Name: Lentiviral CRISPR/Cas9介导基因组编辑，用于疾病模型中造血细胞的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习使用慢病毒CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞进行高效基因组编辑的方法。该技术可快速建立造血细胞特异性基因修饰的疾病模型，为血液学研究提供经济高效的实验工具。

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S. S. 获美国心脏协会博士后奖学金 17POST33670076 资助。K. W. 获美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01 HL138014、R01 HL141256 和 R01 HL139819 资助。

所有涉及动物实验的操作均已获得弗吉尼亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 慢病毒颗粒的产生与纯化
注意：含有优化向导RNA的慢病毒颗粒可通过Addgene提供的详细方案制备：&#60;https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf&#62;。高滴度慢病毒的制备与保存的优化方法在其他文献中有讨论17,18。简言之，通过将慢病毒载体质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK 293T细胞来产生慢病毒。转染后48小时收集培养上清液，并通过超速离心浓缩。慢病毒滴度由市售的基于qPCR的检测试剂盒测定。该操作应在生物安全二级柜中进行。
<ol>
	<li>在1×PBS中配制胶原蛋白（0.0005%）的1:200溶液。</li>
	<li>用胶原蛋白溶液包被6孔板，并在37 °C、5% CO2条件下孵育约30分钟。</li>
	<li>以每孔1 × 106个细胞的密度接种293T细胞，并在37 °C、5% CO2条件下孵育约2小时。</li>
	<li>为制备单孔转染用的三种质粒混合物，将0.9 µg慢病毒载体、0.6 µg psPAX2和0.3 µg pMD2.G混合，再加入去离子水至总体积为10 µL。根据孔数相应调整各成分用量。每种质粒的用量和比例可能需要进一步优化以满足研究人员的具体需求。</li>
	<li>向质粒混合物中小心加入50 µL 1×PBS和5 µL稀释后的PEI MAX（1.0 mg/mL）&#160;，室温（RT）孵育15分钟（表1）。</li>
	<li>向上述混合物中加入1 mL DMEM。</li>
	<li>吸除6孔板中的培养基，加入1 mL质粒混合物，并在37 °C、5% CO2条件下孵育约3小时。</li>
	<li>更换为2 mL新鲜DMEM，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。</li>
	<li>再加入1 mL新鲜DMEM，并在37 °C、5% CO2条件下额外孵育24小时（总孵育时间为48小时）。</li>
	<li>将培养上清液转移至50 mL离心管中，在4 °C下以3,000 × g离心15分钟，以去除悬浮细胞。</li>
	<li>使用0.45 µm滤膜过滤上清液。</li>
	<li>将滤液转移至聚丙烯离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以rmax转子72,100 × g超速离心3小时。</li>
	<li>小心吸除上清液，保留白色沉淀。</li>
	<li>用100 µL无血清造血细胞扩增培养基重悬沉淀，避免通气。</li>
	<li>保留10 µL分装样品用于测定病毒滴度，其余样品分装后储存于-80 °C备用。</li>
	<li>使用10 µL病毒分装样品，按照制造商说明书采用基于qPCR的方法测定病毒滴度。</li>
</ol>
2. 小鼠骨髓中谱系阴性细胞的分离与转导（图1A）
注意：通常为了分离出足够数量的细胞，需从每只小鼠采集一对胫骨、股骨和肱骨。骨盆和脊柱骨骼也可作为分离阴性谱系细胞的来源。
<ol>
	<li>骨髓细胞的分离
	<ol>
		<li>使用5%异氟烷麻醉8-10周龄雄性CRISPR/Cas9基因敲入小鼠，随后实施颈椎脱位处死，然后用70%乙醇对皮肤进行消毒。</li>
		<li>使用解剖剪在肋骨下方的皮肤处做横向切口，并向两端剥离皮肤，以暴露四肢。</li>
		<li>通过脱位髋关节将下肢与髋骨小心分离。沿股骨头切断，将股骨完全从髋部移除。脱位膝关节并在关节处切断，以分离股骨和胫骨，同时保持骨骺完整。脱位踝关节并去除足部及多余肌肉。</li>
		<li>使用解剖剪剪开肩部以分离上肢。脱位肩关节，然后在肘关节处切断以获取肱骨。</li>
		<li>使用纤维素擦拭纸小心去除股骨、胫骨和肱骨上的肌肉组织。在此过程中需格外注意，确保骨骼不被折断。</li>
		<li>将分离出的骨骼放入含有RPMI培养基的50 mL锥形管中，并置于冰上。 
		注意：以下步骤应在生物安全二级柜中进行。</li>
		<li>将骨骼转移至无菌的100 mm培养皿中。</li>
