在自身免疫糖尿病模型中高效生成抗原特异性原小鼠细胞毒性T细胞细胞细胞，用于功能测试

该协议允许您生成大量功能性抗原特异性T细胞，这是治疗自身免疫性疾病所需的安全方法。该技术的主要优点是，它为您提供了高效的转导过程和大量的功能T细胞。该技术可以推广用于治疗1型糖尿病和其他已知抗原的自身免疫性疾病。

此外，CAR T细胞可能是某些类型的癌症的有希望的治疗方法。此方法可用于生成表达其他 CAR 的免疫细胞。良好的接受技术，阅读整个协议，并提前规划整个实验，是十分重要的。

这两周的协议包括小步骤，成功取决于每个步骤的正确性能。此方法的可视化演示对于学员正确遵循至关重要。准备凤凰细胞转染，如手稿中所述。

将添加和移除介质的侧壁标记，以尽量减少从细胞上吹走，这是一种好的做法。零天从细胞中吸出上一液，用五毫升PBS清洗。小心地将七毫升减少的血清介质滴到板的侧壁上，并将细胞转移回培养箱。

加入1.5毫升的减少血清介质到两个14毫米圆底聚丙烯管。将40微米的转染试剂加入其中一个管中，将15微克的抗体重定向到另一个管中，将5微克的包装质粒添加到另一个管中。在室温下孵育管五分钟，然后将转染试剂加入质粒管。

通过轻轻将溶液上下移液三次混合，并在室温下孵育至少20分钟。将三毫升混合物加入凤凰细胞，并将其放入组织培养箱中。四到五个小时后，向细胞中加入一毫升FCS，并在37摄氏度下过夜培养它们。

第二天，从细胞中去除上一代，加入四毫升的新鲜预谋培养培养。第二天，通过从凤凰细胞中收集含有介质的病毒并过滤它来清除残留的细胞碎片来收获病毒。将重组的人类IL-2库存添加到病毒中，最终浓度为每毫升200国际单位，并立即将其用于转导。

在凤凰细胞中加入四毫升新鲜培养物，并把它们放在孵化器中过夜。第二天重复病毒收集，进行第二次转导并丢弃细胞。在播种木氨酸CD8 T细胞前一天，在24井板的每个井中加入一毫升抗小鼠CD3和CD28抗体的混合物，并在4摄氏度下孵育板过夜。

在第零天，收获小鼠，并把它们放在一个细胞过滤器浸泡在10毫升PBS在冰上细胞培养皿。在细胞培养罩中，将每个脾脏切成三到五块，并使用注射器的无菌柱塞通过铁丝网压入组织。轻轻去除红血球，在一至四个稀释的红细胞解液缓冲液中重新悬浮血细胞，并在室温下孵育五分钟，然后用 Trypan Blue 稀释 10 微升细胞悬浮液，用于细胞计数。

以350倍g离心，在7分钟内对其余细胞进行造粒。使用小鼠CD8 T细胞分离试剂盒来丰富CD8 T细胞，将细胞颗粒悬浮在400微升缓冲液中，每10倍将100微升生物素抗体鸡尾酒悬浮到第八细胞中。将细胞悬浮液混合好，在4摄氏度下孵育5分钟，使抗体结合。

然后在第八细胞中每10次添加300微升标签缓冲液和200微升抗生物素微珠。混合好，在4摄氏度下再孵育10分钟。同时，在分离器上设置分离柱，用三毫升的标记缓冲液清洗。

将 40 微米细胞过滤器放在柱的顶部，通过应变器将一毫升珠子和细胞混合物穿过该过滤器进入分离柱。将流量收集到预冷的 15 毫升管中，然后根据制造商的指示清洗柱，将污水收集到同一管中。数数细胞，并在350次g下离心收集细胞5分钟。

用两毫升的T细胞介质清洗它们，然后再次离心。然后以每毫升25万至50万细胞的浓度重新在预谋的T细胞培养中再增。用一毫升无菌PBS清洗先前准备好的CD3和CD28抗体涂层板三次，并将两毫升的细胞悬浮液添加到每孔中。

使用旋转运动均匀分配细胞。作为一种控制，将相同数量的CD8 T细胞板入板的单一非涂层井中，并在10%的二氧化碳气罐培养箱中孵育37摄氏度的细胞48小时。第一天，在24孔板的井中加入0.5毫升的纤维素片，在4摄氏度的夜间孵化，准备人类纤维素碎片涂层板。

第二天，取出纤维素溶液，每井加入1毫升2%BSA和PBS。在室温下孵育板30分钟，用一毫升无菌PBS清洗处理过的孔。取出洗涤液后，板已准备就绪。

使用 Trypan Blue 计算激活的 CD8 T 单元格。通过离心收集它们。并重新以每毫升500万个活细胞进行转导。

将激活的 CD8 电池悬浮液的 100 微升添加到纤维素涂层板的每个井中。然后添加1.5到两毫升先前准备的含有介质的病毒，并使用旋转运动混合，以均匀分配细胞。将盘子密封在Ziploc袋中，在37摄氏度下以2000次g离心90分钟。

从离心机上取下板，并放在生物安全柜。小心地取出塑料袋，确保板外没有被介质污染。将板转移到37摄氏度的二氧化碳培养箱。

四小时后，从每井中取出一毫升的培养物，用一毫升预谋的完整T细胞介质代替，然后将盘子放回培养箱中。该协议的关键方面是高滴度病毒、健康激活的T细胞和适当的转导方法。细胞与PE大小七结合抗CD8、AF647结合抗CD3和BV 421结合抗CD28共同染色，用于流动细胞测量分析。

大约，70%的CD8 T细胞共同表达GP，表示汽车表达。他们还共同表示CD28和CD3。重要的是，所有测试GP阳性细胞也与 I-Ag7 胰岛素 BR3 三角体共同染色，它表示 CAR 在细胞表面的表达，但不是与控制四分之一剂的表达。

此外，分类测试和控制 CAR T 细胞每个分泌高水平的干扰素伽马，只有在与表达其同源配体的目标细胞共同培养后，确认转导细胞具有针对父抗体目标的 CD8 效应或 T 细胞表型。病毒产生细胞的转导、原发CD8T细胞的分离以及这些T细胞的激活是本实验最重要的步骤。拥有健康的活性T细胞和用适当的试剂转导这些T细胞可确保良好的结果。

此方法可用于换导其他 T 细胞，但必须针对特定 T 单元类型进行自定义。该协议为预防1型糖尿病与抗原特异性嵌合抗原受体T细胞治疗铺平了道路。