Name: 转化、基因组编辑和拟合氮的热带大麻树帕拉斯波尼亚安德森 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 了解热带树木Parasponia andersonii的稳定转化与CRISPR/Cas9基因组编辑方法。该方案利用农杆菌介导转化技术，可在两到三个月内获得稳定转基因株系，为研究根瘤菌共生固氮机制提供实验平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 Mark Youles、Sophien Kamoun 和 Sylvestre Marillonnet 通过 Addgene 数据库提供了 Golden Gate 克隆元件。此外，我们还要感谢 E. James、P. Hadobas 和 T. J. Higgens 提供 P. andersonii 种子。本研究得到了荷兰科学研究组织（NWO-VICI 资助项目 865.13.001；NWO-开放竞争资助项目 819.01.007）以及印度尼西亚共和国研究、技术和高等教育部（RISET-PRO 资助项目 8245-ID）的支持。

<ol><li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+%28EAST+JAVA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+du+Jardin+Botanique+de+Buitenzorg%22%5BJournal%5D)">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li>
<li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulmaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Flora+Malesiana-Series+1%2C+Spermatophyta%22%5BJournal%5D)">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Nitrogen+Fixation%22%5BJournal%5D)">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li>
<li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speak%2C+friend%2C+and+enter%3A+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li>
<li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li>
<li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li>
<li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Resurrected+Scenario%3A+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li>
<li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743(2018).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+%28Ulmaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li>
<li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284(2018).</li>
<li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes%E2%80%93mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li>
<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li>
<li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+root%3A+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li>
<li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li>
<li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li>
<li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765(2011).</li>
<li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li>
<li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li>
<li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+CRISPR%2FCas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li>
<li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li>
<li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li>
<li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli%5BTitle%5D)+AND+%22Field+Crops+Research%22%5BJournal%5D)">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li>
<li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+tropici%2C+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li>
<li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li>
<li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d%E2%80%99un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d%E2%80%99estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle%5BTitle%5D)+AND+%22Aspects+Physiologiques+et+Genetiques+des+Mycorhizes%22%5BJournal%5D)">Mesure du taux de mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li>
<li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity%2C+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Circular+California+Agricultural+Experiment+Station%22%5BJournal%5D)">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li>
<li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+K+%22Methods+in+Molecular+Biology%3A+Agrobacterium+Protocols%22">Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols</a>. 1, Humana Press. (2015).</li>
<li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+plant+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li>
<li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somaclonal+variation+%E2%80%94+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somaclonal variation — a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li>
<li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li>
<li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+of+Black+Cottonwood%2C+Populus+trichocarpa+%28Torr.+%26+Gray%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520(2011).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Structure+of+the+Legume%2C+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327(2014).</li>
<li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971(2015).</li>
<li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Zeijl%2C+A+%22Dissecting+Hormonal+Pathways+in+Nitrogen-Fixing+Rhizobium+Symbioses%22">Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses</a>. , Wageningen University. (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

