Name: 使用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学习使用两步PCR和16S rRNA测序技术进行微生物群分析的方法。本方案涵盖粪便样本DNA提取、文库制备及生物信息学分析流程，适用于人类和动物样本，为研究人员建立标准化微生物组分析流程提供详细指导。

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作者感谢美国国家过敏与传染病研究所/国立卫生研究院（NIAID/NIH，项目编号：1R01AI137075-01）、卡弗医疗研究倡议基金（Carver Trust Medical Research Initiative Grant）以及爱荷华大学环境健康科学研究中心、美国国家环境健康科学研究所/国立卫生研究院（NIEHS/NIH，项目编号：P30 ES005605）提供的经费支持。

该实验方案已获爱荷华大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 粪便样本的采集与处理
<ol>
	<li>用70%乙醇对分隔盒（见材料表、补充图1）进行灭菌。</li>
	<li>预先标记微型离心管（每只小鼠一支），注明样本编号和处理组别（如适用）。</li>
	<li>将小鼠放入已灭菌的分隔盒中，使其正常排便，时间最长可达1小时。</li>
	<li>使用无菌镊子将粪便颗粒收集至一个空的、预先标记的1.5 mL微型离心管中，并拧紧管盖。每次从小鼠收集后，均需对镊子进行灭菌。</li>
	<li>将含有粪便颗粒的微型离心管置于-80 °C冰箱中保存，直至进一步处理。 
	注意：分隔盒的优势在于可同时从多只小鼠（最多12只）一次性收集粪便样本。</li>
</ol>
2. DNA 提取
<ol>
	<li>从冰箱中取出粪便样本（小鼠或人类），在室温（RT）下解冻。 
	注意：建议根据需要将人粪便样本在 4 °C 下过夜解冻，以便从储备样本中收集 200 mg 或所需量的样本。</li>
	<li>使用 200 mg 起始材料，并将 DNA 洗脱至终体积为 50 µL。</li>
	<li>设置一个 DNA 提取试剂盒空白对照，该对照中不加入粪便样本，但仍进行所有 DNA 提取步骤。 
	注意：使用了特定的 DNA 提取试剂盒（见材料表），因其含有特定试剂，可去除存在于人和小鼠粪便样本中的抑制性物质，如生物固体、未消化的植物成分以及溶血红细胞释放的血红素化合物。</li>
	<li>将珠管放入均质仪中（见材料表），在室温下以 4.5 m/s 的速度均质 45 秒。 
	注意：可使用任何厂家的珠击式均质仪。然而，若使用其他供应商的珠击式均质仪，建议对方法进行标准化，特别是均质的速度和持续时间。</li>
	<li>使用细菌 DNA 提取试剂盒，按照制造商的说明书（见材料表）对单个小鼠粪便样本进行 DNA 提取，仅作轻微修改。通过在荧光计或高灵敏度电泳芯片（见材料表）上加载 1 μL DNA 样品来定量提取的 DNA。 
	注意：当起始粪便样本量为 200 mg 时，预期 DNA 产量范围为 500–2,500 ng。</li>
	<li>使用洗脱缓冲液将 DNA 浓度调整至 4–20 ng/μL。如果 16S rRNA 基因扩增（PCR1）不在同一天进行，则在进行 PCR1 之前重新定量 DNA（操作同步骤 2.5）。</li>
</ol>
3. 16S rRNA 基因扩增（PCR1）
<ol>
	<li>使用25 μL反应体系，在96孔PCR板中进行16S rRNA基因扩增（PCR1）。</li>
	<li>使用多通道移液器，向每个反应孔中加入12.5 μL含缓冲液及dNTPs的2×高保真聚合酶酶混合液（参见材料表），再加入总量不超过10.5 μL的40 ng DNA（用PCR级水调节总体积），以及各1 μL浓度为1 μM的正向和反向引物。 
	注意：引物序列如下： 
