Name: 在自身免疫糖尿病模型中高效生成抗原特异性原小鼠细胞毒性T细胞细胞细胞，用于功能测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学习高效转导技术生成抗原特异性CD8 T细胞，用于自身免疫疾病和癌症治疗。该方法可在体外扩增功能性T细胞，为1型糖尿病等自身免疫病及CAR T细胞疗法提供可靠实验方案。

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本研究由JDRF基金（编号1-INO-2015-74-S-B、2-SRA-2016-238-S-B和SRA-2-S-2018-648-S-B）、糖尿病教育与行动奖以及贝勒医学院分子医学Caroline Wiess Law研究基金资助。细胞分选由贝勒医学院细胞计量与细胞分选核心设施完成，经费来自美国国立卫生研究院（NIH）（S10RR024574和P30CA125123）。所有肽-MHC四聚体均由NIH四聚体核心设施提供。

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<li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li>
<li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li>
<li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+%28DELFIA%29+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunoassay+%26+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li>
</ol>

MAb287 及其衍生物受2014年颁发的一项美国专利保护。

本方案描述了一种通过逆转录病毒转导高效生成抗原特异性CD8 CAR-T细胞的方法。本方案的转导效率通常较高，且一般可观察到CAR的稳定表达。扩增后的CAR T细胞保留了亲代活化T细胞的关键特性以及抗体特异性，适用于体外和体内实验。我们已将Ab-CAR CD8 T细胞应用于NOD小鼠1型糖尿病的重编程研究7。
本方案在先前描述的方法基础上进行了多项关键性改进。首先，我们采用了一种优化的T细胞培养基，可实现更长的激活时间。所述完全培养基含有多种关键添加剂的最佳浓度，能显著提高T细胞激活后的存活率和增殖程度。需要注意的是，小鼠IL-2可替代人源蛋白并获得相当的效果，但目前人IL-2更具成本优势。值得注意的是，使用激活40–48小时的T细胞进行转导，其转导效率显著高于仅激活24小时的细胞。
其次，我们采用了一种改进的转导方法，该方法去除了对T细胞有毒性的聚凝胺B（polybrene B），转而使用纤维连接蛋白（fibronectin），从而进一步提高细胞存活率。需要注意的是，为确保良好的...