豆科植物与亲缘关系较远的大麻科Parasponia属是目前已知唯一能够与固氮根瘤菌建立内共生关系并形成根瘤的两个植物类群。对这两个类群中物种的比较研究，对于揭示支持该共生关系的核心遗传网络具有重要意义。目前，遗传学研究主要集中于豆科植物，尤其是两个模式物种M. truncatula和L. japonicus。为了提供一个额外的实验平台，并促进与结瘤非豆科植物的比较研究，本文描述了P. andersonii中稳定的遗传转化及反向遗传学分析的详细实验方案。本方案采用T0代转基因P. andersonii植株的体外繁殖技术，可在A. tumefaciens共培养后4个月内启动表型分析。这显著快于目前已建立的豆科植物稳定转化方案33，使P. andersonii成为一个极具吸引力的研究模型。
本文所述方案包含多个关键步骤。第一步涉及种子萌发。为准备 P. andersonii 种子进行萌发，需将种子从浆果中分离。此操作可通过在滤纸或茶筛内壁轻轻揉搓浆果完成。该过程需轻柔操作，以防止种皮受损。若种皮受损，灭菌过程中次氯酸钠可能渗入种子内部，从而降低种子活力。为打破种子休眠，需对种子进行为期10天的变温处理。然而，即使经过此处理，种子萌发仍无法完全同步。通常情况下，部分种子在7天后开始出现胚根萌出，但其他种子可能需要更长时间才能萌发。
转化过程中的关键点包括起始材料的选择以及共培养步骤的持续时间。为了实现高效的转化，最好选用健康且幼嫩的茎段或叶柄作为起始材料，这些材料应来自非无菌条件下温室培养的植株。为促进幼嫩枝条的生长，建议每2-3个月对Parasponia植株进行一次修剪，并每年更新植株一次。此外，共培养步骤仅需进行2天。延长共培养时间会促进A. tumefaciens对组织外植体的过度定植，通常会降低转化效率。为防止A. tumefaciens的过度定植，还应定期更换外植体培养所用的培养基平板。若发生过度定植，可对外植体进行清洗（见第3.8节），以去除A. tumefaciens细胞。我们建议在用于清洗的SH-10溶液中加入漂白剂（终浓度：约2%次氯酸盐）。需要注意的是，该额外清洗步骤可能对严重感染的外植体无效（图2B）。如果使用CRISPR/Cas9构建体进行转化时仅获得少量疑似转化的芽，或预期特定基因的突变会对再生造成困难，则建议设置空载体对照构建体作为阳性对照。最后，必须确保所筛选的所有转基因株系均来源于独立的T-DNA插入事件。因此，我们建议从每个外植体的两侧各取一个疑似转基因芽即可。然而，我们意识到这种做法会减少可能获得的独立株系数量。如果需要获得大量株系，研究人员可在愈伤组织达到≥2 mm大小时，将其从原始外植体上分离，并进行独立培养。通过这种方法，可从单个外植体中分离出多个株系，从而提高潜在转基因株系的数量。
P. andersonii 的转基因株系在本实验方案中通过离体营养繁殖方式进行扩繁。该方法的优势在于可在相对较短的时间内获得大量转基因植株。然而，该方法也存在若干局限性。首先，通过离体繁殖维持 T0 代转基因株系需要大量人力，且可能导致非预期的遗传或表观遗传变异34,35。其次，T0 代株系仍含有 T-DNA 拷贝，包括抗生素抗性表达盒。这限制了后续重复转化的次数，因为每次重新转化均需使用不同的筛选标记。目前，我们仅测试了卡那霉素或潮霉素筛选条件下的转化（数据未显示）。此外，T0 代转基因株系中存在编码 Cas9 的序列及单导 RNA（sgRNA），这会为互补实验带来困难。尽管仍可开展互补实验，但必须对互补载体中的 sgRNA 靶位点进行突变，以避免其被基因编辑系统识别和切割。第三，使用 T0 代株系的另一缺点是 CRISPR/Cas9 诱导的突变体可能具有嵌合性。为避免对嵌合突变体进行表型分析，我们建议在离体繁殖后，至少对 3 个不同枝条重复进行基因型鉴定。尽管采用本方案获得的嵌合突变体数量较少，但仍偶有发现10。为克服使用 T0 代株系的局限性，可考虑采用有性繁殖方式扩繁 P. andersonii 突变株系。P. andersonii 为雌雄异株植物，依靠风媒传粉2。这意味着每个转基因株系需经处理以使单个个体同时产生雄花和雌花，并在后续生长过程中防止异花授粉。由于 P. andersonii 生长迅速，其在热带温室（28 °C，相对湿度约 85%）中栽培需要较大的空间。因此，尽管从技术上可行，P. andersonii 转基因株系的有性繁殖在实际操作中仍面临较大挑战。
