Name: 细胞周期特异性测量βH2AX和细胞凋亡后热源毒性应力通过流细胞测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 了解如何通过流式细胞术测量细胞周期特异性βH2AX和细胞凋亡，以评估DNA双链断裂的诱导与修复。该方法整合DNA损伤应答关键终点，适用于放射生物学和临床肿瘤学研究。

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我们感谢德国癌症研究中心（DKFZ）流式细胞术设施团队提供的支持。

1. 准备
<ol>
	<li>以任何类型的培养容器准备每样本不少于 1 × 105 个细胞作为起始材料。
	<ol>
		<li>例如，在U87胶质母细胞瘤细胞暴露于电离辐射后进行时间进程实验：将处于亚融合状态的U87细胞接种于T25培养瓶中，每个时间点设三个重复，进行辐照处理。选择早期时间点（辐照后15分钟至8小时）以追踪DNA双链断裂（DSB）修复的动力学过程（γH2AX水平），并选择晚期时间点（24小时至96小时）以评估残留的DSB水平、细胞周期效应及细胞凋亡情况。 
		注意：本方案不限于辐照实验或特定细胞系。该方法已广泛应用于多种类型、不同物种来源的细胞系，并适用于各种处理条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制以下溶液，并额外准备10%体积以弥补损耗。
	<ol>
		<li>每样本准备2 mL固定液，由4.5%多聚甲醛（PFA）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中配制而成。现用现配。在通风橱内，将PFA加入PBS中，于80 °C下缓慢搅拌加热溶解。用铝箔包裹容器以减少热量散失。待溶液冷却至室温后定容，并通过折叠的3hw级纤维素滤膜过滤（参见材料表）。 
		注意：PFA蒸气有毒。操作时务必在通风橱中进行，并妥善处理PFA废弃物。</li>
		<li>每样本准备3 mL透化液，由70%乙醇溶于冰冻H2O中配制而成。储存于-20 °C。</li>
		<li>每样本准备7 mL洗涤液&#160;，由0.5%牛血清白蛋白（BSA）溶于PBS中配制而成。</li>
		<li>每样本准备100 µL抗体稀释液，由3% BSA溶于PBS中配制而成。</li>
		<li>每样本准备100–250 µL DNA染色液，由1 μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶于PBS中配制而成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将离心机设置为适用于15 mL离心管的条件：200 × g 离心5分钟，温度7 °C。预先冷却离心机，并在所有离心步骤中使用此设定。</li>
</ol>
2. 样品采集
<ol>
	<li>若处理贴壁细胞（例如，在T25培养瓶中使用含10%胎牛血清的5 mL DMEM培养基于37 °C及5%二氧化碳气氛中培养的U87胶质母细胞瘤细胞），请继续进行步骤2.1.1和2.1.2；悬浮细胞则直接进入步骤2.1.2。
	<ol>
		<li>将培养基收集至离心管中。采用常规细胞培养方法使细胞脱离，可使用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）或其他细胞解离试剂。
		<ol>
			<li>对于U87细胞，将PBS和胰蛋白酶/EDTA（见材料表）预热至37 °C，用1 mL PBS洗涤细胞层，加入1 mL胰蛋白酶/EDTA孵育1–2分钟，并轻敲培养瓶以促进细胞脱落。将所有洗涤液及细胞悬液收集至含有培养基的离心管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>离心细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于1 mL PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反复吹打细胞数次以确保形成单细胞悬液，随后将细胞悬液转移至含有2 mL固定液（4.5% PFA/PBS，终浓度为3%）的离心管中。 
	注意：PFA蒸气有毒。此步骤应在通风橱中操作，并妥善处理PFA废弃物。</li>
	<li>室温孵育10分钟。</li>
	<li>离心细胞，倾倒弃去上清液。</li>
	<li>轻敲离心管使细胞沉淀松散，将细胞重悬于3 mL 70%乙醇中。可立即进行下一步操作，或于4 °C保存样品数周。</li>
</ol>
3. 洗涤与染色
<ol>
	<li>离心细胞，倾倒弃去上清液。</li>
	<li>轻轻敲击离心管使细胞沉淀松散。用3 mL洗涤液（0.5% BSA/PBS）重悬细胞，离心后弃去上清液。</li>
	<li>用3 mL洗涤液重复洗涤1次，再用1 mL洗涤液洗涤1次。最后一步中，弃去上清液。 仔细地 用移液器操作，注意不要吸出沉淀。</li>
	<li>稀释针对 γH2AX、组蛋白 H3（Ser10）磷酸化抗体和半胱天冬酶-3 的抗体（参见 材料表) 在 100 µL/样本的抗体稀释液（3% BSA/PBS）中。</li>
	<li>轻轻敲击离心管使细胞沉淀松散，并将细胞重悬于步骤3.4中配制的100 µL抗体溶液中。从本步骤开始，样品需避光保存。</li>
	<li>室温孵育样品1小时。</li>
	<li>离心细胞并弃去上清液 仔细地 用移液器操作，注意不要吸出沉淀。</li>
	<li>轻轻敲击离心管使细胞沉淀松散，然后将细胞重悬于100–250 µL DNA染色液（1 µg/mL DAPI/PBS）中。
	<ol>
		<li>若为1-2 x10，使用100 µL5 细胞存在时，需增加体积以容纳更多细胞（细胞数量≥1 x 10⁶时，使用250 µL）6 细胞）。直接进行下一步操作，或在4 °C避光保存样品，最长可保存2周。 
