Name: 一种基于强健聚合酶链反应的测定法，用于定量易碎 X 智力迟钝-1 基因中的细胞氨酸-鸟-鸟-鸟- 三核苷酸重复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解基于强健聚合酶链反应的测定法，用于定量FMR1基因中的CGG三核苷酸重复。该方法可快速分类脆性X综合征及相关疾病，具有成本低、设备投资少的优势，适用于分子诊断和筛查。

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本研究得到了国家自然科学基金应急管理项目（项目编号：81741004）、国家自然科学基金（项目编号：81860272）、广西壮族自治区科技计划重大项目（项目编号：AB16380219）、中国博士后科学基金（项目编号：2018M630993）以及广西自然科学基金（项目编号：2018GXNSFAA281067）的资助。

伦理批准由香港中文大学—新界东联合临床研究伦理委员会授予（参考编号：2013.055）
1. PCR 扩增
<ol>
	<li>开始前，从 -20 °C 冰箱中取出 PCR 缓冲液混合物、样本稀释液以及 DNA 样本（包括测试和参考 DNA）（参见材料表），在室温下放置 20–30 分钟，确保所有试剂和 DNA 完全解冻。使用前充分涡旋振荡并短暂离心。</li>
	<li>使用分光光度计测定 DNA 样本的浓度（参见材料表）。DNA 浓度应为 25 ng/µL；如需要，用样本稀释液稀释至适当浓度。 
	注意：DNA 应经过提取和纯化，以去除可能干扰的物质，如蛋白质和高浓度盐。后续 PCR 扩增与分析应使用未降解的高质量 DNA（A260/A280：1.8–2.0，A260/A230：&#62;1.0）。</li>
	<li>标记 PCR 板的孔位或 0.2 mL PCR 管，以区分参考样本和待测 DNA 样本。</li>
	<li>计算测试样本、2 个参考样本及阴性对照样本所需的 PCR 反应数。每反应加入 15 µL PCR 缓冲液混合物、2.6 µL 样本稀释液和 0.4 µL 聚合酶，配制 PCR 主混合液。 
	注意：使用样本稀释液作为阴性对照对于监测 PCR 性能至关重要。PCR 主混合液应在室温下配制，切勿在冰上移液。PCR 缓冲液混合物具有黏性，使用前需充分混匀并短暂离心。</li>
	<li>将步骤 1.4 中的 PCR 主混合液涡旋振荡 10–20 秒，然后离心。缓慢将 18 µL 混合液分装至各孔或管中。</li>
	<li>对 DNA 样本进行涡旋振荡并离心。每份 DNA 取 2 µL 加入对应的孔或管中，使最终 PCR 体积为 20 µL。通过上下吹打 5 次混匀。 
	注意：每反应中 DNA 总量应为 50–100 ng。若每 20 µL PCR 反应中 DNA 量超过 150 ng，可能导致大片段重复等位基因扩增效果不佳。对于浓度较低的 DNA，可在 PCR 主混合液中用 DNA 溶液替代部分样本稀释液。</li>
	<li>用粘性封板膜或管盖密封 PCR 板或管。</li>
	<li>将密封好的 PCR 板或管放入带加热盖的热循环仪中。运行以下程序：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 25 个循环（98 °C 变性 35 秒，59 °C 退火 35 秒，72 °C 延伸 4 分钟），最后 72 °C 延伸 10 分钟。PCR 产物完成后保持在 4 °C，直至取出进行后续处理。</li>
	<li>PCR 扩增完成后，应立即纯化并分析产物，或在 +2 至 +8 °C 下过夜保存。也可在 -30 至 -16 °C 下保存最多 30 天。</li>
</ol>
2. PCR 产物的纯化
<ol>
	<li>将恒温振荡培养箱预热至 65 °C。</li>
	<li>对于每个 PCR 反应，向第 1 步中的 20 µL PCR 产物中加入 80 µL 的 1x TE 缓冲液（参见材料表）。</li>
	<li>使用多通道移液器将样品混合物转移至 PCR 纯化板（参见材料表）。</li>
	<li>保持板未加盖状态，将其放入恒温振荡培养箱中，在 65 °C 下以 1,200 rpm 振荡孵育 10 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，将真空装置设定为 250 mbar（或 25 kPa、188 mmHg、7.4 in Hg），通过滤膜抽吸溶液 15 分钟，各孔中应无液体残留。</li>
	<li>将恒温振荡培养箱降温至 25 °C。</li>