		<li>用钝头镊夹住骨骼，使用解剖剪小心剪除两端骨骺。 
		注意：剪切不足会导致骨髓冲洗不完全，而过度剪切则会造成细胞损失。</li>
		<li>用冰预冷的RPMI填充一支10 mL注射器，使用22 G针头将骨髓从骨髓腔冲洗至新的100 mm培养皿中。 
		注意：若骨髓腔已被充分冲洗，骨骼将变为白色且半透明；若未达到此状态，应重新剪切骨端并再次冲洗。</li>
		<li>收集全部骨髓后，用18 G针头的10 mL注射器反复吹打数次，制成单细胞悬液。重复操作10次以确保形成单细胞悬液。</li>
		<li>将细胞悬液通过70 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中。</li>
		<li>在4 °C条件下以310 × g离心10分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于适量的优化分离缓冲液中，用于后续细胞分离步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lin阴性细胞的分离及慢病毒转导 
	&#8203;注意：小鼠Lin阴性细胞可通过谱系耗竭试剂盒，从小鼠Cas9转基因品系3或其他品系的骨髓中分离获得，具体操作按照制造商说明书进行。通常，Lin阴性细胞约占全部骨髓有核细胞的2%-5%，分离后纯度一般高于90%。分离得到的Lin阴性细胞在无血清造血细胞扩增培养基中培养，添加20 ng/mL重组小鼠TPO和50 ng/mL重组小鼠SCF，并以感染复数（MOI）= 100的慢病毒载体转导16小时。
	<ol>
		<li>按照制造商说明书，使用谱系细胞耗竭试剂盒分离Lin阴性细胞。</li>
		<li>分离后，将Lin阴性细胞重悬于1 mL无血清造血细胞扩增培养基中。</li>
		<li>以1.5 × 106 细胞/mL的密度（每只小鼠5 × 105 Lin阴性细胞）将细胞接种至6孔板中。</li>
		<li>向各孔中加入重组小鼠TPO和SCF，使其终浓度分别为20 ng/mL和50 ng/mL。</li>
		<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下预培养约2小时。</li>
		<li>向各孔中加入MOI = 100的慢病毒、4 µg/mL聚凝胺（polybrene）以及青霉素/链霉素，于37 °C、5% CO2条件下孵育16-20小时（图1B）。</li>
		<li>次日，将慢病毒转导后的细胞收集至15 mL锥形管中，在300 g条件下离心10分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液，按每只小鼠200 µL RPMI重悬细胞沉淀。将细胞置于室温，待移植入小鼠时使用（第3部分）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将转导细胞移植到致死剂量照射的小鼠体内
<ol>
	<li>在骨髓移植当天，将受体小鼠放入八等分的派状笼中，进行两次全身照射（每次550 Rad，总剂量为1100 Rad），每次照射间隔约4小时。</li>
	<li>第二次照射后，使用胰岛素注射器通过眶后静脉丛向每只麻醉的受体小鼠注射转导的谱系阴性细胞（总量200 µL）（图1C）。</li>
	<li>照射后，小鼠应饲养于无菌笼中，并提供软质饲料和添加抗生素的饮用水，持续14天。</li>
	<li>骨髓移植后3至4周，分析外周血以检测转导供体细胞的植入情况（第4节）。</li>
</ol>
4. 评估外周血嵌合体状态
<ol>
	<li>用5%异氟烷麻醉小鼠，使用毛细管从眶后静脉采集血样，并收集至K2EDTA管中（一根毛细管中的血量足以进行以下检测）。</li>
	<li>将20 µL血液从K2EDTA管转移至5 mL圆底聚苯乙烯试管中，并置于冰上。</li>
	<li>加入1.5 mL红细胞裂解缓冲液以裂解红细胞，冰上孵育5分钟。</li>
	<li>为中和裂解缓冲液，用FACS缓冲液洗涤样品（每份1.5 mL）。</li>
	<li>在4 °C下，以609 × g（rmax）离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞与单克隆抗体混合物（用100 µL FACS缓冲液/样品稀释）在室温避光孵育20分钟。完整的抗体列表见上方材料部分。</li>
	<li>用FACS缓冲液洗涤细胞一次（每份2 mL）。在4 °C下，以609 × g（rmax，1,800 rpm）离心5分钟，彻底弃去上清液。</li>
	<li>用含多聚甲醛的固定缓冲液（每管100 µL）在4 °C下固定细胞10分钟。</li>
	<li>用FACS缓冲液洗涤细胞一次（每份3 mL）。在4 °C下，以609 × g（rmax，1,800 rpm）离心5分钟，彻底弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于400 µL FACS缓冲液中。</li>
	<li>将样品保存在4 °C，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>

