转化、基因组编辑及固氮热带大麻科植物Parasponia andersonii的表型分析

Parasponia 是一种来自大麻科的热带树木，能够与根瘤菌建立固氮共生关系。对 Parasponia 与豆科植物进行比较研究，有助于揭示根瘤菌共生背后的核心遗传网络。通过本方案，可在两到三个月内获得 Parasponia andersonii 的稳定转基因突变株系。

这些植株可通过体外繁殖高效扩增。本方案为研究根瘤菌共生关系以及该热带树木生物学的其他方面提供了实验平台。实施本方案仅需具备组织培养和分子克隆的基本技能。

这使得任何实验室都可以将木蓝属安德森种作为研究模型。演示该实验流程的将是在读博士生Titis Wardhani和Yuda Roswanjaya，以及本实验室的技术员Marijke Hartog。要种植木蓝属安德森种树木，首先需进行种子萌发。

通过在茶筛内侧揉搓或在一张滤纸上压碎，从朴树属（Parasponia）浆果中取出种子。使用4%次氯酸钠溶液对种子消毒15至20分钟，然后用无菌水清洗种子六次。将种子转移至无菌的200微升PCR管中，并加入无菌水浸没种子。

根据文稿说明，在热循环仪中将试管孵育10天。10天孵育后，将种子转移至SH-0培养基平板，用两层弹性密封箔封口以防止干燥。在28 °C、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下孵育三至四周。

当幼苗长出第一组真叶后，将其移栽至装有商用盆栽土的花盆中，并用透明塑料杯覆盖以防止干燥。将花盆置于28°C、相对湿度85%的气候室或温室中，采用16小时光照、8小时黑暗的光照周期。一周后，移除塑料杯。

定期为花盆浇水，并施加肥料以促进树木生长。为准备转化，从温室种植的树木上采集5至8厘米长的幼嫩枝条，确保仅使用健康且无感染的枝条。剪除叶片，仅在每片叶柄末端保留约1平方厘米的叶组织。

用含有几滴聚山梨酯20的2%次氯酸盐漂白剂对组织进行消毒15分钟，然后用高压灭菌水冲洗八次。将农杆菌细胞重悬于25毫升浸润培养基中，使其光密度达到约5。在细胞悬浮液中将茎和叶柄组织切成1厘米长的小段。

去除叶片组织，将茎段和叶柄片段在细胞悬浮液中孵育10至30分钟。用无菌滤纸吸干组织片段，然后将其置于按照文稿说明制备的生根培养基上。将培养皿于21°C黑暗条件下孵育两天。

两天后，检查培养皿是否有真菌或细菌污染，并丢弃受污染的培养皿。将组织块转移至根据文稿说明制备的 10 毫升 SH-10 培养基中。让组织在培养基中静置至少 10 分钟，每隔两到三分钟轻轻振荡一次以进行洗涤。

根据文稿说明，配制含头孢噻肟和卡那霉素的生根培养基，并倒入培养皿中。将组织在无菌滤纸上干燥后，转移至培养皿中。于28摄氏度、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养七天。

每两天检查一次培养皿是否有真菌或细菌污染。若发生污染，将未感染的组织块转移至新的培养皿中。七天后，将组织块转移至按照文稿说明配制的增殖培养基中，在28摄氏度、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养。

每周更换一次培养板，直到转基因芽发育出来，注意只将未感染的组织块转移到新的培养板上。当假定的转基因芽长至至少一厘米长时，将其剪下，并在含有抗生素的增殖培养基中独立培养。为确保这些芽代表独立的转化子，每个外植体的每侧仅取一个芽。

将约10个芽条接种到新鲜的增殖培养基平板上，用两层弹性封口膜封闭平板，进行组织继代培养。将平板置于28摄氏度、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养，每四周重复此步骤一次。当芽条长度达到1厘米时，从基部剪下并转移至生根培养基中。

将茎段的基部插入培养基中，使其直立放置。每个培养皿中可放置约10个茎段。首先准备根瘤菌接种物。

从多根瘤菌属博尔2号（Mesorhizobium plurifarium BOR2）的单菌落接种10毫升液体YEM培养基，在28°C下培养两天。用该菌液接种较大量液体YEM培养基。菌体生长后，以3,500 × g离心10分钟收集菌体。

将细菌沉淀重悬于液体EKM培养基中，并测定其光密度。准备三升EKM培养基，足以用于约20个培养盆，然后用根瘤菌悬液接种该培养基。将培养基与1.25千克珍珠岩混合，取210克该混合物加入无菌半透明聚丙烯培养盆中。

将一至三株 Parasponia andersonii 幼苗种植于每个花盆中，并准备若干株含有对照载体的转基因幼苗花盆。称量其中若干花盆，并覆盖每个花盆底部以避免根部暴露于光照。将花盆置于温度为 28 摄氏度的控气候生长室中，在 16 小时光照、8 小时黑暗的条件下培养 4 至 6 周。

每周称量数个花盆的重量一次，以确定水分损失。若水分损失超过10毫升，需补充超纯水以弥补损失。培养结束后，从珍珠岩中清洗根部，并使用双目显微镜确定根瘤数量。

该技术已成功用于将农杆菌AGL1菌株转化至Parasponia andersonii的叶柄和茎段外植体中。首先，将组织外植体与农杆菌共培养两天。延长共培养时间会导致细菌过度定植，应予以避免。

几周后，在原始伤口表面可观察到微小的绿色愈伤组织。这些愈伤组织持续生长，并在转化开始后六至八周内发育出一个或多个可能已转化的芽。来自成熟枝条的外植体转化效率为10%至30%，而来自幼嫩且快速生长枝条的外植体转化效率可达65%至75%。

转基因芽可通过体外繁殖进行扩增，每月可产生数十个芽。这些芽可转移至生根培养基，在约两周内诱导生根，获得可用于实验的植株。在启动稳定遗传转化实验时，应选择健康的枝条作为起始材料。

Parasponia T0 转基因株系通过体外培养进行繁殖。因此，对 Parasponia 转基因株系进行充分的基因型鉴定至关重要。Parasponia 作为实验模型的建立，使得对两种亲缘关系较远的结瘤类群——Parasponia 与豆科植物——进行比较分析成为可能。

这有助于揭示根瘤菌共生背后保守的遗传网络。Parasponia 还可作为研究其他课题的宝贵模型，例如木材形成、两性花的发育，或大麻科特有次生代谢物的生物合成。