	正向引物 = 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'；反向引物 = 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'。在PCR板中加入步骤2.3中的试剂盒空白对照（试剂对照）。</li>
	<li>密封PCR板后，在台式板式离心机中以1,000 ×g、20 °C离心1分钟（参见材料表），然后在热循环仪中按以下程序进行PCR扩增：95 °C预变性3分钟；25个循环（95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒）；72 °C最终延伸5分钟；4 °C保存。 
	注意：尽管该16S rRNA基因扩增方法适用于多种类型的生物样本，但在启动新项目时建议优化并标准化扩增循环次数。</li>
	<li>通过将1 μL DNA样品加载至高灵敏度电泳芯片上，确认PCR1产物的大小。或者，可将5 µL 16S rRNA扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以确认PCR1产物长度为550 bp。 
	注意：16S rRNA扩增产物的纯化为可选步骤，取决于所使用的DNA提取试剂盒或方法。若采用实验室自建的DNA提取方法，可按照制造商说明书使用微生物组DNA纯化试剂盒对PCR1产物进行纯化（参见材料表）。本实验所用DNA提取试剂盒可获得超纯DNA，无需对PCR1产物进行额外纯化。</li>
</ol>
4. 使用带索引的PCR（PCR2）构建DNA文库
<ol>
	<li>将Index 1和Index 2条形码引物放入用于96个文库的专用支架中（参见材料表）。
	<ol>
		<li>将Index 1引物按列1–12排列，Index 2引物按行A–H排列于专用支架中。</li>
		<li>使用多通道移液器，在列1–12中加入2.5 μL Index 1，在行A–H中加入2.5 μL Index 2引物。将新盖子（参见材料表）盖在Index 1和Index 2接头引物管上，并储存于-20 °C冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用多通道移液器，向每个孔中加入12.5 μL含有缓冲液及dNTPs的2x高保真聚合酶酶混合液（参见材料表）、5 μL PCR级水以及2.5 μL 16S rRNA扩增产物。 
	注意：如需在单次运行中对超过96个文库进行多重测序，请为每个样本添加唯一的索引，具体方法见Kiernan等27所述。本方案按照16S宏基因组测序方法（如Illumina）中的制造商说明，使用商业试剂盒（例如Nextera XT Index Kit）提供的接头。</li>
	<li>密封 Indexed PCR 板，在20 °C下以1,000 xg离心1分钟，然后在PCR仪中进行扩增，程序设置如下：95 °C预变性3分钟；8个循环（95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸30秒）；最后72 °C延伸5分钟。</li>
	<li>通过将1 μL DNA上样至高灵敏度电泳芯片，确认Indexed PCR产物的大小为630碱基对。或者，可将5 µL Indexed PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以确认产物的大小和条带强度。</li>
</ol>
5. 纯化带索引的PCR产物（PCR2）并进行定量
<ol>
	<li>使用多通道移液器，从每个孔中汇集 5 μL PCR2 扩增产物，加入到一个无可见 DNase、RNase、人源 DNA 和致热原细菌污染的多通道储液槽中（参见 材料表）。</li>
	<li>将汇集后的产物从多通道储液槽转移至一个预先标记的空 1.5 mL 微量离心管中，并涡旋混匀。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用标准磁珠试剂盒对 PCR2 产物进行纯化（参见材料表）。如需后续使用，将剩余的 20 μL PCR2 产物密封后保存于原板中，置于 -80 °C 保存。</li>