<ol><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li>
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<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与传统的转基因小鼠方法相比，该方案的优势在于能够快速且高度经济地构建在造血细胞中携带特定突变的动物模型。研究发现，该方法可在1个月内实现对小鼠造血细胞基因的操控。本方案中有多个关键步骤需要进一步考虑。
gRNA序列的筛选
建议在进行体内实验之前，先在体外测试gRNA以评估其编辑效率。gRNA的效率通过无细胞的体外转录和筛选系统进行检测。通过在重组Cas9蛋白存在的情况下，利用琼脂糖凝胶电泳检测转录出的gRNA对模板DNA的切割效率，从而验证其活性。目前已有 commercially available kits 可用于此目的。
此处，通过TA克隆法对从编辑区域扩增的PCR产物进行克隆，将这些质粒转化至细菌细胞，并挑取单个菌落进行Sanger测序，以鉴定插入缺失（indel）突变。然而，该方法费时且劳动强度大。 alternatively，可采用下一代测序（NGS）或混合DNA测序结合TIDE分析19</...

血液学和免疫学领域的许多研究依赖于基因修饰小鼠，包括利用造血系统特异性 Cre 驱动因子（如 Mx1-Cre、Vav-Cre 等）的常规和条件性转基因/基因敲除小鼠1,2,3,4,5。这些策略需要建立新的小鼠品系，耗时较长且经济负担较重。尽管基因组编辑技术的革命性进展使得在具备适当技术能力的情况下，可在短短 3 至 4 个月内生成新的小鼠品系6,7,8,9，但在开展实验之前仍需花费更长时间扩增小鼠种群。此外，这些操作成本高昂。例如，杰克逊实验室（Jackson Laboratory）列出的每品系基因敲除小鼠制备服务当前价格为 16,845 美元（截至 2018 年 12 月）。因此，相较于传统的转基因小鼠方法，更具经济性和效率的方法更具优势。
成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术推动了基于RNA的快速高效、序列特异性基因组编辑新工具的发展。该系统最初被发现是细菌的一种适应性免疫机制，用于破坏入侵病原体的DNA，现已被开发为一种工具，用于提高真核细胞和动物模型中基因组编辑的效率。目前已采用多种方法将CRISPR/Cas9系统递送至造血干细胞中（例如电穿孔、核转染、脂质体转染、病毒递送等）。
此处采用慢病毒系统转导细胞，原因是该系统能够高效感染表达 Cas9 的小鼠造血干细胞，并可将向导 RNA 表达载体、启动子、调控序列以及编码荧光报告蛋白（如 GFP、RFP）的基因共同包装。利用该方法，已实现小鼠造血干细胞的体外基因编辑，并成功在致死剂量照射的小鼠中重建骨髓功能10。本研究所用的慢病毒载体通过共同的核心 EF1a 启动子表达 Cas9 和 GFP 报告基因，报告基因上游含有内部核糖体进入位点。向导 RNA 序列则由独立的 U6 启动子驱动表达。该系统随后被用于在候选的克隆性造血驱动基因 Tet2 和 Dnmt3a 上诱导插入和缺失突变10。然而，由于载体插入片段较大（13 Kbp），限制了转导效率，并在病毒生产过程中降低了病毒滴度，因此该方法的转导效率相对较低（约 5%–10%）。
在其他研究中已表明，较大的病毒RNA尺寸会对病毒产量和转导效率均产生负面影响。例如，插入片段每增加1 kb，病毒产量据报道会下降约50%，而在小鼠造血干细胞中，转导效率将降低超过50%11。因此，尽可能减小病毒插入片段的大小有利于提高该系统的效率。
这一缺陷可通过使用Cas9转基因小鼠来克服，这类小鼠以组成型或诱导型方式表达Cas9蛋白12。组成型CRISPR/Cas9基因敲入小鼠在Rosa26位点通过CAG启动子普遍性地表达Cas9核酸酶和EGFP。因此，可利用慢病毒载体递送一种构建体，该构建体包含在U6启动子控制下的sgRNA以及在核心EF1a启动子控制下的RFP报告基因，从而实现基因组编辑。利用该系统，已成功编辑了造血干细胞的基因，转导效率约为90%。因此，本方案提供了一种快速且有效的方法，用于构建在造血系统中引入靶向基因突变的小鼠模型。尽管本实验室主要利用此类技术研究克隆性造血在心血管疾病过程中的作用13,14,15，该方法同样适用于血液系统恶性肿瘤的研究16。此外，本方案还可拓展用于分析HSPC中DNA突变如何影响造血系统中其他疾病或发育过程。
为建立一个稳定的慢病毒载体系统，需要高滴度的病毒储备液以及优化的造血细胞转导和移植条件。本方案提供了第1节中高滴度病毒储备液的制备方法，第2节中优化小鼠造血干细胞培养条件的操作步骤，第3节中骨髓移植的方法，以及移植后嵌合情况评估的&#160;第4节

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 培养基 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>培养基</td></tr><tr><td>磺胺甲噁唑和甲氧苄啶注射液</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc LO-DOSE 胰岛素注射器</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216--</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>APC-抗小鼠 Ly6C 抗体（克隆 AL-21）</td><td>BD Biosciences</td><td>560599</td><td>抗体</td></tr><tr><td>APC-Cy7-抗小鼠 CD45R 抗体（克隆 RA3-6B2）</td><td>BD Biosciences</td><td>552094</td><td>抗体</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok 一次性注射器，10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>BD Microtainer 血液采集管，含 K2EDTA</td><td>BD Bioscience</td><td>365974</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 针头，18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 针头，22 G&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>305155</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>BV510-抗小鼠 CD8a 抗体（克隆 53-6.7）</td><td>Biolegend</td><td>100752</td><td>抗体</td></tr><tr><td>BV711-抗小鼠 CD3e 抗体（克隆 145-2C11）</td><td>Biolegend</td><td>100349</td><td>抗体</td></tr><tr><td>牛皮胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9007-34-5</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>Corning