在实验方案部分，我们描述了三种用于P. andersonii结瘤的方法。平板法和育苗袋法的优点在于根系易于观察，可用于细菌的定点接种，并可随时间追踪根瘤的形成过程。然而，平板法操作较为耗时，因此不太适用于大规模的结瘤实验。育苗袋法的一个缺点是难以避免真菌污染。育苗袋本身并非无菌，因此常可在育苗袋上半部分观察到真菌生长。但这种情况并不影响P. andersonii的生长，因此不会干扰结瘤实验的结果。此外，育苗袋法仅适用于种子萌发的幼苗。尽管进行了多次尝试，我们仍无法将在体外繁殖获得的植株成功生长于育苗袋中。
该 P. andersonii 此处描述的反向遗传学技术流程相较于现有方法具有显著改进 A. rhizogenes-为基础的根部转化方法11利用所述方法，可高效地获得稳定的转基因株系，并可通过体外繁殖进行维持。相比之下， A. rhizogenes 转化是瞬时的，仅导致转基因根的形成。由于每条转基因根均来源于独立的转化事件， A. rhizogenes&#173; 基于转化的检测存在显著的表型变异。相比之下，稳定转化株系的变异程度要低得多，尽管体外繁殖仍会带来一定程度的变异。由于变异减少，且每个稳定株系可对多个植株进行表型分析，因此稳定株系比 transient 转化方法更适用于定量检测 A. rhizogenes转化的根。此外，稳定转化不依赖于引入 根诱导位点 A. rhizogenes (rol) 影响内源激素平衡15因此，与瞬时转化方法相比，稳定转化株系更适用于对参与激素稳态的基因进行反向遗传学分析 A. rhizogenes-转化的根。一个更普遍的优势是 P. andersonii 作为研究模型的优势在于其未经历近期的全基因组复制（WGD）。豆科蝶形花亚科（Papilionoideae），包含多种模式豆类植物， M. truncatula 和 L. japonicus，以及包括模式树种在内的杨柳科（Malpighiales 目） 杨树（Populus trichocarpa） 约6500万年前经历了全基因组复制事件36,37. 这些全基因组复制事件产生的许多旁系同源基因拷贝在基因组中得以保留 M. truncatula, L. japonicus 和 P. trichocarpa37,38,39，这会产生冗余，可能会使反向遗传学分析复杂化。正如 P. andersonii 未经历近期的全基因组复制（WGD），对 P. andersonii 旁系同源基因拷贝的功能冗余可能对其影响较小。
综上所述，我们提供了一套针对P. andersonii的反向遗传学分析的详细实验方案。利用该方案，可在2-3个月内高效地获得单基因突变株系10。本方案还可通过同时靶向多个基因的sgRNA多重编辑策略，进一步拓展用于构建高阶突变体，这已在其他植物物种中得到验证40,41,42。此外，本文所述的稳定遗传转化方法不仅限于CRISPR/Cas9基因靶向，也可用于导入其他类型的载体（例如启动子-报告基因检测、异位表达或反式互补实验）。我们已将P. andersonii确立为一种可用于比较研究的模式体系，以探究其与固氮根瘤菌或丛枝菌根真菌之间的互利共生关系。然而，本文描述的实验方案同时也为研究这一热带树种的其他生物学特性提供了工具，例如木材形成、两性花的发育，以及大麻科特有次生代谢物的生物合成过程。