		注意： 对于某些细胞类型，优化 DAPI 浓度有助于改善细胞周期各时相的分离效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用孔径为35 µm的细胞滤筛管盖，将样品通过移液器转移至样品管中。</li>
</ol>
4. 测量
<ol>
	<li>将样品置于冰上，启动流式细胞仪（参见材料表），并根据表1配置光学系统，然后按下Prime按钮。如有需要，单独开启紫外激光器（波长355 nm），并通过相应软件将其功率设置为20 mW。</li>
	<li>打开采集软件（参见材料表），登录后点击Browser工具栏中的New Experiment按钮创建新实验。</li>
	<li>使用Inspector窗口自定义实验名称，并选择“5 Log Decades”作为图表显示模式。</li>
	<li>点击Browser工具栏中的New Specimen按钮，并通过点击其左侧的“+”符号展开新条目以显示第一个Tube。选择相应的图标并输入名称，以重命名Specimen（例如细胞类型）和Tube（样本标识符）。点击第一个Tube的Tube Pointer（其左侧的箭头状符号），使其变为绿色（激活状态）。</li>
	<li>在Cytometer窗口中打开Parameters选项卡，并根据表1选择参数。删除所有不必要的参数。 
	注意：参数名称可能因自定义预设而异（例如使用Cy3而非Alexa555）。请确保所选参数与表1中的光学滤光片和检测器相匹配。本设置中所有荧光染料的光路完全独立，无需进行光谱重叠补偿；但如果使用其他光学配置，则可能需要补偿。</li>
	<li>打开Worksheet窗口，并根据图1创建图表。使用相应工具栏按钮绘制2个点图和4个直方图，并点击坐标轴标签选择合适的参数（前向散射（FSC-A）对侧向散射（SSC-A）、DAPI-W对DAPI-A，以及DAPI-A和每种抗体偶联荧光染料的直方图）。</li>
	<li>将对照样品连接至细胞仪，按下仪器上的Run按钮。在软件的Browser窗口中选择第一个试管，然后点击Acquisition Dashboard中的Acquire Data按钮。使用仪器上的Low、Mid或High按钮及fine tuning wheel调节样品进样体积。优先使用Low设置，但应尽量达到每秒至少100个事件（参见Acquisition Dashboard）。</li>
	<li>在Inspector窗口的Parameters选项卡中，参考图1中的点图，调节FSC、SSC和DAPI的检测器电压。若细胞群在直线刻度下过于分散，请将FSC和SSC参数切换至对数刻度。</li>
	<li>按下细胞仪上的待机（Standby）按钮，并继续在软件中进行工作表设置。
	<ol>
		<li>使用Polygon Gate工具在FSC-A对SSC-A图中定义Cells群体，使用Rectangle Gate工具在DAPI-W对DAPI-A图中定义SingleCells群体。按下Ctrl + G键显示Population Hierarchy，点击默认门控名称以重命名。</li>
		<li>随后右键点击所有直方图，从上下文菜单中选择Show Populations | SingleCells。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过依次采集对照样本和处理样本，优化抗体偶联荧光染料的检测器电压，以覆盖完整的动态范围。最大化信噪比，并避免检测器饱和。确保在对照样本和处理样本中，SingleCells群体内的Alexa488峰均未被截断。</li>
	<li>按下细胞仪上的待机（Standby）按钮，并可选地在软件的Worksheet窗口中执行步骤4.11.1–4.11.3，以在样本采集过程中粗略评估处理效应。
	<ol>
		<li>在Population Hierarchy中选择SingleCells，使用Rectangle Gate工具在DAPI-W对DAPI-A图中定义G1群体。右键点击Alexa488直方图，从上下文菜单中选择Show Populations | G1。</li>
		<li>右键点击Alexa488直方图，选择Create Statistics View。再次右键点击Statistics View，选择Edit Statistics View。进入Statistics选项卡，勾选G1群体中Alexa488信号中位数的复选框（取消勾选所有其他选项）。</li>
		<li>在Population Hierarchy中选择SingleCells，使用Interval Gate工具在DAPI-A、Alexa555-A（图1中为Cy3-A）和Alexa647-A直方图中分别定义subG1、M和Casp3+群体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按下细胞仪上的Run按钮，使用软件中的Acquisition Dashboard测量样本。将停止门控设置为All events或Cells门控（若存在大量小颗粒时），并设置记录事件数为10,000。</li>
	<li>点击Next Tube创建新样本，在Browser窗口中重命名，点击Acquire Data开始采集，点击Record Data开始记录。</li>
	<li>从菜单栏选择File | Export | FCS files导出数据。可选地，选择File | Export | Experiments将实验另存为zip文件，以便日后重新导入。 
	注意：可通过Edit | Duplicate without data轻松复用已有实验的设置。</li>
</ol>
5. 数据评估
<ol>
	<li>将“.fcs”文件拖放到流式细胞分析软件的样本浏览器中（参见材料表）。应用如下所示的设门策略： 图2确保在进行下一个子门设置之前，所有样本中的门均适配于相应的细胞群体。
	<ol>
		<li>要将更改应用到所有样本，请在样本浏览器中选择已修改的门，然后按以下步骤复制 Ctrl + C，选择父门，按下 Ctrl + Shift + E 选择所有样本中的等效节点并按下 Ctrl + V 粘贴或覆盖门控。请勿使用分组门控。</li>