Costar 超低吸附多孔板，6 孔&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3471</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 基因敲入小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>028555</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>70-01-5022</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 (DMEM) - 高糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>培养基</td></tr><tr><td>eBioscience 1X 红细胞裂解缓冲液</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td>溶液</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm 细胞培养皿，经 TC 处理</td><td>Life Sciences</td><td>353003</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管</td><td>Life Sciences</td><td>352054</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>Falcon 6 孔透明平底多孔细胞培养板，经 TC 处理&amp;nbsp;</td><td>Life Science</td><td>353046</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>Fisherbrand 微量压积毛细管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>Fisherbrand 无菌细胞筛，70 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>荧光素异硫氰酸酯-抗小鼠 CD4 抗体（克隆 RM4-5）</td><td>Invitrogen</td><td>11-0042-85</td><td>抗体</td></tr><tr><td>固定缓冲液</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>溶液</td></tr><tr><td>Guide-it Compete sgRNA 筛选系统</td><td>Clontech</td><td>632636</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>Isothesia（异氟烷）溶液</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>溶液</td></tr><tr><td>Lenti-X qRT-PCR 滴定试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Takara</td><td>631235</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>Lineage 细胞耗竭试剂盒，小鼠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>Millex-HV 注射式滤器，0.45 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHV004SL</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>溶液</td></tr><tr><td>PE-Cy7-抗小鼠 CD115 抗体（克隆 AFS98）</td><td>eBioscience</td><td>25-1152-82</td><td>抗体</td></tr><tr><td>PEI MAX</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td>溶液</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素混合液</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>溶液</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-抗小鼠 Ly6G 抗体（克隆 1A8）</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td>抗体</td></tr><tr><td>pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>57823</td><td>质粒</td></tr><tr><td>pMG2D</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>质粒</td></tr><tr><td>Polybrene 感染/转染试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td>溶液</td></tr><tr><td>聚丙烯离心管</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>326823</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>psPAX2&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>质粒</td></tr><tr><td>RadDisk &amp;ndash; 啮齿动物辐照器圆盘</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>通用耗材</td></tr><tr><td>重组小鼠 SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>溶液</td></tr><tr><td>重组小鼠 TPO&amp;nbsp;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>315-14</td><td>溶液</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>09600</td><td>溶液</td></tr><tr><td>TOPO TA 克隆试剂盒（含 One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌）用于测序</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>K457501</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>溶液&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