	<li>通过将 4 mL 100% 乙醇与 1 mL PCR 级水混合，新鲜配制 80% 乙醇。</li>
	<li>将磁珠平衡至室温，并涡旋 30 秒以使磁珠均匀分散。</li>
	<li>短暂涡旋并离心汇集的 PCR2 扩增产物样品。</li>
	<li>在预先标记的无菌 1.5 mL 微量离心管中，加入 80 μL 磁珠和 80 μL 汇集的 PCR 产物，然后短暂涡旋并离心，使磁珠均匀重悬。</li>
	<li>在室温下静置孵育 15 分钟，避免扰动管内内容物。</li>
	<li>将含有 DNA 和磁珠的离心管置于磁力架上（参见材料表），静置 5 分钟。</li>
	<li>小心移除并弃去 150 μL 上清液。</li>
	<li>在不扰动磁珠的前提下，加入 200 μL 新鲜配制的 80% 乙醇，孵育 30 秒。</li>
	<li>小心移除并弃去全部上清液。</li>
	<li>重复步骤 5.11–5.12。使用 P10 移液器吸除残留液体。将磁珠在磁力架上保持原位，室温晾干 15 分钟。</li>
	<li>从磁力架上取下离心管，加入 33 μL 洗脱缓冲液（可使用 DNA 提取试剂盒中的洗脱缓冲液）。充分涡旋混匀，并短暂离心以去除管壁残留液体。孵育 2 分钟后，再次置于磁力架上静置 5 分钟。</li>
	<li>将 30 μL 上清液（纯化的 PCR 产物）转移至预先标记的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>使用荧光计或高灵敏度电泳芯片上样 1 μL 纯化后的文库，对纯化产物进行定量，该步骤在测序前必需完成。随后按以下说明进行 MiSeq 测序。</li>
</ol>
6. MiSeq 测序
<ol>
	<li>创建一个包含宏基因组学工作流程和 MiSeq 仪器上样本特异性条形码信息的样本表（参见材料表）。将此样本表上传至软件（例如 Illumina 实验管理器）。</li>
	<li>将步骤 5.15 中合并的文库稀释至 4 nM。</li>
	<li>通过在 1.5 mL 微离心管中将 5 μL 的 4 nM 文库混合液与 5 μL 新鲜配制的 0.2 M NaOH 混合来变性合并文库。短暂涡旋混匀，短暂离心，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入 990 μL 冰上预冷的杂交缓冲液（HB 缓冲液），轻轻吹打混匀。此操作将得到 20 pM 的文库。</li>
	<li>将 2 μL 的 10 nM 对照文库与 3 μL EBT 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8.5，含 0.1% Tween 20）混合，得到 4 nM 的对照文库。加入 5 µL 新鲜配制的 0.2 N NaOH，短暂涡旋混匀，在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入 990 μL 冰上预冷的杂交缓冲液（HB 缓冲液），轻轻吹打混匀。此操作将得到 20 pM 的对照文库。 
	注意：变性后的 20 pM 对照文库可在 -20 °C 下保存最多 4 周。超过 4 周后，簇数量往往会下降。
	<ol>
		<li>将 210 µL 的 20 pM 文库与 40 µL 的 20 pM 对照文库（终浓度 ≈ 18%）混合，并加入 350 µL HB 缓冲液。以 7 pM 的终浓度上样。 
		注意：输入参数应根据运行表现进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样本在 96 °C 下孵育 2 分钟，然后置于冰上 5 分钟。将 600 µL 最终混合文库加入 MiSeq 芯片的相应孔中。 
	注意：上述第 6 节操作可在基因组/DNA 核心设施中进行。</li>
</ol>
7. 数据处理与序列分析
<ol>