		<li>在浏览器中双击第一个样本，以打开SSC-A与FSC-A图。使用 多边形 工具栏中的工具用于定义 细胞 种群（图2，图1），排除碎片对分析的干扰。确保门控范围向右上角足够宽，以容纳处理引起的细胞变化，但朝向图中左下角的边界应适当收紧，以可靠排除细胞碎片。</li>
		<li>双击 细胞 门控以打开新的图窗，并通过点击坐标轴标签将坐标轴更改为 DAPI-W（垂直）与 DAPI-A（水平）。使用 矩形 工具，用于定义 单细胞 种群（图2，图2），在分析中排除双细胞或细胞团（G1期细胞的双细胞具有与G2期和M期细胞相同的DAPI-A强度，但DAPI-W值显著更高）。 
		注意： 不同样本中细胞数量的差异会导致DAPI-A信号强度的整体变化，这是由于DAPI与DNA的平衡结合所致。这不会影响细胞周期分析，但可能需要根据这些变化逐个样本调整单细胞门的右边界。</li>
		<li>双击 单细胞 门控以打开新的绘图窗口，并调整坐标轴以显示DAPI-A直方图。使用 平分线 用于区分具有正常DNA含量的单个细胞的工具（细胞周期 群体）从DNA降解的凋亡细胞中分离亚G1期 群体）。随后在浏览器中选择新的门控，然后按 Ctrl + R 相应地重命名它们（图2，图3）。</li>
		<li>选择 细胞周期 在浏览器中打开并选择 工具 | 生物学 | 细胞周期... 从菜单栏打开细胞周期建模工具，选择 Dean-Jett-Fox25,26 在 模型 通过该部分估算处于G1期、S期和G2/M期的细胞频率（图2，图4）。仅在建模效果不佳时使用约束条件（尽量减少使用） 均方根 模型与数据之间的偏差</li>
		<li>创建门控 G1 (椭圆 工具）， S (多边形 工具）和 G2 + M (椭圆 DAPI-W 与 DAPI-A 图中工具相 细胞周期 细胞群，以实现细胞周期特异性γH2AX的检测（图2，图5）。请勿使用建模工具根据DAPI-A直方图自动进行细胞周期门控，因为这可能导致结果不准确。 
		注意： 可能需要根据上述整体DAPI信号强度的变化，逐个样本沿DAPI-A轴调整门的位置。仅以整体方式移动三个门，不要改变各个门的形状，以避免引入偏差。</li>
		<li>使用 角平分线 用于区分磷酸化组蛋白H3阳性（M 和阴性（M-Alexa555-A 直方图中的细胞 细胞周期 种群（图2，图6）。保持 Ctrl 并选择门控 G2 + M 和 M-. 按压 Ctrl + Shift + A 以创建 G2 (G2+M) &amp;#38; M-) 门</li>
		<li>使用 角平分线 用于区分caspase-3阳性（Casp3+）和阴性（Casp3-Alexa647-A 直方图中的细胞 单细胞 种群（图2，图7）。设置阈值，使得平均值为 Casp3+ 未处理对照组中的群体比例约为0.8%，以确保高灵敏度并最小化批次间的差异。</li>
		<li>按压 Ctrl + T 打开 表格编辑器 并根据以下要求进行配置 图3将样本浏览器中的不同群体通过拖放操作放入 表格编辑器 双击行以修改统计量、参数和名称设置。通过选择自动生成的多余行并按下键盘上的删除键，删除因拖放细胞周期建模图标而自动添加的无关行。 删除.</li>
		<li>选择 归档，格式和目标位置在 输出 菜单功能区的“部分”并单击 创建表格 将数据导出为“.xlsx”文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用表格计算软件（见材料表）并根据补充文件1（FACS_Analysis_Template_(1).xlsx）进行进一步数据分析。
	<ol>
		<li>通过应用公式 X' = X * 100 / Σ（所有细胞周期时相），对不同细胞周期时相的细胞频率进行校正，使其总和为100%，其中X'为校正值，X为原始值，对每个细胞周期时相均执行该计算。 
		注意： 由于细胞周期建模存在不准确性，导致总和偏离100%，但通常偏差较小（&#60;5%).</li>
		<li>将不同细胞周期时相中的γH2AX中位数强度根据DNA含量进行归一化处理：S期的数值除以1.5，G2期和M期的数值除以2.0。</li>
		<li>为计算整个细胞群体中联合归一化的 γH2AX 水平，使用公式 IA = IG1 * G1 + IS * S + IG2 * G2 + IM * M，其中 IA，我G1，我S，我G2，我M 分别为所有细胞、G1期、S期、G2期和M期细胞的标准化中位γH2AX强度，G1、S、G2、M为各细胞周期时相中经校正的细胞频率。</li>
		<li>对于标准化的 γH2AX 水平以及亚G1期细胞和caspase-3阳性细胞的频率，需从每个样本中减去未处理对照组的平均值。</li>
		<li>计算所有重复样本中各参数的平均值和标准差，并将结果绘制成图表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法易于使用，可快速、准确且可重复地检测DNA损伤反应，包括双链断裂（DSB）的诱导与修复、细胞周期效应以及细胞凋亡。结合这些终点指标，相较于单独检测，能够更全面地揭示它们之间的相互关系。该方法可广泛应用于辐射生物学、放射治疗与防护领域，作为一种综合性遗传毒性检测手段，更普遍适用于肿瘤学研究（例如，用于环境风险因素评估、药物筛选以及肿瘤细胞遗传不稳定性评价）。
本方案中最关键的步骤是细胞的固定。为了获得干净的样本，明确界定细胞群体，并实现不同细胞周期时相的最佳分辨效果，必须给予贴壁细胞足够的时间从培养容器上脱离，并完全变为圆形。细胞应以单细胞悬液的形式转移至固定液中，避免细胞团块的存在。在困难情况下，需通过反复吹打或多次通过细针头来分离细胞。所有样本的固定时间应保持一致，且从开始固定到在70%乙醇中重悬细胞前的离心步骤为止，总时间不应超过20分钟。过长的固定时间将导致抗体结合所需的表位减少，从而降低信号强度和方法的灵敏度。
该技术的主要局限性在于，除了整个细胞核的强度外，无法提供有关γH2AX焦点质量的其他信息。特别大的γH...