慢病毒crispr/cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

使用传统的转基因方法在造血干细胞中操控基因可能耗时较长、成本高昂且具有挑战性。得益于基因组编辑技术以及慢病毒介导的转基因递送系统的进步，本文介绍了一种高效且经济的方法，用于建立基因在造血干细胞中特异性被操控的小鼠模型。该方法利用慢病毒将表达Cas9的谱系阴性骨髓细胞转导，同时导入靶向特定基因的向导RNA（gRNA）以及一个红色荧光报告基因（RFP），随后将这些细胞移植到经致死剂量照射的C57BL/6小鼠体内。以表达非靶向gRNA的慢病毒进行移植的小鼠作为对照组。通过流式细胞术检测外周血中RFP阳性白细胞，评估转导后造血干细胞的植入情况。采用此方法，移植后4周可实现约90%的髓系细胞转导率和约70%的淋巴系细胞转导率。从RFP阳性的血细胞中提取基因组DNA，通过PCR扩增靶位点DNA片段，以验证基因组编辑效果。该方案可高通量地评估调控造血的基因，并可拓展应用于多种涉及造血细胞的小鼠疾病模型。

采用上述方案，每只小鼠可获得约 0.8-1.0 × 108 个骨髓细胞。每只小鼠获得的谱系阴性细胞数量约为 3 × 106 个。通常，骨髓谱系阴性细胞的得率为总骨髓有核细胞的 4%–5%。
通过对外周血进行流式细胞术分析，评估转导细胞（RFP阳性）的嵌合率（图2A、B）。血液自眶后静脉采集，并使用适当的标记物鉴定各造血细胞亚群的身份（如中性粒细胞、单核细胞、T细胞等）（图3A、B）。可从RFP阳性血细胞中提取基因组DNA，通过PCR扩增靶位点DNA片段，并将产物亚克隆至TA克隆载体中用于测序分析。将这些质粒转导至E. coli中，通过Sanger测序确定靶位点序列（...