	<li>使用 R 软件（版本 3.5）进行 DADA2 数据处理与分析。对于步骤 7.1–7.4，请按照先前开发的 DADA2 在线教程中所述的开源软件操作，教程地址为 &#60;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html&#62;。 
	注意：已附上一个可直接使用的 R 脚本作为 补充文件 2，用户必须更改测序文件的名称和来源（例如 SAMPLENAME_R1_001.fastq 和 SAMPLENAME_R2_001.fastq）。</li>
	<li>使用 plotQualityProfile 命令可视化正向和反向读段的质量谱图。</li>
	<li>根据质量图对正向和反向读段进行核苷酸截断。这些参数由 DADA2 中的 truncLen 参数指定。 
	注意：此处将 280 用作正向读段的长度阈值，超过该阈值的读段将被丢弃；将 260 用作反向读段的长度阈值，超过该阈值的读段将被丢弃。</li>
	<li>按照在线教程（地址为 &#60;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html&#62;）中所述的 DADA2 流程，将原始 16S 数据（fastq 文件格式）进行处理，以合并 R1 和 R2 读段并生成扩增子序列变体（ASVs），然后利用 Silva 参考数据库对 ASVs 进行物种分类23。 
	注意：已将 DADA2 流程生成的一个示例扩增子序列变体表作为 补充文件 3 提供。可使用 Greengene 或 Silva 参考数据库，因为使用这两种数据库在细菌分类上未发现显著差异。</li>
	<li>生成一个包含各样本元数据（即基因型、性别、处理方式等）的用户自定义映射文件。一个示例元数据文件已作为 补充文件 4 提供。</li>
	<li>根据稀释后的 OTU 计数，使用 Phyloseq28 计算 alpha 多样性（Shannon 指数）和基于主坐标分析（PCA）的 beta 多样性，具体步骤详见在线教程（地址为 &#60;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html&#62;）。</li>
	<li>在 METAGENassist29 中执行以下分析。 
	注意：在属水平上使用 Wilcoxon 秩和检验进行差异丰度分析。使用 METAGENassist29（一个公开可用的基于网页的分析流程）生成热图并高亮显示差异丰度的分类群。
	<ol>
		<li>上传分类丰度表（CSV 格式），并选择 样本在列中。</li>
		<li>上传映射文件（CSV 格式），并选择 样本在行中。</li>
		<li>选择 去除变量的选项，排除缺失值超过 50% 的变量，并排除未分配和未比对的读段。</li>
		<li>选择 按行总和标准化并按列进行对数标准化 的选项。</li>
		<li>在左侧栏中点击 火山图、PCA 或 PLSDA 以生成相应图形，并点击 移除样本名称 以生成图表。</li>
		<li>若仅有两组，执行 t 检验；若组数大于两组，执行 ANOVA，以可视化不同组间存在差异的特征（细菌）。点击 选定特征 可查看组间差异显著的具体细菌。</li>
		<li>点击 树状图 或 热图 以生成相应图表。还可进行其他分析，例如按组别可视化样本，或基于 t 检验/ANOVA 的前 25 个显著特征分析。</li>
		<li>点击 RandomForest 生成可用于分类的特征图。点击顶部的 方差 标签，生成组间/组内差异最大的前若干特征的图表。点击 特征详情 可查看在各组间存在差异的细菌列表，并点击每个细菌以生成其图形化摘要。</li>
		<li>点击顶部的 离群值 标签，以可视化异常样本。</li>
		<li>最后，点击 下载，选择 1) 包含所有分析结果的压缩文件，或 2) 所需的特定结果进行下载。该文件应另存为唯一名称，并在使用前解压。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：有关微生物组分析过程中执行的详细统计检验，请参见 Chen 等人和 Hugerth 等人的研究14,30。

