，将DNA染料浓缩物、DNA凝胶基质、DNA标记、DNA梯和纯化DNA样本带到室温。通过更换注射器并调整底板来设置吸油站，然后松开注射器夹的操纵杆，将其滑到顶部位置。启动尺寸调整软件并准备凝胶染料混合物。
涡流染料浓缩10秒，然后旋转下来。然后，将25微升染料加入凝胶基瓶，并涡旋溶液混合。将凝胶染料混合物转移到旋转过滤器中，将其放在离心机中，并在 1500 倍 g 下旋转 10 分钟。
当准备加载凝胶染料混合物时，将新的 DNA 芯片插入注油站，并将 9 微升的凝胶染料混合物加入标有 G.Close 的注油站，并确保柱塞位于一毫升标记的位置。按下注射器柱塞，直到夹夹按住。等待整整 30 秒，然后释放剪辑。
再等五秒钟，然后慢慢将柱塞拉回一毫升的位置。打开注油站，在标有 G.的井中加入 9 微升凝胶染料混合物，在标有梯子符号的井中加入 5 微升标记，并在 12 个样品井中各加入一个。将梯子的一微升添加到井中，带梯子符号，将 PCR 产品或水的微升添加到样品井中。
在 2400 RPM 转速下旋转芯片一分钟。将其插入生物分析器，并在五分钟内运行芯片。运行完成后，将峰值数据导出为 csv 表文件。
预突变母样品和全突变母样品用作参考样本。片段大小剖面中包括上部和下标记峰，并且通常有一个底向复合峰值，大约为 95 个基对。这些参考样本用于构造回归标准曲线。
然后使用线性回归标准曲线计算未知样本的重复大小。临床法、中间、预突变、全突变、马赛克全突变样本可用这种方法正确分类。在某些情况下，微流体电泳结果中只显示一个峰值，这很可能是由于存在正常同源等位基因。
一种次优结果是基线偏差，可能不明确或不可解释，并且被怀疑是由仪器故障引起的。在尝试此程序时，在开始协议之前，确保适当数量的DNA和质量非常重要。FMR1基因测序可以进行，以确定AGG中断模式。
和甲基化敏感限制酶或二硫化物修饰测定可用于监测甲基化状态。这是一种快速、可靠且经济高效的技术。它将帮助其他研究人员进行基于人群的关于FXS和脆弱X相关疾病的载体状态的研究。
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概述
本文介绍了一种基于聚合酶链反应的成本效益高的检测方法，用于定量Fragile X 智力障碍-1基因中的胞嘧啶-鳥嘌呤-鳥嘌呤三核苷酸重复。该方法提高了Fragile X 综合征和相关疾病的分子诊断和筛查效率，缩短了周转时间并减少了设备投资。
关键研究组成部分
科学领域
- 分子生物学
- 遗传学
- 临床诊断
背景
- Fragile X 综合征是由FMR1基因突变引起的遗传疾病。
- 传统的诊断方法可能耗时且成本高昂。
- 需要高效且可靠的筛查技术。
- 本研究引入了基于PCR的检测方法以应对这些挑战。
研究目的
- 开发一种用于定量FMR1基因中三核苷酸重复的稳健检测方法。
- 促进Fragile X 综合征和相关疾病的分类。
- 减少分子诊断相关的时间和成本。
所用方法
- PCR缓冲液混合物和DNA样本的制备。
- 在室温下解冻试剂。
- 使用前将样本混涡并离心。
- 应用PCR检测方法对FXS和相关疾病进行分类。
主要结果
- 该检测方法在检测各种突变方面表现出稳健性。
- 结果报告速度快，有助于临床决策。
- 它有效地分类了Fragile X相关疾病的全谱。
- 该方法被证明在设备要求最小的情况下具有成本效益。
结论
- 基于PCR的检测方法是Fragile X 诊断的重大进步。
- 它提供了一种可靠和高效的传统方法替代方案。
- 这种方法可以通过及时诊断改善患者预后。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of CGG trinucleotide repeats in the FMR1 gene is critical for early-stage target validation and risk stratification in neurogenetic disorder pipelines. This robust PCR-based assay enables reproducible, scalable, and cost-effective measurement of repeat expansions, supporting confident classification and triage of Fragile X-associated genetic liabilities. Its rapid turnaround and broad dynamic range facilitate integration into high-throughput screening and translational research workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of FMR1 CGG repeat expansions for genetic target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing normal, intermediate, premutation, and full mutation alleles.
- Facilitates portfolio triage by providing actionable genetic classification data.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible PCR-based outputs suitable for downstream molecular screening.
- Standardizes fragment sizing and repeat quantification using reference standards and regression analysis.
- Enables scalable, high-throughput screening of population or cohort samples for carrier status.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic classification with disease-relevant models for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust genotyping.
- Reduces biological ambiguity in preclinical model selection and risk-adjusted advancement.
Pipeline & Workflow Integration
This PCR-based quantification method fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless integration into genetic screening, target validation, and translational biomarker workflows.
- Discovery Biology: Provides quantitative, hypothesis-driven assessment of FMR1 repeat expansions for mechanistic studies.
- Screening: Offers reproducible, standardized outputs for assay development and population screening.
- Analytics: Generates quantitative fragment sizing and regression-based repeat number determination for robust data comparison.
- Translational Research: Supports alignment of genetic findings with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, cost-effective platform for ongoing genetic screening and research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable assay performance with rapid turnaround.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early, accurate genetic classification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurogenetic disorder programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR, capillary electrophoresis, and data analysis software.
- Needs access to thermocyclers, microfluidic capillary electrophoresis instruments, and validated reference standards.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Adaptable to various sample types but dependent on DNA quality and quantity.
- Instrument malfunction or suboptimal sample quality can affect data interpretability and require troubleshooting.