鉴于抗原特异性免疫疗法（ASI）可能降低非靶向效应的风险，其在治疗如1型糖尿病（T1D）等自身免疫性疾病方面具有广阔前景。越来越多的证据表明，针对（前原）胰岛素的免疫反应在T1D中可能尤为重要1。在过去十年中，包括我们团队在内的多个研究小组的研究结果强烈提示，由特定MHC II类分子呈递的包含胰岛素B链第9至23位氨基酸的表位（B:9-23/MHCII）在小鼠和人类T1D的发生发展中起着重要作用2,3,4,5。为了特异性靶向B:9-23/MHCII复合物，我们开发了一种单克隆抗体mAb287，该抗体不与胰岛素激素本身或其他肽段组成的复合物发生交叉反应6。mAb287可在体外阻断抗原呈递，每周向糖尿病前期NOD小鼠注射mAb287可使35%的治疗小鼠延缓T1D的发生6。为了在体内阻断抗原呈递，通常需要频繁给药以维持较高的循环浓度。我们假设，可利用Ab287的高度特异性来重编程T细胞，从而为T1D提供更优的抗原特异性T细胞治疗策略7。
据报道，细胞毒性T细胞只要识别出其同源配体的单个分子，即可杀伤靶细胞8,9,10。因此，针对B:9-23/MHCII特异性的CD8 T细胞在清除异常抗原呈递方面，预期比亲本抗体具有更高的效率，因为后者通常需要结合同一抗原呈递细胞上的多个复合物才能发挥作用。CAR T细胞已被用于治疗多种人类癌症11,12,13，也可能在自身免疫疾病中具有疗效14。然而，迄今为止，尚无针对致病性肽-MHC复合物特异性的CAR-T细胞被用于干预1型糖尿病（T1D）的疾病进程。通过采用下文所述的优化CD8 T细胞转导技术，我们近期已初步证明该策略确实是一种可行的方法7。
在本实验方案中，我们介绍了一种高效且简化的转导与扩增方法。本方案适用于需要高效生成小鼠CD8 CAR T细胞的其他研究。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（50 mM）</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>50 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>5&amp;rsquo; RACE PCR</td><td>Clontech</td><td>634859</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD28 抗体</td><td>eBioscience</td><td>14-0281-86</td><td>终浓度为 1&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3e 抗体</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>终浓度为 1&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠 IFN-&amp;gamma;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td>工作浓度为 0.5 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素大提纯试剂盒（Endo-free Maxi-Prep kit）</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>终浓度为 50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（FCS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>终浓度为 10% FCS</td></tr><tr><td>HEPES（100X）</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>1X</td></tr><tr><td>IAg7-CLIP 四聚体-BV421</td><td>Emory 大学 NIH 四聚体中心</td><td>按批准提供</td><td>工作浓度为 6 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>IAg7-胰岛素 P8E 四聚体-BV421</td><td>Emory 大学 NIH 四聚体中心</td><td>按批准提供</td><td>工作浓度为 6 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS 100x）</td><td>ThermoFisher</td><td>51500056</td><td>终浓度为 1x</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 分离缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒</td><td>Miletenyi Biotec Inc</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CD8a+ T 细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5000 U/ml）</td><td>ThermoFisher</td><td>15070063</td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td>Phoenix-ECO 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>pMIG II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-GFP II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 IFN-&amp;gamma;</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td>工作浓度为 3 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R7767</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin</td><td>Takara</td><td>T100A</td><td>在 PBS 中工作浓度为 50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>rhIL-2（储存浓度 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; IU/μl）</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>终浓度为 200 IU/ml</td></tr><tr><td>rmIL-7（储存浓度 50 ng/μl）</td><td>R&amp;D</td><td>407-ML-005</td><td>终浓度为 0.5 ng/ml</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Tryple</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr></tbody></table>

用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性t细胞

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

1型糖尿病（T1D）的特征是胰岛特异性自身免疫反应，导致β细胞破坏以及胰岛素分泌的绝对缺失。在自发性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠模型中，胰岛素是主要的自身抗原靶点，通过基因操作去除该动物模型中单个关键的胰岛素表位即可预防疾病发生。因此，选择性清除携带这一致病性表位的专业抗原呈递细胞（APCs），是一种抑制异常胰岛素特异性自身免疫反应的策略，且可能具有更高的转化应用潜力。
嵌合抗原受体（CAR）可引导T细胞选择性地靶向致病性抗原。该技术是近年来利用细胞工程进行过继性细胞治疗以治疗多种癌症的核心方法。在本方案中，我们描述了一种优化的T细胞逆转录病毒（RV）转导及体外扩增方案，该方案可从少量初始T细胞出发，高效生成大量具有功能的抗原特异性CD8+ CAR-T细胞。此前已有多种CAR-T细胞制备方案被报道，但通常存在转导效率相对较低以及转导后细胞存活率不理想的问题。相比之下，本方案可实现高达90%的转导效率，所获得的细胞在体内可存活超过两周，并在单次输注后显著延缓疾病的发生。我们对细胞维持和转导的详细步骤进行了说明，以便关键操作能够被清晰、准确地执行。从原代细胞分离到CAR表达的整个流程可在14天内完成。该通用方法可应用于任何已知靶点的鼠类疾病模型。同样，本方案的具体应用（靶向致病性肽段/MHC II类分子复合物）也可推广至其他已明确关键复合物的自身免疫性疾病模型。