A. M. 作为一项声称使用Prevotella histicola治疗自身免疫性疾病技术的发明人之一，从梅奥诊所（由Evelo Biosciences支付）获得了专利使用费。

本方案描述的实验流程简单，通过16S rRNA宏基因组测序技术，可对大量感兴趣的生物样本进行微生物组分析，步骤清晰易行。新一代测序技术已彻底改变了微生物生态学研究，尤其在人类及临床前疾病模型中应用广泛31,32。该技术的主要优势在于能够以高通量、低成本的方式，成功分析特定生物样本中复杂的微生物组成（包括可培养和不可培养的微生物）32。然而，若干因素（如批次效应、16S rRNA基因引物的选择以及测序数据分析）仍是该技术广泛应用的主要障碍。
基于16S rRNA的高级MiSeq测序技术（2×300 bp）33能够对细菌长达1,500个核苷酸的16S rRNA基因中的约600个核苷酸进行测序，从而克服了早期测序读长较短的技术瓶颈。可使用针对rRNA不同区域（如V1–V2、V3–V5或V6–V9）的特异性引物，但每种区域特异性引物在特定分类群的检测中均表现出一定程度的偏倚，即可...

微生物群是指生活在特定环境中的微生物（包括细菌、病毒、古菌、噬菌体和真菌）的集合，而微生物组则指这些定植微生物的集体基因组。由于细菌在人类和小鼠体内是最丰富的微生物之一，本研究仅聚焦于细菌群落的分析。人类肠道中定植着数万亿的细菌，包含数百种不同的菌株1。正常的肠道微生物群通过调节多种功能（如维持完整的肠道屏障、食物代谢、能量稳态、抑制病原体定植以及免疫应答的调控）在宿主健康状态的维持中发挥着至关重要的作用2,3,4,5。肠道微生物群组成的改变（即肠道菌群失调）已被证实与多种人类疾病相关，包括胃肠道疾病6、肥胖7,8、中风9、癌症10、糖尿病8,11、类风湿性关节炎12、过敏13，以及中枢神经系统相关疾病，如多发性硬化症（MS）14,15和阿尔茨海默病（AD）8,16。因此，近年来人们对用于鉴定不同身体部位细菌组成的技术工具产生了日益增长的兴趣。一种可靠的方法应具备高通量、操作简便、能够高分辨率地分类细菌微生物群，并且成本较低等特点。
基于培养的微生物学技术由于多种肠道细菌无法在培养条件下生长，因而难以足够灵敏地识别和表征复杂的肠道微生物组。基于测序的技术，尤其是基于16S rRNA的宏基因组测序技术的出现，已克服了其中部分挑战，并推动了微生物组研究的变革17。先进的基于16S rRNA的测序技术有助于确立肠道微生物组在人类健康中的关键作用。人类微生物组计划（美国国立卫生研究院发起的项目）18 和MetaHIT项目（欧洲发起的项目）19 均为微生物组分析建立了基本框架。这些项目推动了大量研究的开展，以明确肠道微生物组在人类健康与疾病中的作用。
许多研究团队已在炎症性疾病患者中观察到肠道菌群失调12,14,15,20,21,22。尽管16S rRNA扩增子测序因具备多重分析能力和低成本而被广泛用于分类学分析，但目前尚无统一的基于16S rRNA的分类学分析流程。另一项局限性在于分类学注释的分辨率较低，这主要是由于测序读长远短（150 bp或250 bp），且通常仅使用正向测序读段（R1），而反向测序读段（R2）因质量较低而被弃用。然而，测序技术的进步已帮助克服了其中部分挑战，例如，目前可利用双端测序（如Illumina MiSeq 2×300 bp）获得更长的读长。
目前的测序技术能够获得600 bp高质量的读长，从而实现R1和R2读长的合并。这些合并后更长的R1和R2读长有助于实现更精确的分类学注释，尤其是结合基于R语言的开放获取平台Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2（DADA2）。DADA2采用扩增子序列变体（amplicon sequence variant, ASV）进行注释，而非QIIME23常用的基于97%相似性的操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）注释方法。ASV匹配可在数据库中实现1–2个核苷酸范围内的精确序列匹配，从而实现属和种水平的分类注释。因此，更长且高质量的双端测序读长与更优的分类学注释工具（如DADA2）相结合，已显著推动了微生物组研究的发展。
本文提供了一种利用16S rRNA基因V3–V4区的两步扩增及DADA2、Phyloseq和METAGENassist分析流程进行细菌群落分析的逐步操作指南。本研究使用人类白细胞抗原（HLA）II类分子转基因小鼠，因为某些HLA II类等位基因与多发性硬化症（MS）等自身免疫性疾病的易感性相关20,24,25。然而，HLA II类基因在调控肠道微生物群组成中的作用尚不清楚。我们假设HLA II类分子将通过选择特定细菌来影响肠道微生物群落。为阐明HLA II类分子在塑造肠道微生物群中的重要性，本研究采用了主要组织相容性复合体（MHC）II类基因敲除小鼠（AE.KO）或表达人HLA-DQ8分子的小鼠（HLA-DQ8）24,25,26。我们认为，这一结合R语言数据分析的完整且简化的操作流程，将为致力于微生物组谱型研究的研究人员提供一个优秀的工具。
此前已有文献描述过缺乏内源性小鼠MHC II类基因（AE.KO）以及带有C57BL/6J背景的AE-/-.HLA-DQA1*0103、DQB1*0302（HLA-DQ8）转基因小鼠的构建方法26。从小鼠（雌雄均有，8–12周龄）收集粪便样本。这些小鼠此前均在中国台湾大学动物实验中心按照美国国立卫生研究院（NIH）及机构指南进行繁育和饲养。为准确分析肠道微生物组，必须采取严格的污染控制措施，例如在层流柜内对小鼠进行断奶操作、在处理不同品系小鼠之间更换手套，以及对小鼠进行规范化的饲养管理。