Parasponia andersonii 是一种属于大麻科（Cannabaceae）的热带树木，原产于巴布亚新几内亚及多个太平洋岛屿1,2,3。连同另外4种Parasponia属物种，它是目前已知唯一能够与根瘤菌建立固氮根瘤共生关系的非豆科植物谱系。这种共生关系在豆科（Fabaceae）模式植物Medicago truncatula和Lotus japonicus中已有深入研究，从而获得了关于根瘤形成与功能的分子遗传机制的详细知识4。此外，研究已证实豆科植物的根瘤共生关系建立在更为古老且广泛存在的丛枝菌根共生关系基础之上5。系统发育基因组学比较表明，豆科植物、Parasponia以及与固氮Frankia细菌共生的所谓放线根瘤植物物种的固氮根瘤共生关系具有共同的进化起源6,7,8。为了确定在豆科植物根瘤形成中起作用的基因是否属于保守的遗传基础，对非豆科物种的研究至关重要。为此，我们建议将P. andersonii作为与豆科植物并行的比较研究模型，以鉴定调控根瘤形成与功能的核心遗传网络。
P. andersonii 是一种可在火山丘坡地上发现的先锋植物。其生长速度可达每月45厘米，长度可达到10米9. P. andersonii 树木为风媒传粉，这得益于雌花和雄花的分别形成3,10我们最近测序并注释了二倍体基因组（2n = 20；560 Mb/1C）的 P. andersonii，以及另外2个草图基因组序列的组装 朴树属 物种 P. rigida 和 P. rugosa6。这揭示了约35,000个 P. andersonii 可聚类的基因模型 &#62;20,000个直系同源群及基因 M. truncatula，大豆（大豆), 拟南芥，林地草莓（野草莓), 朴树 黑杨杨树（Populus trichocarpa））和桉树（桉树 grandis)6此外，对转录组进行比较分析 M. truncatula 和 P. andersonii 鉴定了290个推定的直系同源基因，这些基因在两个物种中均表现出根瘤增强型表达模式6这为比较研究提供了极佳的资源。
为了研究 P. andersonii 根和根瘤中的基因功能，已建立了一种由Agrobacterium rhizogenes介导的根转化方案11。利用该方案，可在相对较短的时间内获得带有转基因根的嵌合植株。该方法也广泛应用于豆科植物共生关系的研究12,13,14。然而，该方法的缺点在于仅根部发生转化，且每条转基因根代表一次独立的转化事件，导致实验结果存在较大变异。此外，该转化属于瞬时转化，无法维持转基因株系。这使得基于A. rhizogenes的根转化方法不太适用于CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。另外，A. rhizogenes会将其根诱导位点（rol）基因转移至植物基因组，这些基因一旦表达，会干扰植物激素的稳态15。这使得在A. rhizogenes转化的根中研究植物激素的作用变得困难。为克服这些局限性，我们近期开发了一种基于Agrobacterium tumefaciens的P. andersonii转化及CRISPR/Cas9介导的突变方案10。
本文详细描述了针对P. andersonii建立的基于A. tumefaciens的转化方法及反向遗传学研究流程。此外，我们还提供了转基因植株后续处理的操作方案，包括用于研究共生互作的实验方法。采用本方案可在2至3个月内获得多个转基因株系。结合CRISPR/Cas9介导的诱变技术，可高效构建基因敲除突变体株系。这些突变体株系可通过体外进行无性繁殖10,16,17，从而在启动转化程序后4个月即可获得足够材料用于表型鉴定10。综上所述，这一系列方法可使任何实验室将P. andersonii作为研究模型，用于探究根瘤菌和菌根真菌的共生关系，以及该热带树木生物学的其他潜在方面。

