通过全基因组互惠性分析,对糖母菌菌种间热耐性差异的遗传图谱

我们的方法是首次能够解剖物种之间基因组范围而不是物种内特征差异的遗传基础。该技术的主要优点是高通量、高分辨率、广泛适用。要开始此过程，请从零下 80 摄氏度的储存中检索 JR507 冰柜库存应变，并条纹到 YPD 阿加板上的单菌落。

在26摄氏度下孵育两天或直到菌落出现。然后在250毫升的玻璃瓶中接种100毫升的液体YPD，用JR507的单组，在28摄氏度下孵育，同时在200 RPM下摇晃24小时，或直到达到静止相。第二天，测量一夜文化的 od600 。

背部用新鲜液体 YPD 稀释一些隔夜培养，放入新的一升烧瓶中，以零点 2 的 od600 和 500 毫升的体积创建新的培养。重复此过程三次，以零点二的 od600 总共创建四个区域性，对所有新区域性使用相同的隔夜区域性。在28摄氏度下孵育所有培养物6小时，同时在200 RPM下摇晃。

在此之后，结合两个 500 毫升的区域性，创建一升文化。将剩余的两个 500 毫升培养物组合在一起，以创建第二个 1 升培养物。首先，将每升培养物分成20 50毫升的等分，每个分体在塑料锥形管中，总共40根管子。

留出20根管子。将剩余的20个管子在1000次G下离心3分钟，以对酵母细胞进行颗粒。丢弃上流水，通过涡流将每个颗粒与25毫升的无菌水重新暂停。

在 1000 次 G 下离心三分钟。丢弃上流水，通过涡流将每粒颗粒与五毫升 1X Tris-EDTA 零点一摩尔醋酸锂缓冲液重新暂停。在 1000 次 G 下离心三分钟。

丢弃上流剂，再用五毫升 1X Tris-EDTA 零点一摩尔醋酸锂酯缓冲液通过涡旋重新暂停每个颗粒。在 1000 次 G 下离心三分钟。当细胞离心时，准备至少120毫升含有聚乙二醇、醋酸锂和三叶草-EDTA缓冲液的溶液。

将此溶液存放在冰上。为了准备血浆DNA的转化，首先在100摄氏度下煮沸四毫升鲑鱼精子DNA5分钟。在此之后，立即在冰上冷却五分钟。

将 20 毫升 pJR487 混合，浓度为每毫升 538 毫微克，与 4 毫升冷鲑鱼精子 DNA 混合。将这种混合物放在冰上，直到准备好使用。接下来，在每个细胞颗粒上加入600微升的血浆和精子DNA混合物。

在每个颗粒中加入三毫升PEG醋酸锂TE混合物。我们通过上下移液，然后涡流暂停。在室温下孵育管子10分钟。

然后在39摄氏度的水浴中加热每个管，26分钟，确保每管每隔几分钟倒一次。将管子以1000倍G离心三分钟。丢弃上流剂，通过涡旋将每个颗粒在 10 毫升 YPD 中重新暂停。

在此之后，将所有 20 根管子组合成一个新的玻璃瓶。将433点四毫升液体YPD加入新的一升玻璃瓶中。然后将66点6毫升的细胞转移到烧瓶中。

重复此传输过程两次，以使用转换单元格的整个体积。然后测量每个新的 500 毫升培养的 od600。在28摄氏度下孵育所有三种培养物两小时，同时在200 RPM下摇晃。

在此之后，将每微升G418的零点5毫升300毫克添加到每个烧瓶中，最终浓度为每毫升300微克。将烧瓶以 28 摄氏度和 200 RPM 的速度将烧瓶返回振动孵化器。使用剩余的 20 个锥形管重复整个过程。

此时，应该有六个一升的烧瓶，每个含有500毫升的细胞，并添加了G418。在28摄氏度下孵育所有6个烧瓶，以200 RPM的速度摇晃约两天，或直到每个烧瓶中达到约2点3的od600。然后，将所有六个烧瓶组合在一起，创建单一区域性。

使用此组合培养剂，将两个新的一升烧瓶接种 500 毫升 YPD 和 G418 的，接种零点二的 od600。在28摄氏度下孵育这些新培养，在200 RPM下摇晃，直到达到约2点2的od600。在此之后，将两种区域性合并为一种区域性，并测量组合区域性的 od600。

以1000倍G离心25毫升，三分钟。计算文本协议中概述的 25 毫升中的总 od600 单位的细胞数。丢弃上一提液，将细胞重新悬浮在足够的水中，以每毫升一点八五的 od600 产生细胞悬浮液。

使用玻璃珠，将一毫升重新暂停的细胞盘到 12 个带 5-FOA 的大型方形合成阿加板中。在28摄氏度下孵育每个盘子一至两天，或直到盘子上形成草坪。接下来，使用小无菌的尖叫声将细胞从盘子的一半刮掉，放入含有35毫升无菌水的管子中。

对其余六个板重复此过程，导致水中有两管细胞。将悬浮液组合成一个烧瓶，测量悬浮液的 od600，用水作为空白。用水调节细胞浓度，直到 od600 达到每毫升 44 点。

接下来，准备细胞的冰柜储存，并储存在零下80摄氏度，如文本协议中所述。在这项研究中，S.Cerevisiae和S.Paradoxus交配形成一种无菌杂交体，在突变时被转置。每个突变的克隆都是一个下卵体，一种二倍体杂交，其中一个基因的一个等位基因被破坏。

在高温下，细胞体被竞争，DNA从每种培养中分离。DNA被修复并连接到适配器，转子与基因组之间的交汇点被放大，使用转子特异性底转和适配器特异性底转。计算从安培孔读取计数的批量测序计数，报告克隆在种群中的适合性。

随着这种测序的结果，给定基因的中分细胞丰度可以在两类下部子之间的两个温度下进行比较。只有 S.Cerevisiae 等位基因的克隆是野生类型和功能性的，克隆仅依赖于 S.Paradoxus 等位基因。在这个具有代表性的实施中，在八个内务基因上检测到强信号。

在每种情况下，在混合的S.Cerevisiae等位基因中插入转子，会损害高温下的生长。这些低 si 代表热耐莉特性的候选决定因素， 将 S. Cerevisiae 与 S. Paradoxus 区别。现在，我们已经完成了这个实验，我们可以解剖这些物种之间的其他特征，如冷或盐耐受性。