	<li>首次抽吸完成后，关闭真空，向每孔中加入 50 µL 的 1x TE 缓冲液，不要混匀。使用步骤 2.5 中的真空设置抽吸溶液 10 分钟。</li>
	<li>将滤板底部用力按压在叠好的纸巾上，使其干燥。</li>
	<li>向每孔底部中央加入 20 µL 的 1x TE 缓冲液。将板放入恒温振荡培养箱中，在 25 °C 下以 1,200 rpm 振荡孵育 5 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，将步骤 2.9 中获得的每份纯化 PCR DNA 超过 &#62;15 µL 转移至新的 96 孔 PCR 板。纯化后的 DNA 可直接进行分析，或根据需要储存于 -30 至 -16 °C。</li>
</ol>
3. PCR 产物的片段大小分析
<ol>
	<li>开始前，将DNA染料浓缩液、DNA凝胶基质、DNA标记物、DNA ladder以及步骤2中纯化的DNA样品在室温下平衡30分钟。</li>
	<li>设置上样工作站。
	<ol>
		<li>每次使用新批次试剂时，需更换注射器（参见材料表）。</li>
		<li>调整底板位置，松开注射器夹的杠杆，并将其向上滑动至顶部位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动片段分析软件（参见材料表），并配制凝胶-染料混合液。</li>
	<li>将染料浓缩液涡旋振荡10秒后离心。向一支凝胶基质小瓶中加入25 μL染料，充分涡旋混匀后离心。
	<ol>
		<li>将凝胶-染料混合液转移至离心过滤器中。将离心过滤器放入微量离心机，在室温下以1,500 × g ± 20% 离心10分钟。 
		注意：含染料的溶液需避光保护，使用后储存于4 °C。配制好的凝胶-染料混合液可使用约15次芯片。每次使用前需将其在室温下平衡30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载凝胶-染料混合液。
	<ol>
		<li>将新的DNA芯片插入上样工作站。向标有“G”的孔中加入9 μL凝胶-染料混合液。请确保推杆位于1 mL刻度处，然后关闭上样工作站。</li>
		<li>按下注射器推杆直至被夹子固定。准确等待30秒后松开夹子，再等待5秒，然后缓慢将推杆拉回至1 mL位置。</li>
		<li>打开上样工作站，向所有标有“G”的孔中各加入9 μL凝胶-染料混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向标有ladder符号的孔中加入5 μL标记物，并向其余12个样品孔中也各加入5 μL标记物。不得留有任何空孔。</li>
	<li>向标有ladder符号的孔中加入1 µL DNA ladder。向每个12个样品孔中分别加入1 µL步骤3.1所得的PCR产物（已使用的孔）或1 µL超纯水（未使用的孔）。将芯片水平放入涡旋混合器的适配器中，在指定设置下（2,400 rpm）涡旋振荡1分钟。</li>
	<li>将芯片插入生物分析仪仪器中，并在5分钟内启动运行。</li>
	<li>检测完成后，立即从仪器中取出已使用的芯片。</li>
	<li>向电极清洗液的一个孔中缓慢加入350 μL去离子水。打开生物分析仪盖子，将电极清洗液放入其中。关闭盖子，孵育约10秒。打开盖子并取出电极清洗液。再等待10秒，使电极上的水分蒸发，然后关闭盖子。</li>
</ol>
4. 分析片段大小检测结果
注意：参考样本应与未知样本在同一轮实验中，使用相同的热循环仪和生物分析仪进行扩增和分析。
<ol>
	<li>生物分析仪运行完成后，将每次运行的峰数据导出为 .csv 表格文件，以供后续分析。</li>
	<li>启动分析软件，并打开步骤 4.1 中导出的 .csv 峰值数据表文件。</li>
	<li>通过 QC 菜单选项卡，查看对两个参考样本的四个数据点（图中以蓝色菱形显示）拟合的回归直线。回归直线的 R2 值应&#62;0.98（典型值超过 0.999）。</li>
	<li>通过 Results 菜单选项卡，检查各样本的重复片段大小，软件会自动将各样本的片段长度绘制在由参考样本生成的线性回归标准曲线上。软件还会根据不同的指南对每个样本进行分类。</li>
	<li>通过 Export 菜单选项卡，导出每个样本的结果报告，包括重复次数和诊断分类，以及每次运行的样本信息汇总和质控报告。 
	注意：分析软件支持使用自定义分类指南，例如美国医学遗传学学会（ACMG）或临床分子遗传学学会/欧洲人类遗传学学会（CMGS/ESHG）指南，也支持使用预设的分类标准。</li>
</ol>