<table><tbody><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>NAA</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td>MES</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>乙酰丁香酮</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>X1402.1000</td><td>X-Gal</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>101236</td><td>用于核酸电泳凝胶</td><td></td></tr><tr><td>-</td><td>-</td><td>袋式盒材料，挂架</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>101188</td><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408-1G</td><td>BAP</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>100156</td><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>ER1011</td><td>用于Golden Gate克隆组装的限制性内切酶</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>15561020</td><td>用于Golden Gate克隆组装</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>137101</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0111.0025</td><td>C&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Na</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>K1231</td><td>用于基因分型过程中平末端PCR扩增子的克隆</td><td></td></tr><tr><td>Agronutrition</td><td>AP2011</td><td>含有Rhizophagus irregularis DAOM 197198（1,000个孢子/mL），用于菌根定殖实验</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>102790</td><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>D1004.1000</td><td>用于植物组织培养琼脂培养基</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105101</td><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>20302.293</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803.1000</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>ER0291</td><td>用于Golden Gate克隆组装的限制性内切酶</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>100983</td><td>C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;OH</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>BDH9232-500G</td><td>EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377600-1PAK</td><td>玻璃纸膜</td><td></td></tr><tr><td>Biomatters, Ltd.</td><td>R9 或更高版本</td><td>用于体外克隆和sgRNA设计的生物信息学软件</td><td></td></tr><tr><td>Mega International</td><td>-</td><td>技术信息见 https://mega-international.com/tech-info/</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>65882</td><td>用于根瘤组织的固定</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>24385.295</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Vink</td><td>219341</td><td>袋式盒材料，底部部件</td><td></td></tr><tr><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>用作塑料包埋的模板</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>100317</td><td>HCl</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5386-1G</td><td>IBA</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103862</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;FeO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103965</td><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>I1401.0005</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>K0126.0010</td><td>&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2000</td><td>&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105886</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105934</td><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>102786</td><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002.1000</td><td>用于细菌培养琼脂培养基</td><td></td></tr><tr><td>Manutan</td><td>92007687</td><td>袋式材料</td><td></td></tr><tr><td>Paraxisdienst</td><td>130774</td><td>弹性密封箔</td><td></td></tr><tr><td>Pull Rhenen</td><td>Agra-Perlite No.3</td><td>用作结瘤实验盆栽中的生长基质</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>391-0581</td><td>用作玻璃纸膜的容器</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>F130WH</td><td>用于转基因系的基因分型</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>50337</td><td>0级终止子，3&amp;rsquo;UTR，35s（花椰菜花叶病毒）</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48017</td><td>连接子2，用于将两个1级元件组装至2级受体</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48018</td><td>连接子3，用于将三个1级元件组装至2级受体</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48001</td><td>1级受体，位置5，正向方向</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48007</td><td>1级受体，位置1，反向方向</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>50268</td><td>0级启动子（0.4 kb），35s（花椰菜花叶病毒）+ 5&amp;rsquo;UTR，&amp;Omega;（烟草花叶病毒）</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>46966</td><td>用于设计CRISPR/Cas9模块</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>46968</td><td>用于设计CRISPR/Cas9模块</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>50334</td><td>0级卡那霉素/新霉素/巴龙霉素抗性盒</td><td></td></tr><tr><td>Topzeven</td><td>-</td><td>用作洗涤孢子悬浮液的滤膜</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.17003</td><td>PEG400</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>E1674.0001</td><td>用于培养&lt;em&gt;Parasponia&lt;/em&gt;植株/幼苗的花盆</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>104871</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105033</td><td>KOH</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105153</td><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Van Leusden b.v.</td><td>-</td><td>用作菌根定殖实验的生长基质</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0225.0050</td><td>SH基本盐培养基</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0411.0250</td><td>SH维生素混合物</td><td></td></tr><tr><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-02</td><td>在稳定转化的洗涤步骤中用作非离子型表面活性剂</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>137017</td><td>NaCl</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>89230-072</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;NaO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>106521</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>106574</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>567549</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td>C&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>B69</td><td>用于Golden Gate克隆组装</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>EL0013</td><td>用于Golden Gate克隆组装</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64708806</td><td>甲基丙烯酸甲酯基树脂粉末</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64709003</td><td>HEMA（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）基树脂溶液</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>66022678</td><td>甲基丙烯酸甲酯基树脂溶液</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>1159300025</td><td>&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acros</td><td>189350250</td><td>&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>663684B</td><td>聚山梨酯20</td><td></td></tr><tr><td>Stout Perspex</td><td>-</td><td>袋式盒材料，盖子</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td>&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>108816</td><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td></tr></tbody></table>