肿瘤学的目标是在不损害正常细胞的前提下杀死或灭活癌细胞。许多治疗方法会直接或间接地在癌细胞中诱导基因毒性应激，但同时在一定程度上也会影响正常细胞。化疗或靶向药物常与放射治疗联合使用，以提高照射肿瘤的放射敏感性1,2,3,4,5，从而可降低放射剂量，以尽量减少对正常组织的损伤。
电离辐射及其他基因毒性因子可诱导多种类型的DNA损伤，包括碱基修饰、链间交联以及单链或双链断裂。DNA双链断裂（DSBs）是最严重的DNA损伤类型，其产生是电离辐射及多种化疗药物在放化疗中杀伤细胞作用的关键。DSBs不仅损害基因组的完整性，还可促进突变的形成6,7。因此，在进化过程中形成了多种DSB修复通路，以及清除无法修复损伤细胞的机制（如细胞凋亡）。整个DNA损伤应答（DDR）由复杂的信号通路网络调控，该网络从识别DNA损伤并诱导细胞周期阻滞以促进DNA修复，到在修复失败时启动程序性细胞死亡或细胞失活，发挥全面的调控作用8。
本文介绍的流式细胞术方法旨在通过一项综合性检测，研究基因毒性应激后的DNA损伤应答（DDR），该检测涵盖DNA双链断裂（DSB）的诱导与修复，以及修复失败所导致的后果。该方法结合了广泛应用的DSB标志物γH2AX的检测、细胞周期分析，以及凋亡诱导的评估，后者通过经典的亚G1期分析及更特异的caspase-3活化检测来实现。
将这些检测指标整合于一个实验中，不仅减少了时间、人力和成本开支，还能实现对双链断裂（DSB）的诱导与修复以及caspase-3活化进行细胞周期特异性的测量。此类分析若采用独立实验无法实现，但对于全面理解基因毒性应激后的DNA损伤反应具有重要意义。许多抗癌药物（如细胞抑制类化合物）的作用靶点是分裂中的细胞，其疗效在很大程度上依赖于细胞周期阶段。双链断裂修复机制的可用性也受细胞周期阶段和修复通路选择的影响，而通路选择对修复的准确性至关重要，并进而决定细胞的命运9,10,11,12。此外，相较于混合分析，细胞周期特异性地检测双链断裂水平更为准确，因为双链断裂水平不仅取决于基因毒性化合物或辐射的剂量，还与细胞的DNA含量相关。
该方法已被用于比较不同放射疗法在克服胶质母细胞瘤耐药机制方面的疗效13，并解析电离辐射与靶向药物在骨肉瘤14,15和非典型畸胎样横纹肌样瘤16中的相互作用。此外，所述方法还被广泛用于分析放化疗对间充质干细胞的副作用17,18,19,20,21,22,23,24，这些细胞对于治疗所致正常组织损伤的修复至关重要，并在再生医学中具有潜在应用价值。