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<li>Seltzer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+B+Neuropsychiatrics+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li>
<li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+determining+repeat+number%2C+methylation+status%2C+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li>
<li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene%3A+a+new+case%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

脆性X综合征（FXS）是继21三体综合征之后智力障碍的第二大常见原因，占X连锁智力障碍病例的近一半30，其发病率约为每4,000名男性中有1例，每8,000名女性中有1例。更重要的是，大约每250至1,000名女性中就有1人为前突变携带者，而在男性中的携带频率约为每250至1,600人中有1例26,31,32,33。由于前突变等位基因在遗传给后代时，CGG重复序列扩增为全突变的风险显著升高，例如，当母源重复数为55–59时，扩增风险为4%，而当重复数达到100–200时，风险则升至98%14，因此，在更广泛的范围内测定CGG重复数有助于脆性X综合征的诊断以及对前突变携带者的筛查，从而支持其生育规划。本文介绍的基于PCR的方法可准确、快速且稳健地扩增FMR1基因启动子区5’...

脆性X综合征（FXS）以及脆性X相关疾病，例如震颤共济失调综合征（FX-TAS）和原发性卵巢功能不全（FX-POI），主要由位于Xq27.3的脆性X智力低下-1（FMR1）基因5’非翻译区（UTR）中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤（CGG）三核苷酸重复序列扩增所致1,2。FMR1基因编码的蛋白质（FMRP）是一种与多聚核糖体结合的RNA结合蛋白，通过调控mRNA的可变剪接、稳定性及树突运输，或调节部分突触后蛋白的合成，在神经元发育和突触可塑性中发挥功能3,4,5,6,7。
CGG重复长度的动态变化 &#62;200 被定义为完全突变，可导致异常的高甲基化，进而引发转录沉默 FMR1 启动子8FMRP蛋白的缺失或缺乏会破坏正常的神经元发育，从而导致脆性X综合征（FXS）9，其特征为多种临床症状，包括中至重度智力障碍、发育迟缓、多动行为、社交障碍及自闭症表现10,11,12女性脆性X综合征患者的表型通常比男性患者更轻。CGG重复数在55至200之间和45至54之间分别被归类为前突变和中间型状态。由于高度不稳定，前突变或中间型等位基因在从父母传递给后代时，其CGG重复数可能扩增。13,14因此，携带前突变等位基因的个体由于重复序列的扩增，其子女患脆性X综合征（FXS）的风险很高；在某些情况下，中间等位基因可在两代之内将其重复序列扩增至全突变范围。15,16此外，携带前突变的男性患迟发性FX-TAS的风险也增加17,18,19而携带前突变的女性则易患FX-TAS和FX-POI20,21,22最近有报道称，携带前突变的儿童会出现伴有发育迟缓及社交行为障碍的自闭症谱系障碍 FMR1 等位基因23,24.
确定精确的CGG重复次数对于脆性X综合征（FXS）及相关脆性X障碍的分类和预测具有重要意义25,26。传统上，针对CGG重复区域的特异性聚合酶链式反应（PCR）结合片段大小分析以及Southern印迹分析，一直是FMR1基因CGG重复序列分子分型的金标准27。然而，传统的特异性PCR对重复次数超过100至130次的大前突变敏感性较低，且无法扩增全突变序列27,28。此外，使用传统遗传分析仪进行毛细管电泳以测定重复次数时，无法检测到含有超过200次CGG重复的FMR1 PCR产物。Southern印迹分析能够区分更宽范围的重复次数，从正常重复数到全突变重复数，广泛用于确认男性患者的全突变，以及区分女性患者中携带全突变的杂合等位基因与表现为纯合但重复次数正常的等位基因。然而，该方法在重复次数定量方面的分辨率有限。更重要的是，这种分步检测策略耗时长、劳动强度大，且成本效益较低。
本文介绍一种基于 PCR 的准确且稳健的方法，用于定量 FMR1 基因中的 CGG 重复次数。该检测的第一步是使用脆性 X 检测试剂盒（Fragile X PCR kit）对 FMR1 启动子区 5’UTR 中的重复序列进行 PCR 扩增。扩增产物经纯化后，采用微流控毛细管电泳仪进行片段大小分析，并通过分析软件参照已知重复数的标准品，根据 PCR 片段长度与 CGG 重复次数成正比的原理，确定 CGG 重复数。该 PCR 体系包含可促进高 GC 含量三核苷酸重复区域有效扩增的试剂。此基于 PCR 的检测方法具有良好的重复性，能够识别 FMR1 启动子区所有范围的 CGG 重复次数。该方法成本较低， turnaround 时间短，对设备投入要求少，适用于脆性 X 综合征（FXS）及脆性 X 相关疾病的分子诊断与筛查，在更广泛的临床实验室中具有广泛应用前景。