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

利用传统转基因方法在造血干细胞中操控基因可能耗时较长、成本高昂且具有挑战性。得益于……

我们开发了一种高效且经济的方法，利用基因组编辑技术和慢病毒介导的转基因递送系统，特异性地在造血干细胞中实现基因操作的小鼠模型。本方案的优势在于，与传统的转基因小鼠方法相比，我们能够快速且低成本地构建携带造血细胞特异性突变的动物模型。演示该实验流程的是我实验室的研究人员 Ying Wang。为了产生慢病毒颗粒，首先用胶原溶液对六孔板进行包被，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。然后将293T细胞接种到该培养板上，再孵育2小时。同时，通过混合0.9微克慢病毒载体、0.6微克psPAX2和0.3微克pMD2，制备三种转染质粒的混合物。将G和去离子水加入至每孔10微升。然后，小心向质粒混合物中加入50微升1×PBS和5微升稀释的PEI MAX，在室温下孵育15分钟。孵育结束后，加入1毫升DMEM。吸去六孔板中的培养基，每孔加入一毫升质粒混合物。将培养板继续孵育三小时。更换为新鲜的DMEM培养基，并孵育24小时。加入1毫升新鲜DMEM，继续培养24小时。经过总共48小时的培养后，将上清液转移至50毫升离心管中，在3000 ×g条件下离心15分钟，以去除任何悬浮的细胞。将上清液通过0.45微米滤膜过滤，然后进行超速离心3小时。 小心吸除上清液，保留白色沉淀。用 100 µL 无血清造血细胞扩增培养基重悬沉淀，避免通气。取 10 µL 分装样品用于测定病毒滴度，其余悬液于 -80 °C 保存，待使用时取出。分离骨骼后，将其放入含有RPMI的50毫升锥形管中，并将管子置于冰上。在生物安全柜中，将骨骼转移至无菌的100毫米培养皿中。然后用钝头镊子夹住一根骨骼，使用解剖剪仔细剪除两端的骨骺。用10毫升注射器吸取冰冻的RPMI培养基，使用22号针头将骨髓从骨干中冲洗至新的100毫米培养皿中。待所有骨髓收集完毕后，用18号针头将骨髓反复通过10毫升注射器，制成单细胞悬液。随后将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。然后根据文稿中的指示离心管子，并吸除上清液。用适量体积的优化分离缓冲液重悬细胞沉淀。为分离谱系阴性细胞，请按照生产商说明书使用谱系细胞耗竭试剂盒。将分离得到的谱系阴性细胞重悬于无血清造血细胞扩增培养基中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下预孵育2小时。随后根据文章说明加入慢病毒，并将细胞继续在培养箱中孵育16至20小时。第二天，将慢病毒转导的细胞收集到一个15毫升的锥形管中，并在300 × g下离心10分钟。根据NHA指南，操作慢病毒载体时必须遵循Reece Group二级标准。必须根据设施规定采取相应的预防措施。小心吸除上清液，并将沉淀物重新悬浮于每只小鼠 200 微升 RPMI 培养基中。将细胞置于室温下，直至移植入小鼠体内。第二次照射后，使用胰岛素注射器经眶后途径将转导的去谱系阴性细胞注射到每只麻醉小鼠体内。骨髓移植后三至四周，使用毛细管从眶后静脉采集血样。取20微升血液加入圆底聚苯乙烯试管中，并置于冰上。红细胞裂解后，在室温下避光孵育细胞与单克隆抗体混合液20分钟。孵育后，洗涤、固定细胞并离心，将细胞沉淀重悬于400 µL FACS缓冲液中。将样品置于4 °C保存，直至进行流式细胞术分析。可通过流式细胞术检测RFP来评估谱系阴性细胞的转导效果。已有研究表明，在体外培养七天后，平均有75.7%的细胞被转导。流式细胞术还被用于分析经转导和未转导的造血干细胞重建后的小鼠外周血。结果显示，平均94.8%的中性粒细胞、93.5%的单核细胞和82.7%的B细胞表达RFP。已对RFP阳性血细胞的基因组DNA进行PCR扩增，并亚克隆用于序列分析。检测到多种突变，其中69%的克隆显示出移码或提前终止突变。要成功完成此操作，需要制备高滴度的病毒原液，并优化造血细胞的转导及移植条件。我们已应用该技术研究心血管疾病中的规律，但它同样适用于血液系统恶性肿瘤的研究。该方法能够以高效且高通量的方式，研究新基因类型在造血系统中的功能。我们收集有关转基因小鼠可获得性的信息。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

Lentiviral CRISPR/Cas9介导基因组编辑，用于疾病模型中造血细胞的研究

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。...

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利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

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本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

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为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。...

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

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CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。...

通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

学习使用慢病毒CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞进行高效基因组编辑的方法。该技术可快速建立造血细胞特异性基因修饰的疾病模型，为血液学研究提供经济高效的实验工具。

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

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