在整个实验过程中，强烈建议佩戴适当的个人防护装备（PPE）。在进行DNA提取、PCR1和PCR2扩增以及测序步骤时，应设置相应的阴性对照。建议使用无菌、无DNase、无RNase且无热原的耗材。整个实验方案中应使用专用于微生物组研究的移液器及带滤芯的移液器吸头。微生物群分析包括七个步骤：1）粪便样本的采集与处理；2）DNA提取；3）16S rRNA基因扩增；4）利用带索引的PCR构建DNA文库；5）带索引的PCR产物（文库）纯化与定量；6）MiSeq测序；以及7）数据处理与序列分析。所有实验步骤的示意图见图1。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 天然微量离心管</td><td>USA, Scientific</td><td>1615-5500</td><td>粪便样本采集</td></tr><tr><td>3M 手持式涂布器刮刀 PA1-G</td><td>3M, MN, US</td><td>7100038651</td><td>用于 PCR 板的正确密封</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>A63880</td><td>PCR 纯化、NGS 清洁、PCR 清洁</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 试剂</td><td>Agilent Technologies, CA, USA</td><td>5067-1504</td><td>DNA 定量与质量控制</td></tr><tr><td>Bioanalyzer DNA 1000 芯片</td><td>Agilent Technologies, CA, USA</td><td>5067-1504</td><td>DNA 定量与质量控制</td></tr><tr><td>Index Adapter 替换盖</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>15026762</td><td>Index 1 和 Index 2 adapter 引物的新盖</td></tr><tr><td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil 试剂盒</td><td>MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA</td><td>12855-100</td><td>DNA 提取</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)</td><td>Kapa Biosystem, MA, USA</td><td>KK2602</td><td>用于扩增子 PCR1 和加索引 PCR2 的 PCR 预混液</td></tr><tr><td>Lewis 分隔盒</td><td>Lewis Bins, WI, US</td><td>ND03080</td><td>粪便样本采集</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>New England BioLabs, MA, USA</td><td>S1509S</td><td>用于 PCR 清洁</td></tr><tr><td>MicroAmp 快速光学 96 孔反应板</td><td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>4346906</td><td>PCR 板</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性封膜</td><td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>4311971</td><td>PCR 板封膜</td></tr><tr><td>Microfuge 20 离心机</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>B30154</td><td>用于 DNA 提取的离心机</td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒（600 个循环）v.3</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>MS-102-3003</td><td>用于 MiSeq 测序</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>FC-131-1001</td><td>16S rRNA DNA 文库制备</td></tr><tr><td>多通道加样槽试剂储液槽</td><td>ASI, FL, USA</td><td>RS71-1</td><td>用于 PCR2 产物的混合</td></tr><tr><td>板式离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>75004393</td><td>用于 PCR 试剂混合及去除板中气泡</td></tr><tr><td>PhiX 控制品</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>FC-110-3001</td><td>用于 MiSeq 测序对照</td></tr><tr><td>微生物组 DNA 纯化试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>A29789</td><td>用于 PCR1 产物的纯化</td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 均质器</td><td>Omni International, GA, USA</td><td>19-001</td><td>用于 DNA 提取的珠磨破碎仪</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS（高灵敏度）检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>Q32854</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>TruSeq 索引板固定装置</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>FC-130-1005</td><td>用于排列索引引物</td></tr><tr><td>垂直分隔板（大号）</td><td>Lewis Bins, WI, US</td><td>DV-2280</td><td>粪便样本采集</td></tr><tr><td>垂直分隔板（小号）</td><td>Lewis Bins, WI, US</td><td>DV-1780</td><td>粪便样本采集</td></tr></tbody></table>