通常，使用本方案的转导效率约为 ~60–90%。如图3所示，在分选前，约70%的CD8 T细胞共表达GFP，同时也共表达CD28和CD3（图3C）。重要的是，所有“实验组”GFP+细胞均与IAg7-B:R3四聚体发生共染色，而不与对照四聚体结合（图4）。类似地，经分选的实验组和对照组CAR-T细胞仅在与表达相应配体的靶细胞共培养后，才分泌高水平的IFN-γ（图5）。这证实了转导后的细胞具有CD8效应T细胞表型，并特异性靶向亲本抗体所识别的抗原。
<img alt="质粒图谱示意图；pMIG-II 载体显示限制性酶切位点及用于克隆的基因连接位点。" class="xfigim...

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8 T细胞并在体外扩增这些细胞的实验方案，旨在获得大量具有功能的T细胞，用于体外和体内实验。

用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

1型糖尿病（T1D）的特征是胰岛特异性自身免疫反应，导致β细胞破坏及胰岛素分泌绝对缺乏。在……

本方案可使您获得大量具有功能性的抗原特异性T细胞，这是治疗自身免疫性疾病的一种理想且安全的方法。该技术的主要优势在于，它能够提供高效的转导过程，并产生大量具有功能性的T细胞。该技术可进一步拓展应用于治疗1型糖尿病及其他已知抗原的自身免疫性疾病。此外，CAR T细胞可能对某些类型的癌症具有良好的治疗前景。该方法可用于生成表达其他CAR的免疫细胞。重要的是要掌握成熟可靠的技术，仔细阅读整个实验方案，并提前规划全部实验流程。该为期两周的实验方案包含多个细分步骤，每一步的正确操作都对最终成功至关重要。本方法的可视化演示对于学习者准确掌握操作流程尤为关键。按照文中所述方法准备Phoenix细胞以进行转染。建议标记培养板侧壁用于添加和移除培养基的位置，以尽量减少吹落细胞。第0天，吸除细胞的上清液，并用5 mL PBS洗涤细胞。沿培养板侧壁小心地逐滴加入7 mL低血清培养基，然后将细胞放回培养箱中继续培养。向两个14毫米圆底聚丙烯管中各加入1.5毫升低血清培养基。向其中一个管中加入40微升转染试剂，向另一个管中加入15微克抗体重定向CAR质粒以及5微克包装质粒。室温孵育5分钟后，将转染试剂加入质粒管中。轻轻吹打溶液三次使其混匀，并在室温下孵育至少20分钟。将3毫升混合液加入Phoenix细胞中，放入组织培养孵箱。4至5小时后，向细胞中加入1毫升FCS，并在37摄氏度下过夜培养。第二天，移除细胞中的上清液，并加入四毫升新鲜预热的培养基。在第二天收集病毒，从 Phoenix 细胞中获取含有病毒的培养基，并通过过滤去除残留的细胞碎片。向病毒液中加入重组人 IL-2 储存液，使其终浓度为每毫升 200 国际单位，并立即用于转导。向Phoenix细胞中加入4毫升新鲜培养基，放入培养箱中过夜。次日重复病毒收集，用于第二次转导，并弃去细胞。在接种小鼠CD8 T细胞前一日，向24孔板的每孔中加入1毫升抗小鼠CD3和CD28抗体的混合物，在4 °C下过夜孵育。在第0天，取小鼠脾脏并置于细胞筛网上，将筛网浸入盛有10毫升PBS的细胞培养皿中，置于冰上。在细胞培养超净台内，将每只脾脏切成3至5块，用无菌注射器活塞将组织压过金属网筛。用1至4倍稀释的红细胞裂解缓冲液重悬脾细胞，以轻柔去除红细胞，在室温下孵育5分钟，然后取10微升细胞悬液与台盼蓝混合进行细胞计数。以350 × g离心7分钟，沉淀其余细胞。