转化、基因组编辑及固氮热带大麻科植物parasponia andersonii的表型分析

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii 是一种生长迅速的热带树木，属于大麻科（Cannabaceae）。它与另外4个物种共同构成了目前已知唯一能够与根瘤菌建立固氮根瘤共生关系的非豆科植物类群。对豆科植物与P. andersonii进行比较研究，有助于深入理解根瘤形成背后的遗传调控网络。为了促进此类比较研究，我们近期完成了P. andersonii的基因组测序，并建立了由Agrobacterium tumefaciens介导的稳定遗传转化体系以及基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术。本文详细描述了针对P. andersonii所开发的遗传转化与基因组编辑操作流程。此外，还介绍了种子萌发及共生表型鉴定的相关方法。利用本实验方案，可在2至3个月内获得稳定的转基因突变株系。通过对T0代转基因植株进行体外无性繁殖，可在A. tumefaciens共培养后4个月即启动表型分析实验。因此，该流程所需时间仅略长于目前可用于P. andersonii的瞬时根转化方法（基于Agrobacterium rhizogenes），但具备多项明显优势。综上所述，本文所述各项技术手段使得P. andersonii有望成为研究共生互作机制，乃至该热带树种其他生物学特性的理想研究模型。

Parasponia andersonii 是一种生长迅速的热带树木，属于大麻科（Cannabaceae），可与根瘤菌共生形成能够固氮的根瘤。本文中，我们描述了一种用于反向遗传学分析的详细实验方案 P. andersonii 基于 根癌农杆菌介导的稳定转化和基于CRISPR/Cas9的基因组编辑。

转化、基因组编辑及固氮热带大麻科植物Parasponia andersonii的表型分析

Parasponia andersonii 是一种生长迅速的热带树木，属于大麻科（Cannabaceae）。除该物种外，另有4个物种共同构成了目前已知唯一能够与根瘤菌建立固氮根瘤共生关系的非豆科植物类群。对豆科植物与 P. andersonii 进行比较研究，有助于深入理解根瘤形成背后的遗传调控网络。为了促进此类比较研究，我们近期完成了 P. andersonii 的基因组测序，并建立了农杆菌介导的稳定遗传转化体系以及基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑技术。本文详细描述了针对 P. andersonii 所开发的遗传转化与基因组编辑操作流程。此外，还介绍了种子萌发及共生表型鉴定的相关方法。利用本实验方案，可在2至3个月内获得稳定的转基因突变株系。通过对T0代转基因植株进行离体营养繁殖，可在农杆菌共培养后4个月启动表型分析实验。因此，本方案所需时间仅略长于目前可用于 P. andersonii 的农杆菌 rhizogenes 介导的瞬时根转化方法，但具备多项明显优势。综上所述，本文所述技术体系使得 P. andersonii 可作为一种研究模型，用于探索共生互作机制，以及该热带树种生物学的其他潜在方面。