利用两步pcr和下一代16s rrna基因测序进行微生物群分析

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

人体肠道中定植着数以万亿计的细菌，这些细菌支持多种生理功能，例如食物代谢、能量获取以及免疫系统的调节。已有研究提示，健康肠道微生物组的紊乱可能在包括多发性硬化症（MS）在内的炎症性疾病的发生发展中发挥作用。环境和遗传因素均可影响微生物组的组成；因此，识别与疾病表型相关的微生物群落已成为定义微生物组在健康与疾病中作用的第一步。利用16S rRNA宏基因组测序对细菌群落进行分析，已推动了微生物组研究的发展。尽管该方法被广泛使用，但目前尚无统一的基于16S rRNA的分类学分析流程。另一个局限性是由于技术难题（如测序读长远短、反向（R2）读长质量较低导致最终分析中仅使用正向（R1）读长）所导致的分类学注释分辨率较低。因此，亟需一种操作简便且分辨率高的方法，以准确表征特定生物样本中的细菌多样性。测序技术的进步，特别是能够以高分辨率生成更长读长的能力，已在一定程度上克服了这些挑战。当前的测序技术结合公开可用的宏基因组分析流程（例如基于R语言的分裂扩增子去噪算法DADA2），已显著提升了微生物群落分析的分辨率，因为DADA2能够将序列精确注释到属和种水平。本文介绍了一种通过两步扩增16S rRNA基因V3-V4区进行细菌群落分析的操作指南，并结合免费可用的分析工具（如DADA2、Phyloseq和METAGENassist）进行后续数据分析。本研究认为，这一简单而完整的分析流程将为致力于开展微生物组分析研究的科研人员提供一个优秀的技术工具。

由于MHC II类分子（人类中为HLA）在适应性免疫应答中起核心作用，并且与多发性硬化症（MS）的易感性密切相关24,25,26，因此推测HLA II类分子可能影响肠道微生物的组成。为此，本研究利用了缺乏MHC II类基因的小鼠（AE.KO）以及表达人类HLA-DQ8基因的小鼠（HLA-DQ8），以探究HLA II类分子在塑造肠道微生物群落中的重要性。
从 AE.KO（n = 16）和 HLA-DQ8（n = 12）转基因小鼠收集粪便样本，提取细菌 DNA，并扩增 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域。通过在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳检测扩增子大小（550 bp）（图 2A，泳道 1–6）。进一步使用高灵敏度电泳芯片上样 1 μL PCR1 产物，对 16S rR...

本文介绍了一种利用16S rRNA宏基因组测序及免费可用工具进行微生物组分析的简化标准操作流程。该方案将有助于刚进入微生物组领域的研究人员，以及需要更新方法以实现更高分辨率细菌谱型分析的研究人员。

利用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

人体肠道定植着数万亿细菌，这些细菌支持多种生理功能，如食物代谢、能量获取以及...