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：0.2 mL PCR 管</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：1x TE 缓冲液，pH 8.0，RNase-free</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：2100 Bioanalyzer 仪器</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：96 孔 PCR 板</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0800</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：电极盒</td><td>Agilent</td><td></td><td>提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：IKA 涡旋混合器</td><td>Agilent</td><td></td><td>提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：Sizing 软件 2100 Expert 软件</td><td>Agilent</td><td></td><td>提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器：检测芯片</td><td>Agilent</td><td></td><td>提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1506</td><td>用于片段大小分析</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 Ladder（黄色盖）</td><td>Agilent</td><td></td><td>包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 7500 标记物（绿色盖）</td><td>Agilent</td><td></td><td>包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 芯片</td><td>Agilent</td><td></td><td>包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 染料浓缩液（蓝色盖）</td><td>Agilent</td><td></td><td>包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：DNA 凝胶基质小瓶（红色盖）</td><td>Agilent</td><td></td><td>包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：电极清洁剂</td><td>Agilent</td><td></td><td>包含于 Agilent DNA 7500 试剂盒中（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：离心过滤柱</td><td>Agilent</td><td></td><td>Agilent DNA 7500 试剂盒的耗材（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 试剂盒：注射器</td><td>Agilent</td><td></td><td>Agilent DNA 7500 试剂盒的耗材（目录号：5067-1506）</td></tr><tr><td>芯片预处理站</td><td>Agilent</td><td>5065-4401</td><td>提供 2100 Bioanalyzer 仪器的设备</td></tr><tr><td>Cubee 小型离心机</td><td>GeneReach</td><td>aqbd-i</td><td></td></tr><tr><td>滤板真空装置：MultiScreenHTS 真空装置</td><td>Merck Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>用于 PCR 产物纯化的滤板真空装置</td></tr><tr><td>滤板真空装置：硅胶塞</td><td>Merck Millipore</td><td>XX2004718</td><td>滤板真空装置</td></tr><tr><td>滤板真空装置：真空泵</td><td>Merck Millipore</td><td>WP6122050</td><td>滤板真空装置</td></tr><tr><td>滤板真空装置：废液收集瓶</td><td>Merck Millipore</td><td>XX1004705</td><td>滤板真空装置</td></tr><tr><td>FragilEase Fragile X PCR 试剂盒</td><td>PerkinElmer</td><td>3101-0010</td><td>用于 PCR 扩增</td></tr></tbody></table>