Parasponia 是一种来自大麻科的热带树木，能够与根瘤菌建立固氮共生关系。对 Parasponia 与豆科植物进行比较研究，有助于揭示根瘤菌共生背后的核心遗传网络。通过本方案，可在两到三个月内获得 Parasponia andersonii 的稳定转基因突变株系。这些植株可通过体外繁殖高效扩增。本方案为研究根瘤菌共生关系以及该热带树木生物学的其他方面提供了实验平台。实施本方案仅需具备组织培养和分子克隆的基本技能。这使得任何实验室都可以将木蓝属安德森种作为研究模型。演示该实验流程的将是在读博士生Titis Wardhani和Yuda Roswanjaya，以及本实验室的技术员Marijke Hartog。要种植木蓝属安德森种树木，首先需进行种子萌发。通过在茶筛内侧揉搓或在一张滤纸上压碎，从朴树属（Parasponia）浆果中取出种子。使用4%次氯酸钠溶液对种子消毒15至20分钟，然后用无菌水清洗种子六次。将种子转移至无菌的200微升PCR管中，并加入无菌水浸没种子。根据文稿说明，在热循环仪中将试管孵育10天。10天孵育后，将种子转移至SH-0培养基平板，用两层弹性密封箔封口以防止干燥。在28 °C、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下孵育三至四周。当幼苗长出第一组真叶后，将其移栽至装有商用盆栽土的花盆中，并用透明塑料杯覆盖以防止干燥。将花盆置于28°C、相对湿度85%的气候室或温室中，采用16小时光照、8小时黑暗的光照周期。一周后，移除塑料杯。定期为花盆浇水，并施加肥料以促进树木生长。为准备转化，从温室种植的树木上采集5至8厘米长的幼嫩枝条，确保仅使用健康且无感染的枝条。剪除叶片，仅在每片叶柄末端保留约1平方厘米的叶组织。用含有几滴聚山梨酯20的2%次氯酸盐漂白剂对组织进行消毒15分钟，然后用高压灭菌水冲洗八次。将农杆菌细胞重悬于25毫升浸润培养基中，使其光密度达到约5。在细胞悬浮液中将茎和叶柄组织切成1厘米长的小段。去除叶片组织，将茎段和叶柄片段在细胞悬浮液中孵育10至30分钟。用无菌滤纸吸干组织片段，然后将其置于按照文稿说明制备的生根培养基上。将培养皿于21°C黑暗条件下孵育两天。两天后，检查培养皿是否有真菌或细菌污染，并丢弃受污染的培养皿。将组织块转移至根据文稿说明制备的 10 毫升 SH-10 培养基中。让组织在培养基中静置至少 10 分钟，每隔两到三分钟轻轻振荡一次以进行洗涤。根据文稿说明，配制含头孢噻肟和卡那霉素的生根培养基，并倒入培养皿中。将组织在无菌滤纸上干燥后，转移至培养皿中。于28摄氏度、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养七天。每两天检查一次培养皿是否有真菌或细菌污染。若发生污染，将未感染的组织块转移至新的培养皿中。七天后，将组织块转移至按照文稿说明配制的增殖培养基中，在28摄氏度、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养。每周更换一次培养板，直到转基因芽发育出来，注意只将未感染的组织块转移到新的培养板上。当假定的转基因芽长至至少一厘米长时，将其剪下，并在含有抗生素的增殖培养基中独立培养。为确保这些芽代表独立的转化子，每个外植体的每侧仅取一个芽。将约10个芽条接种到新鲜的增殖培养基平板上，用两层弹性封口膜封闭平板，进行组织继代培养。将平板置于28摄氏度、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养，每四周重复此步骤一次。当芽条长度达到1厘米时，从基部剪下并转移至生根培养基中。将茎段的基部插入培养基中，使其直立放置。每个培养皿中可放置约10个茎段。首先准备根瘤菌接种物。从多根瘤菌属博尔2号（Mesorhizobium plurifarium BOR2）的单菌落接种10毫升液体YEM培养基，在28°C下培养两天。用该菌液接种较大量液体YEM培养基。菌体生长后，以3,500 × g离心10分钟收集菌体。将细菌沉淀重悬于液体EKM培养基中，并测定其光密度。准备三升EKM培养基，足以用于约20个培养盆，然后用根瘤菌悬液接种该培养基。将培养基与1.25千克珍珠岩混合，取210克该混合物加入无菌半透明聚丙烯培养盆中。将一至三株 Parasponia andersonii 幼苗种植于每个花盆中，并准备若干株含有对照载体的转基因幼苗花盆。称量其中若干花盆，并覆盖每个花盆底部以避免根部暴露于光照。将花盆置于温度为 28 摄氏度的控气候生长室中，在 16 小时光照、8 小时黑暗的条件下培养 4 至 6 周。每周称量数个花盆的重量一次，以确定水分损失。若水分损失超过10毫升，需补充超纯水以弥补损失。培养结束后，从珍珠岩中清洗根部，并使用双目显微镜确定根瘤数量。该技术已成功用于将农杆菌AGL1菌株转化至Parasponia andersonii的叶柄和茎段外植体中。首先，将组织外植体与农杆菌共培养两天。延长共培养时间会导致细菌过度定植，应予以避免。几周后，在原始伤口表面可观察到微小的绿色愈伤组织。这些愈伤组织持续生长，并在转化开始后六至八周内发育出一个或多个可能已转化的芽。来自成熟枝条的外植体转化效率为10%至30%，而来自幼嫩且快速生长枝条的外植体转化效率可达65%至75%。转基因芽可通过体外繁殖进行扩增，每月可产生数十个芽。这些芽可转移至生根培养基，在约两周内诱导生根，获得可用于实验的植株。在启动稳定遗传转化实验时，应选择健康的枝条作为起始材料。Parasponia T0 转基因株系通过体外培养进行繁殖。因此，对 Parasponia 转基因株系进行充分的基因型鉴定至关重要。Parasponia 作为实验模型的建立，使得对两种亲缘关系较远的结瘤类群——Parasponia 与豆科植物——进行比较分析成为可能。这有助于揭示根瘤菌共生背后保守的遗传网络。Parasponia 还可作为研究其他课题的宝贵模型，例如木材形成、两性花的发育，或大麻科特有次生代谢物的生物合成。