微生物组分析是明确微生物组在健康与疾病中作用的第一步。本文介绍一种从粪便样本中提取高质量细菌DNA、构建文库、进行16S rRNA和宏基因组测序以及微生物组数据分析的简便流程。该方案有助于刚进入微生物组领域的研究人员，以及已在该领域工作的研究人员在其实验室中建立微生物组分析流程。本方案还可扩展应用于其他生物样本（如动物和人类的鼻腔、口腔或皮肤样本）的微生物组分析。珠式分选（bead picking）是最关键的步骤之一，因为所有下游步骤均依赖于高质量的DNA。保存板的正确密封至关重要，因为密封不完全可能导致扩增产物被抑制，从而产生低质量的测序数据。开始操作前，使用70%乙醇对分隔盒进行灭菌。将小鼠放入已灭菌的分隔盒中，使其自然排便，时间最长可达一小时。使用无菌镊子将粪便颗粒收集至预先标记的空的1.5毫升微量离心管中，并将管盖牢固封闭。每次从小鼠收集粪便后，需用70%乙醇对镊子进行灭菌，随后再用杀菌性一次性擦拭巾处理。称取200毫克粪便颗粒放入含有0.1毫升玻璃珠的1.5毫升微量离心管中，将珠管置于珠击式均质仪中，在室温下以每秒4.5米的速度均质45秒。按照试剂盒制造商的说明提取DNA，并将DNA洗脱至1.5毫升微量离心管中。DNA提取完成后，取1微升DNA样品加载至荧光计上，对提取的DNA进行定量。在96孔PCR板中设置16S核糖体RNA基因扩增PCR1反应，反应体系为25微升。使用多通道移液器，向每个反应孔中加入40纳克DNA、13.5微升含缓冲液和dNTPs的2X高保真聚合酶酶混合物，以及正向和反向引物。从顶部到底部沿四个边缘正确密封PCR板，并在20℃下以1000 × g离心

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生物学

使用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

表征微生物群落一直是环境微生物学中的长期目标。新一代测序技术如今能够以极低的成本和工作量，以前所未有的深度对微生物群落进行表征。本文详细介绍了我们使用台式测序仪对细菌16S核糖体RNA基因进行测序的方法。...

16S核糖体RNA基因扩增子的高通量测序

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）与分子技术（16S rRNA...

通过16S rRNA基因测序与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定罕见细菌病原体

我们介绍一种高效、稳定且经济的从拭子中提取核酸的方法，用于通过16S...

高效的核酸提取与16S rRNA基因测序用于细菌群落特征分析

16S rRNA扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。...

探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

通过下一代16S rRNA扩增子测序对蜱微生物组进行表征

本方案详细介绍了尿液细菌培养、测序及从头杂合基因组组装的综合方法。该方法提供了一种可重复的操作流程，用于生成完整的环状基因组序列，有助于研究参与尿路定植、致病机制以及抗菌药物耐药性传播的染色体和染色体外遗传元件。...

杂交 从头 基因组组装结合短读长与长读长测序技术用于构建尿液细菌的完整基因组

基于草甘膦的产品（GBP）是全球最常用的广谱除草剂。本文介绍了从田间实验到生物信息学分析，量化GBP对微生物组影响的一般性指南。...

基于草甘膦产品对微生物组潜在影响的量化分析

本方案提供了一种简单且经济高效的DNA提取方法，用于分析自身免疫性疾病发展过程中小鼠肠道微生物群的变化。...

利用一种简单且经济高效的DNA提取方法分析易感狼疮小鼠肠道微生物群动态变化

使用微阵列进行细菌基因表达分析

学习使用两步PCR和16S rRNA测序技术进行微生物群分析的方法。本方案涵盖粪便样本DNA提取、文库制备及生物信息学分析流程，适用于人类和动物样本，为研究人员建立标准化微生物组分析流程提供详细指导。

利用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

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