使用小鼠CD8 T细胞分离试剂盒富集CD8 T细胞，并将细胞沉淀重悬于400 µL缓冲液中，每1×10⁸个细胞加入100 µL生物素标记抗体混合物。充分混匀细胞悬液，于4 °C孵育5分钟，使抗体结合。 然后每1×10⁸个细胞加入300 µL标记缓冲液和200 µL抗生物素微珠（Anti-Biotin MicroBeads），充分混匀，并在4°C下再孵育10分钟。同时，在分离器上安装分离柱，并用3 mL标记缓冲液冲洗分离柱。将一个40微米的细胞筛置于柱子顶部，将一毫升珠子和细胞的混合物通过细胞筛进入分离柱中。收集流出液至预冷的15毫升离心管中，并根据制造商的说明洗涤柱子，将洗脱液收集到同一管中。计数细胞，并在350 × g离心5分钟以收集细胞。用两毫升T细胞培养基洗涤，并再次离心。随后将细胞重悬于预热的T细胞培养基中，浓度为每毫升250,000至500,000个细胞。用一毫升无菌PBS洗涤预先包被CD3和CD28抗体的培养板，重复三次，然后每孔加入两毫升细胞悬液。采用旋转混匀的方式将细胞均匀接种。作为对照，将相同数量的CD8 T细胞接种至一块未包被的孔板中的单个孔内，并在37°C、含10%二氧化碳的培养箱中培养48小时。第一天，通过向24孔板的孔中加入0.5毫升纤连蛋白片段，于4°C过夜孵育，制备人纤连蛋白片段包被的培养板。第二天，移除纤连蛋白溶液，每孔加入一毫升 2% BSA 和 PBS。室温孵育 30 分钟，用一毫升无菌 PBS 洗涤处理过的孔。移除洗涤液后，该培养板即可使用。使用台盼蓝计数活化的CD8 T细胞。通过离心收集细胞，并重悬于每毫升含五百万个活细胞的培养液中，用于转导。向纤维连接蛋白包被板的每孔中加入100微升活化的CD8细胞悬液。然后加入1.5至2毫升预先制备的含病毒培养基，通过轻轻旋转混匀，使细胞均匀分布。将培养板密封于Ziploc袋中，在37摄氏度下以2,000 × g离心90分钟。从离心机中取出培养板并转移至生物安全柜中。小心移除塑料袋，并确保培养板外部未被培养基污染。将培养板转移至37摄氏度的二氧化碳培养箱中。四小时后，从每个孔中移除一毫升培养基，加入一毫升预热的完全T细胞培养基，并将培养板放回培养箱中。本实验方案的关键要点包括高滴度病毒、健康的活化T细胞以及适当的转导方法。细胞经PE标记的七号偶联抗CD8抗体、AF647偶联抗CD3抗体以及BV 421偶联抗CD28抗体共同染色，用于流式细胞术分析。大约 70% 的 CD8 T 细胞共表达 GFP，表明 CAR 的表达。这些细胞同时也共表达 CD28 和 CD3。重要的是，所有检测中 GFP 阳性的细胞均与 I-Ag7 胰岛素 BR3 四聚体染色呈阳性，表明 CAR 在细胞表面表达，而与对照四聚体则无染色。 此外，分选后的实验组和对照组CAR T细胞仅在与表达相应配体的靶细胞共培养后，才分泌高水平的干扰素γ，这证实了转导细胞具有针对亲本抗体靶标的CD8效应T细胞表型。病毒产生细胞的转导、原代CD8 T细胞的分离以及这些T细胞的活化是本实验最重要的步骤。获得健康的活化T细胞，并使用适当的试剂对这些T细胞进行转导，是确保实验成功的关键。该方法也可用于转导其他T细胞，但必须针对特定的T细胞类型进行优化。本方案为利用抗原特异性嵌合抗原受体T细胞疗法预防1型糖尿病奠定了基础。

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免疫学与感染

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