一种基于聚合酶链式反应的稳定检测方法，用于定量脆性x智力低下-1基因中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤三核苷酸重复序列

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

脆性X综合征（FXS）及相关疾病是由脆性X智力低下基因-1（FMR1）启动子区5’非翻译区（UTR）中胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤（CGG）三核苷酸重复序列扩增所致。传统上，采用遗传分析仪进行毛细管电泳片段分析来测定FMR1基因CGG重复数，但当重复数超过200时，需额外进行Southern印迹分析以获得精确测量结果。本文介绍一种准确且可靠的基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，用于定量FMR1基因的CGG重复序列。该检测的第一步是使用脆性X PCR试剂盒对FMR1启动子5’UTR中的重复序列进行PCR扩增，随后对PCR产物进行纯化，并在微流控毛细管电泳仪器上进行片段大小分析，再通过分析软件比对已知重复数的标准品，确定CGG重复次数。该基于PCR的检测方法具有良好的重复性，能够识别FMR1启动子全部范围的CGG重复数，包括重复数超过200（归类为完全突变）、55至200（前突变）、46至54（中间型）以及10至45（正常型）。该方法成本效益高，具有良好的稳健性且报告速度快，有助于对FXS及脆性X相关疾病进行分类诊断。

前突变女性参考样本（NA20240，重复次数分别为30和80）和全突变女性参考样本（NA20239，重复次数分别为20和200）的片段大小分析结果分别如图1A和图1B所示。通常，片段大小图谱中包含两个标记峰（下标记为50碱基对[bp]，上标记为10,380 bp）。通常还会出现一个大小接近95 bp的引物复合物峰。通过该参考样本，可构建包含四个数据点的线性回归标准曲线，如图1C所示。
临床正常、中间型、前突变和全突变样本的代表性片段大小特征如图2A–D所示。特别是，嵌合型全突变样本在微流控电泳图谱中呈现两个扩增片段峰和一个正常峰，如图2E所示。在部分女性样本中，微流控电泳结果仅显示一个峰，如图2F</strong...

一种基于聚合酶链式反应的准确且稳健的检测方法，可用于定量脆性X智力低下基因-1（Fragile X mental retardation-1 gene）中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤（CGG）三核苷酸重复序列，有助于以更短的周转时间和更低的设备投入，实现对脆性X综合征及相关脆性X障碍的分子诊断和筛查。

一种基于聚合酶链式反应的稳定检测方法，用于定量脆性X智力低下-1基因中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤三核苷酸重复序列

脆性X综合征（FXS）及相关疾病是由位于5'非翻译区的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤（CGG）三核苷酸重复序列扩增所致。