transforming-genome-editing-phenotyping-nitrogen-fixing-tropical

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

转化、基因组编辑和拟合氮的热带大麻树帕拉斯波尼亚安德森

利用DNA组装技术，可在一次克隆反应中并行构建多个CRISPR载体，从而使大量CRISPR载体的构建变得简单。番茄毛状根是验证CRISPR载体和创制突变体材料的优良模型系统。...

高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

启动子表达分析对于深入理解基因调控机制以及目标基因在时空上的表达模式至关重要。本文介绍了一种用于鉴定、分离和克隆植物启动子的实验方案，并进一步描述了在菜豆毛状根中对根瘤特异性启动子的表征方法。...

植物启动子分析：菜豆根瘤特异性启动子的鉴定与表征

本方案为有兴趣开展基于全基因组芯片的比较基因组杂交（CGH）分析以研究植物中拷贝数变异的研究人员，提供了实验步骤以及有关试剂、仪器和分析工具的信息。...

一种基于芯片的比较基因组杂交平台用于高效检测快中子诱变的Medicago truncatula突变体中的拷贝数变异

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

利用农杆菌介导的花序浸润法转化，可成功创制耐受极端环境的模式植物Schrenkiella parvula的稳定转基因株系。本文提供了一种基于Arabidopsis...

植物生长及农杆菌介导的极端植物花序浸润转化 Schrenkiella parvula

由于窄叶车前草作为一种模式物种在多个研究领域具有广泛的应用，因此需要建立一套适用于窄叶车前草的遗传转化工具包Plantago lanceolata). 此处利用...

Agrobacterium tumefaciens介导的窄叶车前草遗传转化

在本研究中，一种新型 在植株中 由基因表达和基因编辑方法介导的 农杆菌...

在植株中毛竹叶片的基因表达与基因编辑

本方案描述了利用Arabidopsis主花序茎和Brassica...

拟南芥和甘蓝型油菜中的毛状根转化与再生

本文展示了在雌雄同体斯氏线虫（Steinernema...

基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

本文介绍一种相对快速且简便的方法，用于绘制哺乳动物全基因组复制时间图谱，涵盖从细胞分离到测序结果基础分析的全过程。按照本方案操作后，将获得一份代表性复制程序的基因组图谱。...

通过DNA含量测定进行哺乳动物全基因组复制时间的确定

了解热带树木Parasponia andersonii的稳定转化与CRISPR/Cas9基因组编辑方法。该方案利用农杆菌介导转化技术，可在两到三个月内获得稳定转基因株系，为研究根瘤菌共生固氮机制提供实验平台。

转化、基因组编辑及固氮热带大麻科植物Parasponia andersonii的表型分析

探索更多视频