<table><tbody><tr><td>1,000 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100–1,000 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm × 75 mm 带细胞筛帽的试管，35 &amp;micro;m 网孔尺寸</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 试管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20–200 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>溶于水，配制成 200 &amp;micro;g/mL 溶液，分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗 H2A.X 磷酸化（Ser139）抗体，RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>按 1:20 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 兔抗活化 Caspase-3 抗体，AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>按 1:20 稀释</td></tr><tr><td>BD FACSClean 溶液</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>用于测量后流式细胞仪的清洗程序</td></tr><tr><td>BD FACSRinse 溶液</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>用于测量后流式细胞仪的清洗程序</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>溶于水，配制成 1× 浓度</td></tr><tr><td>含稳定谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>本方案中示例细胞系的常规细胞培养材料</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Excel 软件</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior（胎牛血清）</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>本方案中示例细胞系的常规细胞培养材料</td></tr><tr><td>FlowJo v10 软件</td><td>LLC</td><td>在线订购</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>用于染色样本显微载玻片可选制备的封片介质</td></tr><tr><td>折叠纤维素滤膜，3hw 级</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII 或 LSRFortessa 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>可选药物，用于凋亡阳性对照</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+ 离心机</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>新鲜配制 4.5% 溶液。在通风橱中，将多聚甲醛溶于 PBS 并加热至 80 &amp;deg;C，缓慢搅拌。用铝箔覆盖烧瓶以防止热量散失。待溶液冷却至室温后定容，并通过纤维素滤膜过滤。</td></tr><tr><td>磷酸化组蛋白 H3（Ser10）（D2C8）XP 兔单克隆抗体（Alexa Fluor&amp;reg; 555 标记），RRID: AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>按 3:200 稀释</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 移液控制器</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL（修饰型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>可选药物，用于凋亡阳性对照</td></tr><tr><td>T25 细胞培养瓶</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>本方案中使用的示例细胞系的常规细胞培养材料</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>本方案中示例细胞系的常规细胞培养材料</td></tr><tr><td>U87 MG 胶质母细胞瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>本方案中使用的示例细胞系</td></tr></tbody></table>

