利用RNA测序鉴定环状RNA

本方案是通过评估环状RNA文库构建中的多个关键环节（如试剂盒类型、RNase R处理、上样量及其对环状RNA检出效果的影响）而优化形成的。该方案可实现环状RNA的最佳检测，并根据用户需求提供可调节参数的相关数据。在不同类型样本中鉴定环状RNA，将有助于我们更深入理解其表达分布特征，并为阐明这些分子的功能作用奠定基础。

该方法可应用于任何总RNA样本。在开始实验方案之前，必须将RNA样本保持在冰上。在进行制备前，应使用安捷伦生物分析仪（Agilent Bioanalyzer）或 TapeStation 评估RIN和DV200值，并在处理RNA时遵循相应的操作规程。

首先，将总RNA用39微升无RNase的水稀释至4微克，并反复吹打混匀。在另一管中，使用1× RNase R缓冲液将RNase R稀释至工作浓度，即每微升2个单位。取39微升总RNA和5微升10× RNase R反应缓冲液加入1.5毫升反应管中，混匀。

加入6 µL稀释后的RNase R。然后将移液器调整至完全反应体积，通过上下吹打10次混匀溶液。将离心管置于37°C水浴中10分钟，确保整个反应体系完全浸入水浴中。随后将离心管置于冰上，并立即进行RNA纯化与浓缩。

开始之前，将浓缩液与 48 毫升 100% 乙醇混合配制 RNA 洗涤缓冲液，并将纯化柱放入收集管中。准备好后，向经 RNase R 处理的样品中加入两倍体积的 RNA 结合缓冲液，并充分混匀。向混合物中加入 150 微升 100% 乙醇，总体积达到 300 微升，将全部液体转移至纯化柱中，离心 30 秒。

弃去流出液，直接向柱中加入 400 µL RNA 裂解缓冲液，离心 30 秒后弃去流出液。随后向柱中加入 700 µL RNA 洗涤缓冲液，离心 30 秒后弃去流出液。

再加入 400 微升洗涤缓冲液，离心 2 分钟，然后将柱子转移至一个新的无 RNase 的 1.5 毫升离心管中。将移液器枪头置于柱子滤膜正上方，小心地向柱子中直接加入 11 微升无 RNase 水。室温静置 1 分钟，然后离心 1 分钟。

确保1.5毫升离心管中有液体流出，弃去层析柱。纯化的RNA样品可于-80°C保存，或立即用于文库构建。将10 µL纯化的总RNA转移至96孔PCR板中的洁净孔中。

加入5 µL rRNA结合缓冲液，随后加入5 µL rRNA去除混合液，然后轻轻吹打混匀试剂。密封反应板，置于预先设定并预热至68°C的PCR仪中孵育5分钟。孵育结束后，将反应板在室温下静置1分钟。

取下平板的密封膜，向样品中加入 35 微升涡旋混匀的室温 rRNA 去除磁珠。将移液器调整至 45 微升，上下吹打 10 到 20 次以充分混匀。将平板在室温下静置 1 分钟。

将培养板转移至磁力架上，孵育1分钟或直至溶液变澄清。将上清液转移至培养板中的新孔中。然后将培养板从磁力架转移至培养板架上。

涡旋RNA纯化磁珠直至充分分散，向样品中加入99 µL磁珠。用移液器吹打混匀，室温孵育平板10分钟。将平板转移至磁力架上，静置5分钟或直至溶液澄清，然后移除并弃去孔中所有上清液。

保持孔板仍在磁力架上，向孔中加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇，注意不要扰动磁珠。让乙醇在孔中停留 30 秒，然后移除并弃去。向孔中加入 11 µL 洗脱缓冲液，用移液器吹打混匀。

将该孔板在室温下孵育两分钟，然后将其重新转移至磁力架上，并保持至溶液澄清。取8.5 µL上清液转移至同一孔板中的新孔中，并向每个含有样本的孔中加入8.5 µL洗脱液、引物和高片段打断混合液。用移液器上下吹打10次以充分混匀，密封孔板后，在预热至94°C的PCR仪中孵育8分钟。

将样品冷却至四摄氏度，从热循环仪中取出反应板，并短暂离心。

通过比较经RNase R预处理和未经预处理的文库所产生的数据，评估了RNase R预处理的重要性。正如预期，与未经预处理的文库相比，预处理文库中 consistently 鉴定出更多的环状RNA。通过优化输入RNA的量，以检测到更丰富的环状RNA多样性。

使用一、二和四微克输入RNA构建文库，当使用四微克总RNA时，观察到环状RNA物种的多样性最高。采用优化后的方案，比较了来自四名健康供体的五个脑区以及来自六名健康供体的其他组织类型的环状RNA丰度。总体而言，与其它组织类型相比，脑组织中环状RNA的丰度更高。

在处理 RNA 时，务必遵循适当的实验操作规程，包括佩戴手套、在开始实验前使用 RNase 去除剂湿巾或喷雾彻底清洁实验台面和移液器，并在操作前将 RNA 样品置于冰上保存。完成本实验流程后，可进行正交验证，例如对鉴定出的环状 RNA 连接位点进行 Sanger 测序。新环状 RNA 的发现及其存在证据的进一步积累，为探索其生物学功能开辟了全新的研究领域。