这种经济高效的方法可广泛应用于脆性X综合征（FXS）及相关脆性X障碍的分子诊断和筛查。该方法周转时间快，设备投入成本低。我们基于PCR的检测方法能够稳健地对FXS及相关脆性X综合征的全谱系突变进行分类，包括中间型、前突变型和全突变型，并实现快速报告结果。该实验步骤将由新加坡珀金埃尔默公司的Weng Chua演示。首先从-20摄氏度冰箱中取出PCR缓冲液混合物、样本稀释液和DNA样本，在室温下放置20至30分钟使其解冻。使用试剂前，需涡旋振荡并短暂离心。 使用分光光度计测定DNA样本的浓度，如有需要，用样本稀释液将其稀释至每微升25纳克。标记PCR板上的孔位，以区分参考样本和待测DNA样本，并计算检测样本、参考样本及阴性对照样本所需的反应数。按每份反应加入15微升PCR缓冲液混合物、0.6微升样本稀释液和0.4微升聚合酶的比例配制PCR主混合液。涡旋混匀混合物并短暂离心。然后将18微升混合物分装至每个孔中。再用移液器将每种DNA各2微升加入相应的孔中。用移液器上下吹打混合试剂五次，然后密封反应板。将反应板放入热循环仪中，按照文稿中的说明运行PCR程序。提前将恒温振荡培养箱预热至65摄氏度，并向每份PCR产物中加入80微升1X TE缓冲液。使用多通道移液器将样品转移至PCR纯化板中，并将该板放入振荡器。在65摄氏度下以1200转/分钟振荡孵育10分钟。孵育结束后，将振荡器温度冷却至25摄氏度，将真空装置设置为250毫巴，通过滤膜抽吸溶液。15分钟后，孔内应无残留液体。关闭真空泵，向每孔中加入50 µL 1× TE缓冲液。使用先前的真空设置抽吸溶液10分钟。将滤板底部用力压在叠好的纸巾上以干燥，然后向每个孔的底部中央加入 20 µL 1× TE 缓冲液。将板放入摇床中，在 25 °C、1200 RPM 条件下振荡孵育 5 分钟。孵育结束后，将至少 15 µL 纯化后的 PCR 产物转移至新的 96 孔 PCR 板中。开始实验前，将DNA染料浓缩液、DNA凝胶基质、DNA标记物、DNA分子量标准品以及纯化的DNA样本恢复至室温。通过更换注射器并调节底板来设置上样工作站，然后松开注射器夹的杠杆，并将其滑动至顶部位置。启动片段分析软件，并配制凝胶染料混合液。将染料浓缩液涡旋震荡10秒，然后离心沉降。接着，向凝胶基质小瓶中加入25 µL染料，并涡旋震荡溶液以混匀。将凝胶染料混合液转移至离心过滤器中，放入离心机，在1500 ×g条件下离心10分钟。准备上样胶染料混合物时，将新的DNA芯片插入上样工作站，并向标记为G的孔中加入9微升胶染料混合物。关闭上样工作站，确保推杆位于1毫升刻度处。按下注射器推杆直至被卡扣固定，准确等待30秒，然后松开卡扣。等待五秒钟后，缓慢将活塞拉回至一毫升位置。打开预热站，向标记为 G 的孔中加入九微升上样缓冲液混合物。向标记有梯形符号的孔以及每个样品孔（共12个）中加入五微升分子量标记物。向标记梯形符号的孔中加入一微升DNA分子量标记物，向每个样品孔中加入一微升PCR产物或水。将芯片在2400 RPM下涡旋震荡一分钟。在五分钟内将芯片插入生物分析仪并运行。运行完成后，将峰数据导出为csv表格文件。使用前突变女性样本和全突变女性样本作为参考样本。片段大小分析谱图中包含一个上游和一个下游标记峰，通常在约95个碱基对处出现引物复合物峰。这些参考样本用于构建回归标准曲线。然后利用线性回归标准曲线计算未知样本的重复序列长度。该方法可正确分类临床正常、中间型、前突变、完全突变以及嵌合型完全突变样本。在某些情况下，微流控电泳结果中仅显示一个峰，这可能是由于存在正常的纯合等位基因所致。一种非理想结果是基线偏差，其表现可能模糊或难以解释，并疑似由仪器故障引起。在进行该操作时，务必在开始实验方案前确保 DNA 的适量和高质量。可对 FMR1 基因进行测序，以鉴定 AGG 中断模式。可以使用甲基化敏感性限制性内切酶或亚硫酸氢盐修饰检测来监测甲基化状态。这是一种快速、稳健且经济高效的技术，将有助于其他研究人员开展基于人群的脆性X综合征（FXS）及脆性X相关疾病携带者状态的研究。

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科研

JoVE Journal

Genetics

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