细胞周期特异性检测基因毒性应激后γh2ax与细胞凋亡的流式细胞术方法

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

本文所述方法或其稍作修改的版本已被设计用于研究临床肿瘤学中各种抗癌治疗的特定治疗反应及副作用。该方法能够对放射治疗和多种抗癌药物所诱导的基因毒性应激后的DNA损伤反应进行定量且纵向的分析。该方法涵盖了DNA损伤反应的各个阶段，可提供DNA双链断裂（DSBs）的诱导与修复、细胞周期阻滞以及在修复失败情况下通过凋亡导致的细胞死亡等终点指标。结合这些测量结果，可以获得有关细胞周期依赖性治疗效应的信息，从而深入研究细胞增殖与应对DNA损伤机制之间的相互作用。由于包括化疗药物和电离辐射在内的许多癌症治疗手段的效果局限于特定细胞周期阶段或在不同周期阶段中存在显著差异，因此相关性分析依赖于一种可靠且可行的方法，以细胞周期特异性的方式评估治疗对DNA的影响。单终点检测方法无法实现这一目标，而本文所述方法则具有这一重要优势。该方法不限于任何特定细胞系，已在多种肿瘤及正常组织细胞系中得到充分验证。除放射肿瘤学外，该方法还可广泛应用于肿瘤学的多个领域，作为全面的基因毒性检测手段，包括环境风险因素评估、药物筛选以及肿瘤细胞遗传不稳定性评价。

采用4 Gy的光子或碳离子辐射照射人U87或LN229胶质母细胞瘤细胞。通过本文所述的流式细胞术方法，在照射后不同时间点（最长至48小时）检测细胞周期特异性的γH2AX水平及细胞凋亡情况（图3）。在两种细胞系中，与相同物理剂量的光子辐射相比，碳离子诱导的γH2AX峰值水平更高，下降更缓慢，并在照射后24至48小时仍显著升高（图4A）。这表明，碳离子比光子诱导了更高水平的DNA双链断裂（DSBs），且这些断裂的修复效率较低。对于两种辐射类型，G1期细胞中的γH2AX水平均最高，可能是因为在细胞周期的这一阶段，DSB修复仅限于非同源末端连接途径。
与更高的双链断裂（DSB）诱导率和更慢的修复动力学一致，碳离子比光子诱导出更强且持续时间更长的G2期细胞周期阻滞（图3B），并导致更高的凋亡率（图4</st...

该方法结合了DNA双链断裂（DSBs）的定量分析、细胞周期分布和细胞凋亡检测，能够实现针对细胞周期特异性的DSB诱导与修复评估，以及修复失败所导致后果的分析。

细胞周期特异性检测基因毒性应激后γH2AX与细胞凋亡的流式细胞术方法

所提出的方法或其稍作修改的版本已被设计用于研究各种抗癌药物的特定治疗反应及副作用……

该方法可提供有关细胞周期依赖性治疗效应的信息，并允许深入研究细胞增殖与DNA损伤应对机制之间的相互作用。该方法将DNA损伤反应中的多个重要终点指标整合到一个综合性检测中，包括双链断裂识别与修复、细胞周期效应以及最终通过凋亡导致的细胞死亡。我们主要利用该技术研究临床肿瘤学中放化疗治疗的特异性治疗反应及其副作用。该检测方法在放射生物学和放射治疗学领域的相关性研究中非常有用，但也可应用于肿瘤学的其他多个领域。根据标准的细胞收集步骤收集细胞后，将细胞沉淀重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并将细胞转移至生物安全柜内的两毫升固定液中。室温孵育10分钟后，通过离心收集细胞，并弃去上清液。重要的是要将细胞作为单细胞悬液进行固定，并且所有样品的固定时间应保持一致。对于贴壁细胞，应给予足够的时间使其充分脱落，以获得形态完整的圆形细胞用于分析。然后轻轻敲击离心管以松动沉淀，将细胞重悬于 3 毫升 70% 乙醇中。染色前洗涤细胞时，通过离心沉淀细胞，并轻轻敲击管壁以松动沉淀。随后用 3 毫升洗涤液连续洗涤两次，再用 1 毫升洗涤液洗涤一次，每次均将细胞重悬。每次洗涤后弃去上清液。最后一次洗涤后，小心吸走上清液，避免扰动沉淀，将透明的沉淀重悬于100 µL感兴趣的抗体混合液中。室温孵育1小时后，通过离心收集细胞，并小心吸走上清液，避免扰动沉淀。然后，将松散的沉淀重悬于100至250微升的DNA染色液中，并通过带有35微米孔径滤网的细胞筛帽将细胞加入样品管。为通过流式细胞术分析细胞，请在细胞仪窗口中打开参数选项卡，并根据表格所示选择相应参数。接着，打开工作表窗口，并按指示创建图谱。将对照样品上样至流式细胞仪，然后按下运行按钮。在浏览器窗口中选择第一个样本管，点击该样本管名称。在检查器窗口的参数选项卡中，调整前向散射光、侧向散射光以及DAPI的检测器电压。按下待机按钮以继续在软件中完成工作表的设置。使用多边形门控工具在前向散射面积与侧向散射面积图中定义细胞群体，并使用矩形门控工具在DAPI对DAPI面积图中定义单细胞群体。按下 Ctrl+G 以显示群体层级结构，并点击默认的门控名称以重命名它们。随后，右键单击所有直方图，从上下文菜单中选择“显示群体”和“单细胞”。采集对照样本和处理样本，以优化抗体偶联荧光染料的检测器电压，确保信号覆盖完整的动态范围。测量样本时，按下流式细胞仪上的运行按钮，并使用软件中的采集仪表板来测量样本。然后在对话框中选择文件、导出和实验，以选择目录导出，将数据保存为 .FCS 文件。为分析数据，将 .FCS 文件拖放到流式细胞分析软件的样本浏览器中。使用多边形工具在前向散射与侧向散射散点图中圈定细胞群，并在分析中排除碎片。在DAPI与DAPI面积图中，使用矩形工具定义单个细胞群体，并从分析中排除任何双联细胞或细胞团块。在DAPI面积直方图中，使用二分工具区分具有正常DNA含量的单个细胞与DNA降解的凋亡细胞。选择生物学和细胞周期工具以打开细胞周期建模工具，并选择Dean-Jett Fox模型来估算处于G1期、S期和G2/M期细胞的频率。在细胞周期群体的DAPI荧光强度与DAPI面积散点图中，建立G1期、S期、G2期和M期的门控，以实现细胞周期特异性的γH2AX检测。使用平分线工具，在细胞周期群体的Alexa 555面积直方图中区分磷酸化组蛋白H3阳性与阴性细胞，并在单细胞群体的Alexa 647面积直方图中区分Caspase-3阳性与阴性细胞。按Ctrl+T打开表格编辑器，并按指示配置表格。然后在菜单栏的输出部分选择“到文件”，以设置格式和目标位置，并将数据导出到电子表格中。在相同物理剂量下，碳离子比光子辐射在胶质母细胞瘤细胞中诱导出更高的γH2AX峰值水平，且其下降更缓慢，在24至48小时内仍显著升高。对于碳离子和光子辐射，γH2AX水平在G1期细胞中均最高，这很可能是因为在此细胞周期阶段，DNA双链断裂修复仅限于非同源末端连接途径。与光子相比，碳离子诱导双链断裂的速率更高，修复动力学更慢，因而导致G2期细胞周期阻滞更强且持续时间更长，并引发更高的凋亡率。根据处理效应的强度，不同细胞周期时相的分辨可能具有挑战性。在某些细胞系中，DAPI浓度对细胞周期图谱的质量影响较大，需进行调整。流式细胞术检测后剩余的样品可用于制备载玻片，以评估γH2AX焦点的数量、大小和形态，并区分局灶性与核周γH2AX染色。利用我们的方法，我们发现间充质干细胞对电离辐射和拓扑异构酶抑制具有相对抗性，但对胶质母细胞瘤素（gliomyacin）敏感。由于PFA蒸气具有毒性，在配制固定液及进行固定步骤时，务必始终在通风橱中操作。操作 DAPI 时也请记得佩戴手套。

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细胞周期特异性测量βH2AX和细胞凋亡后热源毒性应力通过流细胞测定

利用γH2AX形成作为分子标志物来定量DNA双链断裂，已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文展示了使用免疫荧光法对细胞经辐射暴露后γH2AX焦点进行定量分析的方法。...

电离辐射后γH2AX焦点的定量分析

基于γH2AX焦点对DNA双链断裂进行定量已成为一种不可或缺的工具，尤其在辐射生物学中，可用于评估组织的放射敏感性以及辐射修饰化合物的作用效果。本文展示了在组织样本中利用免疫荧光法对γH2AX焦点进行定量的方法。...

组织样本中γH2AX焦点的定量分析

在本视频中，我们介绍了免疫荧光显微技术，用于检测定位于人单个核细胞DNA双链断裂位点的特定DNA损伤应答蛋白。这些蛋白可被特异性的一抗识别，一抗进而结合带有荧光染料标记的二抗；在显微镜观察时，二抗发出荧光，从而使得细胞核内这些蛋白呈现为清晰可辨的荧光焦点，实现可视化观察。...

用于分析DNA双链断裂的免疫荧光显微镜技术

本方案描述了利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入来追踪在特定时间点处于S期的细胞的时序动态。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。...

利用流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪而无需同步化处理

一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。...

测量慢性处理后小鼠脾细胞中的DNA损伤与修复 体内 暴露于极低剂量的β射线和γ射线

本文提供了一种通过γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的实验方案。...

γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本方案介绍了外周血淋巴细胞中γ-H2AX焦点检测的载玻片制备及自动化计数方法。为展示该检测方法及其灵敏度，分离后的淋巴ocytes接受了辐照处理...

一种用于人外周血淋巴细胞γ-H2AX焦点检测的自动化显微评分方法

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

本方案介绍了一种通过同时检测博来霉素处理的人外周血淋巴细胞间期细胞核中γH2AX和53BP1焦点，以评估DNA双链断裂形成与修复的方法。...

人外周淋巴细胞中γH2AX与53BP1的双重免疫荧光染色

本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。...

邻近连接测定法定位DNA损伤位点中的蛋白质

了解如何通过流式细胞术测量细胞周期特异性βH2AX和细胞凋亡，以评估DNA双链断裂的诱导与修复。该方法整合DNA损伤应答关键终点，适用于放射生物学和临床肿瘤学研究。

细胞周期特异性检测基因毒性应激后γH2AX与细胞凋亡的流式细胞术方法

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